利用同源重组技术构建Hoxa5、BMP6真核表达载体及共转染成纤维细胞表达

旨在利用同源重组构建敖汉细毛羊Hoxa5、BMP6基因表达载体及共转染成纤维细胞后通过基因表达量变化研究两基因之间的相互作用关系。以敖汉细毛羊为研究对象,采集30日龄的胎羊。首先,通过RNA的提取反转录成cDNA参照GenBank中Hoxa5、BMP6基因序列和pcDNA3.1序列分别设计1对含有同源臂的引物,通过PCR反应扩增获得Hoxa5、BMP6基因片段、利用SoSo试剂盒将目的片段连接到pcDNA3.1真核表达载体上。鉴定构建pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMP6重组表达载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;其次对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的质粒pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMP6共转染至成纤维细胞,采用RT-PCR技术和Western Blot技术检测Hoxa5、BMP6基因单转染和共转染在成纤维细胞中表达量的变化。结果显示:经酶切、测序鉴定质粒pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMP6构建成功,并且共转染成纤维细胞Hoxa5基因的表达量极显著下降,BMP6基因的表达量极显著升高且共转染组的表达量极显著地高于单转染组(P0.01)。利用同源重组技术成功构建了敖汉细毛羊Hoxa5、BMP6基因的表达载体,并且成功共转染成纤维细胞,BMP6基因的表达量升高,Hoxa5基因的表达量极显著下降,因而初步推断基因BMP6抑制了Hoxa5基因的表达,相反地Hoxa5基因促进了BMP6基因的表达,结果可为进一步研究其功能奠定基础。     

敖汉细毛羊BMP4基因质粒的构建及在成纤维细胞中表达量的研究

旨在构建敖汉细毛羊BMP4基因的质粒及转染成纤维细胞后研究基因表达量的变化。以30日龄的敖汉细毛羊胚胎为研究对象。首先,通过RNA的提取反转录成cDNA参照GenBank中BMP4基因序列信息设计1对引物,通过PCR反应扩增获得BMP4基因片段、将得到的BMP4基因连接到pEASYTM-T1载体,构建pEASYTM-T1-BMP4重组质粒并转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建pcDNA3.1-BMP4重组质粒,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞;其次对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将重组pcDNA3.1-BMP4表达载体转染成纤维细胞,后检测BMP4基因在mRNA和蛋白水平上表达量的变化。结果显示:pcDNA3.1-BMP4构建成功后转染成纤维细胞BMP4基因的mRNA和蛋白表达量均显著上升,且转染组的表达量极显著地高于对照组(P0.01)。成功构建了敖汉细毛羊BMP4基因的质粒,并且成功转染成纤维细胞,基因在细胞中过表达,结果可为进一步研究其功能奠定基础。     

利用同源重组技术构建DKK1、BMP4真核表达载体及共转染成纤维细胞表达的研究

为了构建敖汉细毛羊DKK1、BMP4基因真核表达载体及单、共转染成纤维细胞后研究两基因表达量之间的变化,以敖汉细毛羊为研究对象,采集40日龄的胎羊。首先,通过RNA的提取反转录成c DNA参照Gen Bank中DKK1、BMP4基因序列信息分别设计1对含有同源臂的引物,通过PCR反应扩增获得DKK1、BMP4基因片段、利用So So试剂盒将目的片段连接到pcDNA3. 1真核表达载体上。鉴定正确后的pcDNA3. 1-DKK1、pcDNA3. 1-BMP4重组质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;其次对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的pcDNA3. 1-DKK1、pcDNA3. 1-BMP4单、共转染成纤维细胞,利用荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测DKK1、BMP4基因单转染和共转染在成纤维细胞中表达量的变化。结果显示,经酶切、测序鉴定pcDNA3. 1-DKK1、pcDNA3. 1-BMP4构建成功,成纤维细胞原代、传代培养良好,转染后细胞生长良好,经实时荧光定量PCR技术和Western Blot检测DKK1基因共转染成纤维细胞较单转染的表达量极显著下降(P 0. 01),BMP4基因的共转染较单转染表达量没有发生明显变化。成功构建了敖汉细毛羊DKK1、BMP4基因的真核表达载体,并且成功共转染成纤维细胞,DKK1基因的表达量明显下降,BMP4基因的表达量没发生明显变化,因而,推断BMP4基因抑制了DKK1基因的表达,DKK1基因对BMP4基因作用不明显,结果可为进一步研究其功能奠定基础。     

O型口蹄疫病毒蛋白酶3C基因在哺乳细胞中的表达

为构建O型口蹄疫病毒(FMDV)蛋白酶3C基因的真核表达质粒,并在BHK-21细胞中进行表达,以RT-PCR扩增O型口蹄疫病毒蛋白酶3C基因,利用XhoⅠ和HindⅢ限制性内切酶将3C基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-),通过脂质体法转染重组质粒pcDNA3.1(-)-3C。PCR,双酶切鉴定及测序结果表明：重组质粒pcDNA3.1(-)-3C构建成功;Western-blot分析结果表明：重组质粒pcDNA3.1(-)-3C在BHK-21细胞中能够表达O型FMDV蛋白酶3C基因。该真核表达质粒的构建,为进一步研究O型口蹄疫空衣壳的体外组装以及O型口蹄疫空衣壳疫苗的开发建立了实验基础。     

犬SLAM基因真核表达载体的构建及Vero细胞系转染的研究

为了研究犬瘟热病毒细胞受体SLAM基因的特性和功能。将基因SLAM克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建真核表达载体pCDNA3.1/SLAM,重组质粒纯化后应用脂质体2000转染到Vero细胞中,通过RT-PCR和免疫印迹方法检测犬SLAM基因在Vero细胞中的转录和表达情况。结果表明：成功构建了表达SLAM基因的真核表达载体,RT-PCR和免疫印迹显示SLAM基因获得表达;pcDNA3.1/SLAM载体的构建为研究犬SLAM基因在Vero细胞中的稳定表达奠定了基础。     

合作猪HMOX1基因过表达载体构建及组织表达分析

为了构建合作猪HMOX1基因过表达载体,并分析其组织表达特征,本研究通过PCR扩增获取合作猪HMOX1基因完整CDS区序列,将其插入到pcDNA3.1(+)过表达载体中,构建pcDNA3.1-HMOX1过表达载体;并通过实时荧光定量PCR检测HMOX1基因在合作猪心、肝、脾、肺、肾、胃、十二指肠和背最长肌中的表达情况。结果显示,成功扩增出合作猪HMOX1基因924 bp的完整CDS区,通过双酶切和测序鉴定,HMOX1基因成功连接到pcDNA3.1(+)过表达载体中。组织表达结果显示,HMOX1基因在合作猪组织中表达量最高是脾脏,显著高于其它组织(P<0.05),其次是肝脏、肺脏、肾脏和心脏,在十二指肠中的表达量最低。研究结果为进一步研究HMOX1基因在合作猪高海拔低氧适应过程中的功能提供了重要参考。     

人源白细胞介素(h-IL2)基因克隆及原核表达的研究

构建人源白介素(h-IL2)基因的表达载体,并尝试在原核细胞中诱导表达,以用于进一步重组蛋白纯化和抗体生产.以h-IL2基因为模板,采用PCR技术扩增h-IL2基因,连接到pMD-18T载体中构建克隆载体,转化到感受态DH5α,提取质粒PCR、双酶切验证连接成功,经DNA测序鉴定基因序列与GenBank数据库收录h-I...     

片球菌素基因的克隆及表达

从乳酸片球菌中提取质粒DNA作为模板,根据GeneBank公布的细菌素结构基因,设计一对特异性引物,进行PCR扩增片段,将该片段定向克隆到pTA2载体,测序,与发表的基因序列比较,同源性为100%,然后克隆到表达载体Pet-28a,转化到Escherichia coli DH5α,经过卡那霉素平皿筛选,质粒酶切,PCR两步验证,获得阳性重组质粒,并转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,以异丙基硫代-βD-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Tricine-SDS-PAGE电泳,显示在4 600 Da处出现条带,与已报道的细菌素分子量大小符合.表达产物对单核细胞增多症李氏杆菌有抗菌作用.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆及杆状病毒表达载体的构建

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒已知序列(ch-1a,AY032626)设计包含完整ORF5序列的1对引物,采用RT-PCR方法扩增PRRSV甘肃LZH株的ORF5基因,将其克隆到杆状病毒载体pFastBacHTA上,经酶切鉴定、PCR鉴定筛选出阳性重组转移载体pFastBacHTA-ORF5,并对阳性质粒进行测序及序列分析;将pFastBacHTA-ORF5转化到DH10Bac感受态细胞中,与Bacmid发生位点特异性转座作用,获得重组转座子rBacmid-ORF5;并成功构建了PRRSV LZH株ORF5基因的杆状病毒载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础.     

DNA免疫法制备猪圆环病毒2型ORF3抗体

为了制备猪圆环病毒2型(PCV2)开放阅读框3(ORF3)蛋白的抗体,并为ORF3功能研究奠定基础,用PCR方法扩增PCV2 ORF3基因,对其PCR产物用EcoR I与Xho I进行酶切,并对真核表达载体pCDNA3.1(+)进行同样酶切,连接2种目的酶切产物后转化E.coli DH5?感受态,菌落PCR和序列测定结果显示成功构建出重组质粒pCDNA3.1-PCV2 ORF3。将该重组质粒接种BALB/c小鼠,用间接免疫荧光(IFA)检测小鼠血清PCV2 ORF3抗体的特异性及其效价。IFA结果证实经PCV2 ORF3重组质粒接种所制备的小鼠血清是PCV2 ORF3的特异性抗体,小鼠血清PCV2 ORF3抗体效价在经过4次接种后均达到1:25以上,表明,成功制备了具有较高效价的PCV2 ORF3抗体。研究结果提示,可以通过质粒DNA免疫方法来快速、简便地制备PCV2 ORF3抗体,为PCV2 ORF3抗体制备提供了一种新的有效途径。     

山丁子CBF1基因表达载体的构建

CBF1转录因子能调控一组抗干旱、抗低温基因的表达,更有效地提高植物抗干旱、抗低温的能力。以抗寒性较强的长白山野生山丁子(耐-42℃低温)为材料,通过RT-PCR扩增出山丁子CBF1基因,随后亚克隆到pMD18-T载体,序列分析表明与基因数据库中山丁子CBF1对应区域相似性为100%,将该片段亚克隆到原核表达载体pBI121中构建原核表达质粒,转化大肠杆菌E.coli DH5α,在AMP抗性的LB平板上挑取重组质粒,进行PCR并测序结果与预期一致。     

猪FcγRⅢ和γ链共转染Marc-145细胞系的建立

为了建立稳定表达猪FcγRⅢ (Porcine Fc gamma receptor Ⅲ,poFcγRⅢ )的Marc-145细胞系,从PAM细胞中提取总RNA,应用RT-PCR技术获得猪FcγRⅢ和γ链的cDNA,并构建PIREShyg3-γ和pcDNA3.1- FcγRⅢ真核表达质粒;用脂质体共转染Marc-145细...     

鸡 CVH启动子调控的绿色荧光蛋白报告载体的构建及鉴定

探索建立一种用绿色荧光蛋白对鸡原始生殖细胞进行标记分离的方法。本研究克隆并测序鸡原始生殖细胞特异表达基因CVH1.6Kb启动子序列。序列分析表明它含有类似于TATA box和CAAT box的元件,在其远端上游区域还有多个GC富含区。将CVH基因启动子亚克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-1的多克隆位点,成功构建表达载体pCVH-EGFP。重组质粒在脂质体LipofectamineTM2000介导下分别转染鸡Ⅹ期胚盘细胞和鸡胚成纤维细胞,并于转染后12 h在荧光显微镜下观察转染效果。实验结果显示：在胚盘细胞转染后12 h可观测到绿色荧光表达,转染后24 h荧光细胞增多,细胞形态均呈圆形、体积较大;在鸡胚成纤维细胞未检测到GFP表达。实验结果说明,由CVH基因启动子控制下的EGFP可在Ⅹ期胚盘细胞特异表达,为利用流式分离技术PGCs标记分离、纯化研究奠定基础。     

猪流感H3N2亚型HA 基因真核表达载体构建及其对小鼠的免疫效果的研究

采用PCR方法扩增出猪流感病毒四川分离株H3N2亚型HA全基因,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,成功构建出真核重组质粒pcDNA3.1-HA.采用纯化后的pcDNA3.1-HA质粒和灭活全病毒以不同的组合免疫4～6周龄的Balb/c小鼠,免疫2次间隔3周,加强免疫3周后,小鼠接种致死量的H3N2病毒;检测免疫后小鼠的血清抗体水平及攻毒后肺部病毒残留.结果表明,pcDNA3.1-HA质粒和灭活全病毒免疫小鼠后,均能够产生一定的免疫效果,能为小鼠提供H3N2亚型猪流感病毒保护.     

牛结核杆菌MPB64蛋白的真核表达

利用PCR技术扩增出牛结核杆菌mpb64基因片段,克隆到真核载体pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pCM64,将该重组质粒转染SP2/0细胞,间接免疫荧光试验和Western blotting检测目的基因的表达情况.结果表明,在转染了重组质粒pCM64的SP2/0细胞中出现绿色荧光,转染的SP2/0细胞泳道23 kDa处出现特异条带,说明mpb64基因在SP2/0细胞中成功进行了瞬时表达.     

猪ATF4基因真核超表达载体的构建及鉴定

摘 要：通过克隆猪ATF4基因CDS,构建pcDNA3.1(+)-ATF4真核超表达载体,为下一步在细胞水平和个体水平研究该基因功能奠定条件。提取RNA,运用RT-PCR技术和巢式PCR技术扩增猪ATF4全部编码序列,克隆转化到pMD18-T载体中,测序证实后,在克隆至真核超表达载体pcDNA3.1(+),构建了pcDNA3.1(+)-ATF4真核超表达载体,并进行酶切和测序鉴定。在细胞水平上进行转染鉴定。成功克隆了ATF4基因,并构建了pcDNA3.1(+)-ATF4真核超表达载体,瞬时转染C2C12细胞,超表达效果明显。为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

携带结核杆菌Ag85B基因的植物表达载体的构建及鉴定

构建包含结核杆菌Ag85B基因的植物表达载体,并转化农杆菌LBA4404。以pcDNA3-Ag85B为模板,通过常规PCR克隆出Ag85B基因,定向克隆至含有玉米特异性启动子globulin-1的pCR2.1载体上,然后将globulin-1-Ag85B的融合片段酶切下来,并连接到经过加工修饰的含有抗除草剂基因bar的双元表达载体pCAMBIA1300上,将重组质粒转化至农杆菌LBA4404中。重组质粒双酶切可见0.8bp和10kb的两条特异性条带,与预期大小相一致。重组质粒测序表明克隆的Ag85B基因序列与Genbank上相一致,酶切从农杆菌中所抽提的质粒,片段大小与预期相一致。成功构建与转化了携带结核Ag85B基因的植物双元表达载体,为利用植物反应器生产口服结核疫苗奠定基础。     

马铃薯晚疫病菌RxLR效应因子RD24基因克隆及其PVX表达载体构建与鉴定

马铃薯晚疫病病原菌致病疫霉菌(Phytophthora infestans)在侵入寄主细胞的同时分泌效应因子(Effector)，该类蛋白在晚疫病致病过程中发挥着关键作用，是抑制植物免疫的重要因素。PITG_RD24是马铃薯晚疫病菌位于细胞核核的一个重要效应因子。为了快速鉴定效应因子RD24在马铃薯中瞬时表达的状况及抗性情况，构建效应子RD24的PVX表达载体是十分必要的。本研究利用PCR、酶切、分子克隆等生物学技术，将RD24片段连接插入至PVX（pGR106）载体中，然后用热击法将连接产物转化至大肠杆菌DH10B感受态细胞中。通过PCR筛选、质粒提取、测序比对，结果表明成功获得含有目的表达载体pGR106·RD24的质粒，可为下一步筛选马铃薯广谱抗病基因研究提供必备载体。     

不同品种羊miR-1298-5p及其潜在靶基因TGF-βR1表达的比较研究

旨在探讨miR-1298-5p与TGF-βR1在不同品种羊皮肤毛囊不同发育时期的潜在关系,为研究miR-1298-5p与TGF-βR1对皮肤毛囊发育作用提供理论研究数据。以绒山羊和细毛羊皮肤毛囊组织为材料,通过生物信息学方法预测miR-1298-5p的靶基因,采用qRT-PCR对miR-1298-5p与其潜在靶基因TGF-βR1进行核酸水平表达检测,利用Western blot对潜在靶基因TGF-βR1进行蛋白水平表达检测。生物信息学预测结果表明TGF-βR1的3'UTR存在miR-1298-5p种子区结合位点。miR-1298-5p在绒山羊和细毛羊皮肤毛囊发育的生长期到退行期相对表达量上调而退行期到休止期相对表达量下调,miR-1298-5p在不同品种羊皮肤毛囊不同发育时期呈现差异性表达。绒山羊皮肤毛囊发育生长期TGF-βR1基因m RNA的相对表达量高于细毛羊,而退行期和休止期低于细毛羊;从表达趋势上看,TGF-βR1与miR-1298-5p表达趋势相反,呈现负调控趋势,说明TGF-βR1可能为miR-1298-5p的靶基因。TGF-βR1蛋白在绒山羊皮肤毛囊发育生长期的相对表达量高于细毛羊,而退行期和休止期则低于细毛羊,与核酸水平相对表达量趋势相同,但都与miR-1298-5p表达趋势相反,更进一步说明TGF-βR1可能为miR-1298-5p的靶基因。     

类猪圆环病毒P1 VP1蛋白在昆虫细胞中的表达及特性分析

为了鉴定类猪圆环病毒P1 VP1蛋白能否在体外自组装成病毒样颗粒(VLPs),首先PCR扩增P1 ORF1基因,利用p Fast BacTM1载体构建重组质粒,通过脂质体转染在Sf9细胞中表达P1 ORF1基因。然后通过RT-PCR技术及Western Blot分别从转录和蛋白质水平上鉴定该基因的表达,应用透射电镜观察该蛋白质是否形成了VLPs。结果显示,转染Sf9细胞后,第5天开始出现细胞病变;从接毒细胞中提取总RNA,经Recombinant DNaseⅠ处理除去基因组DNA后,RT-PCR能够扩增出362 bp的目的片段;收获接毒后72 h的细胞,Western Blot分析显示,P1 ORF1重组病毒样品能够与抗P1 VP1单抗发生特异性反应;电镜观察发现,该蛋白在Sf9细胞中形成了近椭圆形的包涵体。利用杆状病毒表达载体系统成功地在Sf9细胞中表达了类猪圆环病毒P1的ORF1基因,并证实在本试验条件下P1 VP1蛋白不能自组装成VLPs,为进一步研究P1 VP1蛋白的免疫学特性奠定基础。