天女木兰MsGID1同源基因的克隆及表达分析

为了探究天女木兰种子休眠解除的分子机制,本研究以Illumina高通量测序获得的天女木兰转录组数据为参考,从赤霉素信号途径起始受体基因(GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1, GID1)入手,克隆获得2个同源基因(MsGID1b和Ms GID1c)。在此基础上,对天女木兰2个GID1同源基因进行生物信息学分析:MsGID1b和MsGID1c全长分别为996 bp和1 032 bp,二者分别编码331和334个氨基酸;所编码的蛋白质相对分子量分别为37.021 kD和38.363 kD;2个GID1同源基因均是不稳的亲水性蛋白且无信号肽;Ms-%GID1b和MsGID1c属于α/β折叠水解酶超家族。通过实时荧光定量PCR探究MsGID1b和Ms GID1c在不同温度对种子吸胀过程表达模式的影响,发现4℃处理基因表达量最高,其中Ms GID1c的相对表达量显著高于MsGID1b,表明其在种子解除休眠中起关键作用。     

花生种子休眠解除过程中相关基因的表达分析

种子休眠性是花生重要的农艺性状,外源乙烯利能诱导花生种子休眠的解除,为了阐明乙烯利作用下花生种子休眠解除的分子机制,设置吸胀的休眠种子为对照,100 mg L–1乙烯利处理吸胀休眠种子后不同时间的样品(AE1、AE2、AE3)进行转录组分析,比较了花生种子休眠解除过程中ABA、GA、ETH、auxin相关基因的表达。结果表明,15个与GA、40个与ABA、60个与ETH、56个与auxin相关的unigenes在花生种子休眠解除过程中表现显著差异表达。荧光定量PCR结果显示,ABA合成关键基因Ah NCED2和代谢关键基因Ah CYP707A1在种子休眠解除过程中均受外源乙烯利诱导,表达差异显著;在休眠和无休眠种子吸胀萌发过程中,Ah NCED2和Ah CYP707A1的表达趋势不同,Ah NCED2对于种子休眠的维持发挥积极作用,而Ah CYP707A1对于种子休眠解除发挥积极作用。     

GA_3处理对天女木兰种子解除休眠过程中碳水化合物含量的影响

研究了GA3对天女木兰种子在变温层积条件下解除休眠过程中碳水化合物的影响,以此探讨外源赤霉素(GA3)对层积过程中天女木兰种子解除休眠的作用机理。结果表明,1000mg/LGA3水溶液处理极显著促进天女木兰种子萌发,在整个层积过程中,GA3水溶液处理诱导淀粉含量下降;蔗糖含量变化剧烈,在层积90d降至最低,果糖和葡萄糖含量显著增加;在层积后期(90～120d)果糖和葡萄糖含量下降,蔗糖含量上升,从而说明了碳水化合物参与并调节了天女木兰种子休眠解除这一过程。     

玉米ZmPP2C6-01基因的克隆及表达分析

为了研究玉米蛋白磷酸酶2C (PP2C)基因对非生物胁迫的响应及生理功能,以耐旱玉米自交系豫882为试验材料,对玉米20%PEG6000胁迫处理转录组进行分析,筛选受干旱诱导强烈表达的PP2C基因,然后对其进行克隆、生物信息学分析及表达模式分析。结果表明,在玉米20%PEG6000胁迫处理转录组中筛选到一个干旱胁迫下显著上调表达的PP2C蛋白基因,命名为ZmPP2C6-01。ZmPP2C6-01基因的开放阅读框为1 242 bp,编码413个氨基酸,编码蛋白质的分子质量为43.8 ku,等电点为6.6,是一种亲水性蛋白。ZmPP2C6-01蛋白与高粱的PP2C蛋白亲缘关系最近,而与冬小麦、粗山羊草等的PP2C蛋白亲缘关系相对较远。ZmPP2C6-01蛋白定位于细胞核中。利用实时荧光定量PCR分析发现,ZmPP2C6-01基因在玉米根中的表达量最高,其次是叶,茎中最低;PEG胁迫下,ZmPP2C6-01基因在根中的表达量大部分时间点均高于对照,同时在叶中呈上调表达模式;在ABA、NaCl、高温胁迫下,ZmPP2C6-01基因在根中大部分时间点的表达量均低于对照,整体呈下降趋势,而在叶中的表达量均高于对照,呈上调表达模式。综上表明,ZmPP2C6-01基因响应干旱等逆境胁迫,但表达模式不一致。     

人参PgPP2C2基因的克隆及生物信息学分析

2C型蛋白磷酸酶(PP2C)是最大的蛋白磷酸酶家族,PP2C蛋白在响应不同非生物胁迫中发挥着重要作用。为了探究人参Pg PP2C2基因的功能,基于实验室前期转录组数据库,从人参中克隆了一个2C型蛋白磷酸酶基因,命名为Pg PP2C2,并对Pg PP2C2基因的序列、编码蛋白质的结构进行分析,预测了其功能。研究结果表明,该核苷酸序列的开放阅读框为1 269 bp,编码422个氨基酸。其编码蛋白质属于亲水性蛋白,无信号肽,未形成跨膜结构域,包含2C家族丝氨酸/苏氨酸磷酸酶催化结构域。通过蛋白互作分析,发现Pg PP2C2蛋白与HOG1 (参与渗透调节的丝裂原活化蛋白激酶)和NBP2 (NAP1-binding蛋白2,参与HOG途径的蛋白)的互作分数分别高达0.996和0.984,推测Pg PP2C2蛋白可能参与渗透胁迫调节及磷酸化过程。本研究结果可为后期进一步研究PgPP2C2基因的功能和开展人参种植调控提供理论基础。     

巴戟天MoTPS基因及其启动子克隆与分析

为探究巴戟天中MoTPS基因的序列特征及其在生长素IAA处理下的表达模式。本研究利用RT-PCR获得3个巴戟天MoTPS基因的全长c DNA序列,分别命名为MoTPS1、MoTPS2和MoTPS3。基因序列分析显示,基因全长分别为2 841、2 126和2 144 bp,开放阅读框(ORF)分别为2 481、1 668和1 943 bp,分别编码826、555和640个氨基酸。序列分析结果显示,3个MoTPS基因编码蛋白均为亲水性的不稳定蛋白,3个基因的氨基酸序列含有萜类特有的天冬氨酸(DDXXD)富集基序及RXR保守基序,并含有萜类ClassⅠ超级家族结构域。同源比对分析显示3个MoTPS基因氨基酸序列与咖啡树匹配的TPS基因同源性均达到75%以上。系统进化树分析表明MoTPS1基因属于TPS-f亚族分支,而MoTPS2和MoTPS3基因同属于TPS-d亚族分支。启动子克隆得到序列长度为739 bp的MoTPS3基因启动子,其含有多种光响应、激素响应顺式元件,如G-box、Sp1、P-box、TGA-element等。荧光定量PCR分析表明3个MoTPS基因在巴戟天根、茎、叶中稳定表达且具有组织特异性;经生长素IAA处理后,3个MoTPS基因在根中的相对表达量均显著上调。因此研究推测,3个MoTPS基因参与巴戟天根中萜类次生代谢物合成过程且生长素IAA对MoTPS基因的表达调控发挥重要作用。     

海岛棉GbMFT1基因的克隆及表达分析

通过RT-PCR和RACE技术,从新疆海岛棉品种新海14中克隆得到了一个MFT (MOTHER OF FT AND TFL1)类似基因,命名为GbMFT1基因(GenBank登录号为KC513744)。GbMFT1基因的开放阅读框(ORF)为528 bp,编码175个氨基酸的蛋白,含一个磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)结构域。GbMFT1蛋白的羧基端含有MFT蛋白都含有的脯氨酸。系统进化树分析表明GbMFT1编码产物与葡萄、番茄亲缘关系较近,属于同一进化分枝。实时荧光定量PCR分析表明,GbMFT1基因在棉花的不同组织中均有表达,在花瓣中的表达量较高;在纤维发育的不同时期中均有表达,在开花后2 d的胚珠、9 d的纤维中表达量最高。半定量RT-PCR结果表明,GbMFT1基因在刚萌发的种子中表达量高,用不同浓度的ABA处理种子后其表达变化不明显,表明GbMFT1基因的表达不受ABA的调节。     

比较转录组分析花生种子休眠调控网络

种子休眠性是花生重要且复杂的农艺性状,对花生(ArachishypogaeaL.)的产量和品质影响巨大。为深入揭示花生种子休眠维持和解除的分子调控网络,本研究以强休眠品种花育52号(HY52)和弱休眠突变株系M23、M67为试材,种子吸胀处理(0 h、12 h、24 h)后测定其激素ABA和GA含量并进行转录组测序。吸胀12 h时M23和M67中GA含量显著高于HY52, ABA含量和ABA/GA比值则低于HY52。测序共得到31,373个差异表达基因(DEGs),其中ABA和GA生物合成和信号转导相关的基因在种子休眠维持和解除过程中发生显著变化,挖掘到50个ABA相关基因、8个GA相关基因、49个乙烯相关基因和13个生长素相关基因。此外,还鉴定到许多参与碳水化合物和脂质代谢、氨基酸代谢途径相关的DEG,挖掘到糖代谢相关基因5个、脂质代谢相关基因4个;昼夜节律调控也可能参与花生种子休眠解除。这表明,花生种子休眠维持和解除的调控是一个复杂网络,植物激素平衡调控可能只是其中一个重要部分。     

亚洲棉GaPP2C24基因的克隆及表达分析

PP2C是一大类重要的蛋白磷酸酶,广泛参与不同的逆境胁迫响应。为了解PP2C基因在干旱响应中的功能,以亚洲棉石系亚1号为材料,利用RT-PCR方法从中克隆了GaPP2C24基因,并对该基因进行了生物信息学分析,荧光定量PCR研究了其在亚洲棉不同组织和干旱胁迫下的表达情况。结果表明,GaPP2C24基因CDS序列全长为1 251 bp,编码416个氨基酸。序列同源比对发现,GaPP2C24与其他植物的PP2C氨基酸序列有较高的相似性,其中与可可树(EOY33930.1)、黄麻(OMO91132.1)的相似性分别为85%,84%。进化分析表明,GaPP2C24与同属锦葵目的黄麻聚在一支,亲缘关系最近,与可可树的亲缘关系次之。实时荧光定量PCR结果表明,GaPP2C24基因在子叶、下胚轴、胚根、叶、茎和根均有表达,且在茎中的表达量最高,根中次之。GaPP2C24受干旱胁迫的诱导表达,其在根和叶片中的相对表达量在处理1 h后最高,分别达到对照的53.9,6.9倍,推测该基因在棉花干旱响应中有重要作用。     

紫苏脂肪酸硫酯酶基因PfFatA生物信息学及其表达特性分析

为研究脂肪酸硫酯酶A(FatA)在紫苏脂肪酸合成机制中发挥的作用,对紫苏FatA基因及其编码的蛋白质进行生物信息学分析。结果表明,PfFatA基因cDNA全长1 652 bp,开放阅读框1 119 bp,编码372个氨基酸;紫苏FatA基因编码的蛋白质为亲水性不稳定蛋白,无跨膜区域;含Acyl-ACP_TE保守结构域,属于Hotdog fold超蛋白家族;多序列比对结果发现,序列C端含有保守的三联肽AKL和SKV结构;系统进化树分析表明,紫苏与丹参亲缘关系较近。通过Real-time PCR分析得知,PfFatA在紫苏根、茎、叶、花和种子不同发育时期均有表达,其中,在种子发育初期表达量最高。该研究结果可为进一步阐明PfFatA基因的功能及作用机制奠定基础。     

海岛棉GbMFT2基因的克隆及表达分析

通过RT-PCR和RACE技术从新疆海岛棉品种新海14号中克隆得到了一个MFT(MOTHER OFFT AND TFL1)类似基因,命名为GbMFT2基因(GenBank登录号为KF739071)。GbMFT2基因的开放阅读框(ORF)为519 bp,编码172个氨基酸,含有一个磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)结构域。GbMFT2基因和GbMFT1基因的核苷酸相似性仅为56.7%,二者蛋白的相似性为62.7%。系统进化树分析表明GbMFT2编码产物属于MFT-like亚家族。qRT-PCR分析表明,GbMFT2基因在不同的组织中均有表达,在胚珠和茎中表达量较高。半定量RT-PCR结果表明,和GbMFT1基因的表达模式不同,GbMFT2基因在刚萌发的种子中的表达量很低;但随着ABA浓度的升高表达量显著提高,并且ABA处理下萌发24 h的种子中的表达量要高于72 h中的表达量,表明该基因的表达受ABA的调节,可能在种子萌发过程中起重要作用。     

玉米种子萌发相关性状的全基因组关联分析

种子萌发是出苗的前提, 对玉米产量影响重大。为了解玉米种子萌发相关性状的遗传机制, 本研究对476份玉米自交系种子萌发相关的6个性状进行调查, 结合125万个(1.25M) SNP标记, 利用3种统计模型(Q, K, Q+K)进行全基因关联分析(GWAS)。结果表明K模型能够较好地评价吸胀前重量、吸胀前体积、吸胀后重量、吸胀后体积和吸胀体积5个性状; Q+K模型能更好地评价吸胀重量性状。基于这6个性状的最优模型的GWAS结果, 共检测到15个种子萌发相关性状的显著SNP, 15个SNP对应6个QTL, 集中分布在玉米第3、第6、第7和第10染色体上, QTL内单个SNP能解释的表型变异为5.09%~7.85%。其中5个QTL可在多个生物学重复中被检测到。以最显著SNP所在基因或附近基因作为QTL的候选基因, 共筛选到6个最可能的候选基因。GRMZM2G148411是吸胀后重量、吸胀重量和吸胀体积3个性状共同鉴定到的QTL候选基因, 根据基因的功能注释, 该基因编码一个包含TLD-domain的钙离子结合蛋白, 可能是一种调控种子休眠与萌发的信号分子。本研究鉴定的QTL为解析玉米种子萌发的遗传机制和相应功能标记的开发奠定了基础。     

烟草磷酸酶基因NtPP2C16的克隆、表达载体构建及表达分析

2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C-type protein phosphatases,PP2C)是ABA信号转导途径中的关键组分,在植物生长发育、细胞周期调节及应对逆境胁迫的过程中发挥重要的作用。为探究PP2C基因在烟草适应非生物胁迫中的功能,从烟草栽培品种K326中克隆到了一个PP2C同源基因,该基因开放阅读框为1 617 bp,编码538个氨基酸残基。同源性分析结果显示,该基因所编码的蛋白与绒毛状烟草PP2C16的亲缘关系最近,故命名为NtPP2C16。生物信息学分析表明,NtPP2C16催化区域上具有PP2C家族进化中相对保守的11个结构亚区。qRT-PCR研究分析结果表明:该基因的表达显著受ABA和H_2O_2 2种信号分子诱导,并且响应干旱、高盐、低温和低钾胁迫。成功构建NtPP2C16-pBI121过表达载体,为解析NtPP2C16参与烟草非生物逆境胁迫响应提供一定的理论依据。     

膜荚黄芪C4H基因的克隆及表达分析

本研究采用RACE技术从膜荚黄芪中克隆得到两个肉桂酸-4-羟基化酶Am C4H1与Am C4H2,并进行了生物信息学分析;研究了Am C4H1与Am C4H2在根、茎和叶中的表达量与毛蕊异黄酮及其糖苷含量之间的相关性。结果表明,克隆得到的Am C4H1与Am C4H2基因均编码505个氨基酸,属于不稳定蛋白和亲水性蛋白,Am C4H1与Am C4H2基因编码氨基酸序列上的差异导致二级结构与三级结构不同。Am C4H2基因在根、茎、叶中的表达趋势与毛蕊异黄酮及其糖苷的含量基本一致,推测其参与了毛蕊异黄酮及其糖苷的生物合成,这为通过分子手段提高毛蕊异黄酮及其糖苷的含量提供了理论参考。     

苦参硬实性及硬实相关基因SfHs1-1的克隆与表达分析

硬实性是种子休眠类型之一,为研究苦参(Sophora flavescens Ait)种子硬实性并探究其分子机制,测定苦参种子的硬实率及发芽率,观察种皮解剖结构,并从苦参中克隆得到SfHs1-1基因(GenBank:MK840-983),进行生物信息学分析.结果 表明,苦参具有高硬实率,观察种皮解剖结构发现在发育过程中种皮不断增厚,且栅栏组织所占比例越来越大.克隆获得苦参SfHs1-1基因共1495 bp,其开放阅读框序列长1386 bp,编码461个氨基酸;预测SfHs1-1蛋白分子量为52267.15 kD,等电点为9.21,是一个稳定的亲水性蛋白,含有信号肽和多个磷酸化位点,且具有一个保守结构域,属于典型的碱性磷酸酶D家族;系统进化分析表明SfHs1-1蛋白与豆科狭叶羽扇豆(Lupinus angustifolius)的PhoD亲缘关系最近.对苦参SfHs1-1基因的表达分析可知,该基因在茎、叶、种皮等各个组织中均有表达,在开花初期表达量基本没有差异,随着种子的生长发育,在第4周种皮中的表达量显著高于其他组织.本研究为苦参硬实性形成机制的探索及改造提供了一定的分子基础.     

草果AtNCED基因克隆、表达和植物表达载体构建

9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, NCED)是ABA生物合成的限速酶。诸多研究表明NCED基因表达量的变化与ABA含量显著相关,在种子休眠过程中发挥重要作用。为探究草果AtNCED基因的序列特征和功能,本研究以草果(Amomum tsaoko Crevost et Lemarie)种子转录组为基础,采用RT-PCR技术克隆了一个AtNCED基因。该基因全长2 372 bp,包含一个1 830 bp的开放阅读框(open reading frame, ORF),编码610个氨基酸。生物信息学分析显示,AtNCED基因编码的蛋白在N-末端包含典型的叶绿体转运肽序列,在催化结构域含有4个高度保守的组氨酸残基。AtNCED蛋白与芭蕉科马来西亚蕉同源性较高,与其他单子叶植物处在同一进化分支。实时荧光定量PCR分析结果表明,AtNCED基因表达量随着层积时间的增加逐渐下降,该基因可能正向调控种子休眠,在草果种子休眠诱导与维持中发挥重要作用。进一步地,利用同源重组方法,成功构建了pBI121-AtNCED过表达载体,并转化至农杆菌EHA105。该研究结果为弄清ABA激素信号在种子休眠中的调控作用提供了帮助。     

小麦胚休眠的蛋白质组分析

为探讨小麦种子休眠解除的机制,利用蛋白质组学方法比较解除休眠前后的小麦胚在ABA和H2O2中的蛋白质表达情况.H2O2能打破种子休眠,而ABA则使种子保持休眠状态.比较2D图谱后,利用MALD1-TOF-MS鉴定了10个在不同处理间表达丰度差异显著的蛋白点,其中一些蛋白在已知的种子萌发中起重要作用.种子休眠的解除是一个复杂的发育过程,涉及环境胁迫反应(胚发育后期丰度蛋白、NAD(P)H脱氢酶)、细胞循环(生长素反应蛋白)、信号转导(钙调素相关蛋白)和贮藏蛋白(2S种子清蛋白)代谢等生理活动.为研究H2O2打破小麦休眠的分子机理提供了重要参考.     

芒果FLC同源基因的克隆和表达分析

开花抑制基因FLC (FLOWERING LOCUS C)是春化作用中的关键基因,为探索MADS-box转录因子在芒果花器官发育中的作用,本研究利用RT-PCR克隆得到芒果MADS-box转录因子MiFLC的cDNA全长,序列分析显示该基因具有MADS_MEF2_like和K-box结构域,属于MADS-box基因家族,MiFLC基因编码区长576 bp,编码191个氨基酸,蛋白质相对分子质量22.08 kD,等电点为9.18。MiFLC的生物信息学分析表明该蛋白序列的二级结构主要由α螺旋、无规则转曲及延伸链构成,属于亲水性氨基酸。序列分析和系统进化树分析显示,MiFLC基因编码的蛋白与橙子、枳、龙眼、克莱门柚的蛋白序列同源性高,亲缘关系较近。组织特异性表达分析表明,MiFLC基因在芒果不同品种和每个品种的不同组织部位均有表达,在‘桂七’、‘金煌’、‘凯特’3个品种的表达量呈现出一致性,在营养器官中表达量最高,在花器官中表达量较低,表达量顺序依次是叶茎果花。     

荠菜生长素极性运输基因1(CbPIN1)的克隆与表达分析

为了探讨荠菜PIN1基因的生物学功能,根据Gen Bank中拟南芥PIN1氨基酸序列,设计同源引物,通过RT-PCR技术,克隆了荠菜PIN1基因(CbPIN1)编码区c DNA序列;生物信息学方法分析了荠菜PIN1蛋白结构特征,并进行了亚细胞定位与原核表达;荧光定量PCR方法检测了PIN1组织表达特性;构建了植物表达载体p BI121-CbPIN1,并获得转基因植株。结果表明,CbPIN1 c DNA序列全长1 869 bp,C+G含量为49%。Blast比对结果显示,CbPIN1与拟南芥PIN1基因高度同源,相似性高达93%。进一步分析发现,CbPIN1可编码1条622个氨基酸的多肽,CbPIN1蛋白分子质量为67. 05 ku,等电点为9. 02,碱性氨基酸(K、R)个数为49,酸性氨基酸(D、E)个数为42,疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)个数为241,极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)个数为157。CbPIN1属于跨膜蛋白,含12个丝氨酸磷酸化位点,1个苏氨酸磷酸化位点。亚细胞定位结果显示,CbPIN1定位于细胞膜; CbPIN1在荠菜不同组织均有表达,其中,根中表达最高,种子中表达最低。原核表达显示CbPIN1蛋白大小87. 05 ku。过表达荠菜植株中CbPIN1基因表达量均显著增加。试验结果为进一步分析CbPIN1在荠菜器官发育中的作用奠定了基础。     

菊花MADS-box基因的克隆与表达载体构建

为了给菊花CmFUL基因功能鉴定与遗传改良奠定基础,采用RT-PCR法从菊花叶片中克隆出1个MADSboxA类基因的编码区序列,命名为CmFUL(Gen Bank登录号KT894379)。CmFUL基因编码区ORF片段长度为741 bp,编码246个氨基酸。CmFUL蛋白属于亲水性蛋白,预测该蛋白内含12个磷酸化位点和2个潜在的N-糖基化位点。氨基酸序列比对和系统进化树分析表明,CmFUL蛋白与CMD41蛋白的相似性为95.6%,同属于AP1/FUL亚家族的FUL-like进化枝。实时荧光定量PCR分析表明,CmFUL基因在花期不同组织中均有表达,但表达丰度不一。在花蕾中表达量最高,其次是管状花,根和舌状花中痕量表达;同一朵花中管状花的表达量约为舌状花中的12倍。分析认为,CmFUL可能在促进开花及子房建成中起重要作用。将CmFUL基因连接到p CAMBIA1300载体上,成功构建了高效植物表达载体。