抗猪瘟病毒E2蛋白单抗9A4H4的鉴定

为鉴定抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体9A4H4与不同猪瘟病毒(CSFV)株的反应性,将其与猪瘟病毒石门株、猪瘟兔化弱毒疫苗株和前期分离获得的106株猪瘟流行毒株进行IFA验证。在此基础上,利用昆虫杆状病毒系统表达的基因1型、2型和3型代表性毒株的E2蛋白进行了Western blot验证。试验还利用含有或不含β-巯基乙醇的SDS上样缓冲液对真核表达和原核表达的石门株E2蛋白进行处理,并与单抗9A4H4进行反应,初步鉴定了该单抗所识别抗原表位的类型,并利用石门株进行中和试验验证该抗体对CSFV的中和能力。间接免疫荧光试验结果表明:单抗9A4H4能与石门株、猪瘟兔化弱毒疫苗株、基因1型以及大多数的基因2.1b亚亚型、2.2、2.3基因亚型的毒株反应,与绝大多数的2.1a、2.1c、2.1g和2.1h基因亚亚型的毒株不反应,该结果与单抗和病毒E2蛋白的反应结果完全一致。Western blot结果表明:单抗9A4H4只与真核表达的非还原型石门株E2蛋白反应,与真核表达的还原型E2蛋白以及原核表达的石门E2蛋白不反应,表明该抗体识别的抗原表位为构象表位。中和试验结果表明,单抗9A4H4对CSFV石门株没有中和能力。     

高致病性猪蓝耳病病毒GST-Nsp2融合蛋白的原核表达

通过对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HPPRRSV)Nsp2基因进行克隆表达以获得蛋白,为该病的诊断预防奠定基础。采用自行设计的引物对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒进行RT-PCR扩增,将产物基因回收纯化测序后构建PGEX-6P-1-Nsp2原核表达载体,用BL21(DE3)细胞进行转化,挑选阳性菌,用IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE电泳和Western-Blot对表达产物进行鉴定。获得了HPPRRSV Nsp2基因序列,成功构建了PGEX-6P-1-Nsp2原核表达载体,经37℃,4 h获得表达产物,将表达产物进行SDS-PAGE和Western-Blot分析,获得了一条约42 ku浓缩蛋白带。本实验的克隆表达产物为高致病性蓝耳病病毒Nsp2目的蛋白。     

检测猪瘟病毒胶体金和量子点试纸条的初步研制

为建立快速、简便检测猪瘟病毒(CSFV)抗体的方法,本研究采用胶体金和量子点免疫层析技术,将纯化的重组CSFV E2蛋白作为捕捉抗原,以纯化的抗CSFV E2蛋白多克隆抗体和HRP兔抗猪IgG分别包被于硝酸纤维素膜上,作为质控线(C线)和检测线(T线),优化反应条件,制备免疫层析试纸条,用于临床检测。结果表明,制备的2种试纸条都可用于检测CSFV标准阳性血清,使用不同批次试纸条进行检测,结果无差异。2种试纸条与CSFV阳性血清反应呈阳性,与伪狂犬病毒(PRV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和圆环病毒2型(PCV2)反应呈阴性;胶体金试纸条在临床样品中阳性检出率为84.38%(81/96),与CSFV抗体检测ELISA试剂盒检测阳性符合率为92.05%(81/88);量子点试纸条阳性检出率为87.50%(84/96),与ELISA试剂盒检测阳性符合率为95.45%(84/88)。本研究制备的2种试纸条都具有较好的特异性、敏感性、重复性和稳定性。     

日本脑炎病毒E基因抗原域Ⅲ的克隆及高效表达

根据GenBank公布的日本脑炎病毒 (Japaneseencephalitisvirus ,JEV)SA14 14 2减毒株的核苷酸序列 ,设计并合成一对特异性引物 ,应用RT PCR方法扩增出编码JEV囊膜蛋白抗原域Ⅲ的基因 (EⅢ) ,将其连接入pMD18 T载体 ,经测序后克隆入原核表达载体pET 32a (+) ,构建原核表达载体pET EⅢ 。阳性质粒转化感受态大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导 ,JEV EⅢ 基因获得表达 ,经细胞定位分析 ,目的蛋白以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变IPTG的浓度和诱导时间 ,确定了表达EⅢ 蛋白的最佳诱导条件 :IPTG终浓度为 0 1mmol·L-1,诱导时间为 3h。在大肠杆菌中的最高表达量占菌体总蛋白的 5 4 9%。Western blot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。利用纯化的表达产物作抗原包被酶标板 ,可以明显地区分JEV阴、阳性血清 ,并且不与猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒的阳性血清发生反应。结论 :重组JEVEⅢ 蛋白可以用于检测猪血清中JEV抗体水平。     

猪瘟病毒E2蛋白的原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

以猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)标准强毒石门株为模板,RT-PCR扩增CSFV E2基因N端的主要抗原区(△E2).PCR产物定向克隆至原核表达载体pET-32a中,构建了重组表达质粒pET-AE2,转化Eacterium coli BL21-Codonplus(DE3),IPTG诱导重组△E2蛋白表达,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定蛋白的正确表达.KCl预染切胶法纯化△E2蛋白,以其为包被抗原,通过反应条件的优化,建立了CSFV抗体ELISA检测方法.用该方法对331份临床血清进行检测,并与IDEXX公司阻断ELISA试剂盒进行了相符性验证,符合率为74%.为研制猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒奠定了基础.     

抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

[目的]制备抗猪瘟病毒（CSFV）的单克隆抗体（MAb）。[方法]以纯化的猪瘟病毒免疫4～6周龄BALB／c雌鼠,取其脾细胞与SP2／O骨髓瘤细胞进行融合,筛选出抗CSFV单克隆抗体杂交瘤细胞株。[结果]经间接ELISA获得3株能稳定分泌抗CSFVE2蛋白的MAb杂交瘤细胞,分别命名为1AS、5F3和4D2。Mab亚型鉴定表明3株MAb均为IgG2b,轻链均为K链。Westernblot结果表明3株Mab均能识别重组E2蛋白。间接免疫荧光试验表明3株Mab均与CSFV呈阳性反应,与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒（PCV2）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）呈阴性反应。[结论]该研究为建立CSFV特异性检测方法奠定了基础。     

芪板青颗粒体外抗PRRSV效果研究

为了检验芪板青颗粒体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒效果,降低养猪场因感染猪繁殖与呼吸综合征病毒带来的损失,本试验通过调整芪板青颗粒溶液与猪繁殖与呼吸综合征病毒液加到Marc-145细胞中的不同顺序,分别检验芪板青颗粒对猪繁殖与呼吸综合征病毒的抑制、杀灭和阻断作用。结果显示：芪板青颗粒对猪繁殖与呼吸综合征病毒有一定的抑制、杀灭和阻断作用,在芪板青溶液浓度为24.4～3 125.0 mg/L时,有显著的抑制和杀灭猪繁殖与呼吸综合征病毒作用,在浓度195.3～3 125.0 mg/L时,有显著的阻断猪繁殖与呼吸综合征病毒作用。结果表明：芪板青颗粒可用于体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒,本试验为芪板青颗粒的应用提供了依据,为猪繁殖与呼吸综合征的防治提供了帮助。     

猪瘟病毒结构蛋白E0抗体间接ELISA检测方法的建立及优化

为建立一种经济、可靠的猪瘟病毒(CSFV)血清抗体检测方法,采用间接ELISA(E0-ELISA)方法,以在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达的重组蛋白E0为包被原,优化反应条件。结果显示,优化后的E0-ELISA在包被原1.0μg/mL质量浓度下37℃包被1 h效果最佳,最佳封闭条件为5%脱脂奶粉溶液37℃作用2 h,待检血清以1∶100稀释后37℃作用60 min效果最佳,二抗以1∶5 000稀释后37℃孵育45 min效果最佳。当OD_(450)0.370时,判断为猪血清CSFV抗体阴性;批内和批间重复试验变异系数分别为1.99%～7.69%和2.16%～9.23%,表明该方法具有良好的稳定性;E0-ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)阳性血清时结果均为阴性;当CSFV阳性血清稀释至1∶640时结果仍为阳性,表明该检测方法具有良好的敏感性;与IDEXX CSFV抗体检测试剂盒相比,E0-ELISA检测符合率为92.00%,敏感性为97.86%,特异性为78.33%。综上,成功建立一种经济、稳定、特异性好和敏感性高的CSFV血清抗体间接ELISA检测方法。     

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒非结构蛋白nsp1α的表达及活性检测

为获得具有活性的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白1α(nsp1α),以BJ-4PRRSV nsp1α真核表达质粒pc DNA3.1-nsp1α为模板扩增nsp1α,克隆到原核表达载体p ET-28a,1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导含有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)。SDS–PAGE结果显示,nsp1α以包涵体形式高效表达,重组蛋白大小约为20 ku;Western blot结果显示,表达的重组蛋白能与小鼠抗His标签单克隆抗体反应;包涵体蛋白复性后,ELISA方法检测结果显示,重组蛋白能与1∶6 400稀释的PRRSV阳性血清反应。表明成功表达了nsp1α蛋白,且表达的重组蛋白具有较好的免疫学活性。     

CSFV和PRRSV双重RT-PCR检测方法的建立及其应用

为建立一种能够同时快速诊断猪瘟(CSF)和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)2种传染病的方法,根据GenBank上已发表的猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核苷酸序列,分别设计并合成2对能特异性扩增CSFV、PRRSV的引物,经过条件优化后,建立了检测CSFV、PRRSV的双重RT-PCR方法,扩增2种病毒的片段,大小分别为508bp和432bp.试验证明,该方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,简便、快速、高效,为CSFV与PRRSV的快速诊断及进一步的CSFV与PRRSV的流行病学研究提供了重要的技术支持.