柑橘CAPS 标记和AS-PCR 引物的开发

 以从GenBank中下载的93 955条甜橙[Citrus sinensis（L.）Osbeck]EST序列为源序列,利用QualitySNP软件包从中挖掘出1 521个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）候选位点。进一步利用酶切位点查找软件WatCut进行分析,发现其中125个SNP为酶切扩增多态性序列（cleaved amplified polymorphic sequences,CAPS）位点。随机挑选40个CAPS候选位点设计引物,对12个含多种类型的柑橘品种进行分型,以此验证各标记的有效性。同时,还挑选了25个经生物信息学预测可导致其编码蛋白氨基酸序列改变的SNP位点,分别设计出一组等位基因特异PCR（allele specific PCR,AS-PCR）引物,以6个不同类型柑橘品种的DNA为模板进行PCR扩增,扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测,筛选多态性引物。结果显示,40个CAPS候选位点中有26个位点具有酶切扩增多态性,且分型结果稳定,可作为CAPS标记。此外,还筛选获得15组在不同柑橘品种间检测到多态性的AS-PCR引物,重复性好,可有效用于柑橘品种的SNP分型。     

核桃早实性相关性状的SCAR标记

用RAPD技术对新疆核桃早实特性的分子标记进行了研究。用180个10-mer随机引物分别扩增早实和晚实近等基因池DNA筛选出5个多态性引物,结果只有引物OPG15(5′-ACTGGGACTC-3′)扩增得到1条约710bp的早实核桃特异片段。对该片段进行克隆和序列分析,并根据序列分析结果将该RAPD标记转化为重复性和特异性更好的SCAR标记。研究设计出了1对早实核桃特异SCAR引物P1(5'-ACTGGGACTCCAATTGTATC-3')和P2(5'-ACTGGGACTCTCAACTAT-3'),用这对特异引物对14份材料进行PCR扩增,结果所有晚实核桃材料无任何扩增,但早实材料均扩增出了预期大小759bp的特异带。     

与番茄灰叶斑病抗病基因Sm连锁的CAPS标记开发

利用与番茄灰叶斑病Sm基因连锁的RFLP标记,设计开发了一个CAPS标记,用于抗番茄灰叶斑病育种。以已知抗病基因型的番茄种质为材料,参照与Sm基因紧密连锁的RFLP标记设计特异引物,进行PCR扩增,产物克隆测序分析寻找特异性酶切位点,开发了一个与抗病基因Sm紧密连锁的CAPS标记,命名为T280。利用特异引物T280进行PCR扩增,供试材料均扩增出1条655 bp的特异条带。经限制性内切酶Mme I酶切后,抗病纯合材料仍保留1条655 bp的特异条带,感病纯合材料产生206 bp和449 bp的特异条带,抗病杂合材料产生206 bp、449 bp和655 bp的特异条带。利用不同遗传背景的番茄材料对该标记进行验证,结果发现,能够区分抗病杂合、抗病纯合和感病纯合材料。开发的CAPS标记稳定可靠,是一个比较理想的共显性CAPS标记,可用于Sm基因的分子标记辅助育种。     

葡萄SNP 标记的CAPS 和TSP 分析

 为了建立起葡萄SNP 标记分析的一般方法和探索EST-SNP 标记在葡萄中的应用，对前期开 发的葡萄EST-SNP 位点进行了筛选，设计了28 对CAPS（cleaved amplified polymorphic sequences，酶切 扩增多态性序列）标记引物和22 对TSP（Temperature-switch PCR，温度转变PCR）标记引物，并在31 份葡萄材料中进行了分析，其中20 对CAPS 引物和10 对TSP 引物电泳条带较清晰，多态性较好。基 因分型统计显示：所有的SNP 位点均含有2 个等位基因，平均多态性信息含量（PIC）为0.336，平均 Shannon’s 信息指数为0.511。基因分型和葡萄材料聚类结果均显示这两种方法所获结果提供的信息量大且 结果可靠。本方法简便、成本低，可作为SNP 分型有效方法用于葡萄品种鉴定、基因分型和遗传多样性 分析等。     

桃果实非酸/酸性状SCAR标记的转化与验证

 根据筛选到的与桃果实非酸/酸性状紧密连锁的3个AFLP标记特异片段序列信息, 设计特异引物BFPA1/A2、BFPB1/B2和BFPC1/C2。3个特异引物在‘京玉’桃、‘美味’油桃及其正反交F¹代69株群体中的PCR检测结果表明: 引物BFPB1/B2在果实性状表现为酸的后代个体中扩增出分子量大小为158 bp的特异条带, 且根据特异片段AT-CTA₁₉₉不同部位设计的引物都能稳定扩增, 只是片段大小有所差异;特异扩增检测F¹群体分离结果与原先AFLP_AT/CTA标记完全一致, 表明AFLP标记已成功转化为SCAR标记,该SCAR BFPB1/B2标记与D基因的连锁距离为2199 cM。利用SCAR BFPB1/B2标记对‘大久保’桃ב兴津’油桃的F²群体60株个体的果实非酸/酸性状进行检测, 基因型与表型性状符合率为96.7% , 并且表现为共显性标记。特异引物BFPA1/A2和BFPC1/C2的扩增多态性条带在亲本及后代中消失。     

番茄高可溶性固形物基因CAPS标记的创制

根据已有的RFLP标记信息，合成PCR引物、设计限制性内切酶，就可把操作复杂、成本较高的RFLP标记转化为操作简单实用，成本适宜的CAPs标记。本实验对番茄高可溶性固形物基因的4个RFLP标记进行转化，其中TGl61和TG237成功地转化为CAPS标记，并建立了各自的PCR和限制性内切酶的优化体系，大大增加了该标记在标记辅助选择等实际应用中的实用性。     

利用PCR技术同时鉴定番茄抗根结线虫和抗斑萎病毒基因

 利用同一PCR反应体系，对分别与番茄抗根结线虫的 基因和抗斑萎病毒(1w V)的Sw一5基因紧密连锁的SCAR标记进行了同时扩增筛选，扩增的特异性片段与单引物扩增片段完全吻合，其中与基因紧密连锁的SCAR1标记为共显性标记，抗感试材均产生750 bp的特异片段，纯合和杂合抗病基因型试材存在 I酶切位点，酶切后分别产生了570 bp、160 bp和750 bp、570 bp、160 bp的不同特异性片段，而感病基因型试材无 I酶切位点；与Sw一5基因紧密连锁的SCAR2标记为显性标记，只有抗病试材扩增出400 bD的特异性片段。经反复验证，结果稳定准确可靠，可用于在同一PCR反应体系中对两个抗病基因进行同时筛选鉴定。     

芸薹种作物抽薹相关基因BrFLC1的CAPS标记

以16份芸薹种作物DH系为试材,通过人工春化处理对其抽薹性状进行了鉴定,明确了材料间抽薹早晚存在显著差异;根据BrFLC1基因序列设计引物进行PCR扩增发现,所有16份材料均获得980 bp的片段。多序列比对与抽薹性的关联分析发现,材料的抽薹早晚与扩增片段的碱基变异相关联,并发现关联位点的碱基变异为限制性内切酶Mva I的识别位点;利用该酶对PCR产物酶切可以将材料明显区分开来,从而建立了BrFLC1基因的CAPS标记（命名为G-Mva I）。利用此标记对96份芸薹种作物DH材料的验证表明,该基因的分子标记结果与抽薹时间表型显著相关,用该标记可以进行分子标记辅助选择。     

葡萄 SNP 标记的 CAPS 和 TSP 分析

为了建立起葡萄 SNP 标记分析的一般方法和探索 EST-SNP 标记在葡萄中的应用,对前期开发的葡萄 EST-SNP 位点进行了筛选,设计了 28 对 CAPS（cleaved amplified polymorphic sequences,酶切扩增多态性序列）标记引物和 22 对 TSP（Temperature-switch PCR,温度转变 PCR）标记引物,并在 31份葡萄材料中进行了分析,其中 20 对 CAPS 引物和 10 对 TSP 引物电泳条带较清晰,多态性较好。基因分型统计显示：所有的 SNP 位点均含有 2 个等位基因,平均多态性信息含量（PIC）为 0.336,平均Shannon’s 信息指数为 0.511。基因分型和葡萄材料聚类结果均显示这两种方法所获结果提供的信息量大且结果可靠。本方法简便、成本低,可作为 SNP 分型有效方法用于葡萄品种鉴定、基因分型和遗传多样性分析等。     

月季种质鉴定和多样性分析

 利用RAPD 技术对28 个月季品种和2 个蔷薇品种进行了遗传多样性分析, 从145 个引物中筛选出12 个引物, 可以扩增出清晰、稳定和多态性高的产物。其中3 个引物从30 个材料中扩增出3 个品种特异的RAPD 分子标记, 并将其中的一个成功地转换成了SCAR 标记。利用筛选出的12 个引物扩增出的65 条多态性片段作了聚类分析, 对这些月季品种的亲缘关系和进化作了初步探讨。     

蝴蝶兰EST 资源SSR 标记分析与开发

 利用SSRIT软件对NCBI上蝴蝶兰的8 188条EST序列按照碱基重复单元数8以上的标准进行SSR位点查找,发掘出246条EST序列,共含有261个SSR位点,检出率为3.19%。二核苷酸重复是最主要的重复类型,占SSR总数的94.25%。SSR的不同重复单元中,最常见的重复单元是：(TA)_n和(GA)_n,其余出现频率较高的依次为(TC)_n、(AT)_n和(AG)_n。设计了32对EST-SSR引物,以蝴蝶兰品种‘V31’的DNA为模板进行PCR扩增,发现16对引物能扩增出预期产物。进一步用这16对引物对16个蝴蝶兰品种（系）进行PCR扩增,9对引物有多态性,多态性条带数在2 ~ 12个之间。结果表明,设计开发的蝴蝶兰的EST-SSR标记是有效的。     

安徽砀山酥梨自然保护区梨种质资源AFLP分析

为探讨安徽砀山酥梨自然保护区梨种质资源遗传多样性和鉴定砀山酥梨营养系变异,以该保护区内27个梨资源代表类型为试材,利用AFLP分子标记技术开展研究。运用从36对选择性扩增引物中筛选的3对引物组合进行扩增,每对引物可扩增出50条以上的清晰条带,扩增片段长度为30～600bp,9个引物组合共扩增出清晰可靠的DNA谱带540条。其中498条为多态性条带,平均多态性比率为92.2%。聚类分析表明,当遗传距离阈值为39.2～40.1时,全部供试生物型可分为6类:第1类为砀山酥梨及其变异类型和原产砀山的地方品种、杂交种;第2类包括雪花梨、鸭梨、紫酥、慈梨、早美酥、丰水、新高,白梨和砂梨聚在了一类;第3类包括库尔勒香梨、红香酥;南果梨、红巴梨、杜梨各为一类。与砀山酥梨相比,砀山酥梨的8个营养系变异类型均扩增出了特异带,特异条带出现的数量为5～15条不等。说明安徽砀山酥梨自然保护区梨种质资源遗传多样性丰富;砀山酥梨8个营养系变异类型均在DNA水平发生了不同程度的突变。     

DNA sequencing reveals false positives during the detection of aster yellows phytoplasmas in leafhoppers

During the summer of 2001 and 2002, 850 and 865 carrot plants and 926 and 2584 leafhoppers associated with aster yellow (AY)-type disease were collected from five fields in Manitoba, Canada. DNA was extracted from 999 individual leafhoppers and 381 leaf tissues from both apparently healthy and AY-like infected carrot plants. All DNA samples were examined by PCR for the presence of phytoplasmas using three universal primer pairs P1/P6, P1/P7 and R16F2n/R2 derived from phytoplasma rDNA sequences. DNA amplification with these three primer pairs generated the expected amplification products of 1.7, 1.5 and 1.2 kb, respectively. Diluted PCR products obtained using universal primer pair P1/P6 were nested with R16F2n/R16R2n. The latter set of primers amplified DNA samples from 92 carrot plants and 83 leafhopper samples. In order to assess the diversity among insect and plant phytoplasmas, nested PCR products from all 92 carrot and 83 leafhopper samples were subjected to RFLP analysis using restriction endonucleases KpnI, MseI, and HhaI. This RFLP analysis showed similar patterns among carrot and leafhopper samples. Phytoplasmas detected in most samples belonged to the subgroup 16Sr-IA. To understand why the R16F2n/R16R2n of primers did not amplify the PCR product obtained from the first PCR in the remaining samples, four PCR products of P1/P6 from two plants (representing 16Sr-IA and 16Sr-IB) and two leafhopper samples that did not amplify with nested PCR, were used for DNA sequencing. ¹ The BLAST analysis of the obtained sequences showed that the PCR amplicons from the two carrot samples precisely matched with the GenBank sequences of known phytoplasmas. Alignments of these two sequences have shown very slight variations (transition/transversion ratio mean of 0.539) that would correspond to the minor differences at the 16S level between the 16Sr-IA and 16Sr-IB phytoplasma subgroups. The sequences of PCR products obtained from the two insect samples had similarity (>98%) with the sequences of phytoplasma in carrot except that their length differed from the carrot samples by 6 bp. They actually matched bacterial sequences from the GenBank, indicating that a single PCR using P1/P6 was not enough to detect phytoplasma in leafhoppers.     

不同引物组合对中国杏品种资源S基因特异扩增效果比较

 利用已报道的5对蔷薇科李属通用引物组合对起源于我国的30个杏(Prunus armeniaca L.)品种进行了S等位基因的专一性PCR扩增（S-allele specific PCR），并依据扩增系数和扩增成功率两个指标对扩增效果进行了评价。结果表明：①不同的引物组合对参试杏品种的扩增系数和扩增成功率差异很大，其中引物组合EM PC2consFD+EM PC3consRD扩增系数和扩增成功率均为最高（66.7%和53.3％），效果最好；②引物组合EM PC2consFD+EM PC3consRD对‘华县大接杏’和‘猪皮水杏’未能扩增出任何条带，而PruC2+PruC4R和PaConsⅡ F+PaConsⅡ R两对组合却能对其扩增出两条带；此外，5对组合均没有对‘兰州大接杏’和‘白木杏’这两个品种扩增出任何条带，表明要对中国杏品种资源的S基因型进行全面、准确鉴定，除了采用不同的引物组合外，还需要根据中国杏的S基因序列进一步开发、设计新的专用引物；③ EM-PC2consFD+EM PC3consRD和PruC2+PruC4R两对组合对‘红丰’、‘新世纪’、‘红荷包’和‘二花槽’等4个品种的扩增结果表明，依据本试验所提出的扩增系数和扩增成功率两个指标评价不同引物组合的扩增效果是有效的。     

菜薹种质遗传多样性的荧光MFLP标记分析

采用M13通用接头连接锚定引物,建立了适合于菜薹的荧光微卫星锚定片段长度多态性（MFLP）技术;在此基础上,从360对选择性扩增引物组合中筛选出9对适宜的引物组合,对收集的32份菜薹种质进行等位基因多态性分析;结果显示这些引物组合的扩增产物在32份菜薹种质中的等位基因多态性在10 ~ 31之间,平均为17.7个;多态性信息量在0.61 ~ 0.98之间,平均0.81。利用获得等位基因多态性进行的遗传相似性分析表明,32份菜薹种质间的相似系数在0.277 ~ 0.836之间,平均0.624;基于多态性数据,运用除权配对法（UPGMA）进行聚类分析,将这些菜薹种质材料分为2个组群和4个亚群。这些结果显示荧光MFLP标记技术能有效地发现供试菜薹种质材料的DNA多态性,表明该技术在菜薹遗传特性分析的研究和应用领域具有可行性。     

高羊茅EST-SSR标记开发及遗传多样性分析

采用从其他作物转移与利用自身EST序列设计两种方法为高羊茅（Festuca arundinacea L.）开发EST-SSR分子标记,并利用所开发标记对高羊茅品种（系）进行遗传多样性分析。利用来自小麦、大麦、玉米、高粱和水稻的732对EST-SSR在高羊茅上进行通用性分析,得到406个有效的扩增引物对（55.46%）。利用高羊茅EST数据库（GenBank/dbEST）中63 853条EST序列进行微卫星序列的查找,共发现包含微卫星的EST序列420条,占整个EST总数的0.658%。其中三核苷酸基序出现频率最高（43.33%）,次之为二核苷酸基序（33.57%）。二核苷酸基序以CT/GA出现频率最高（16.90%）,三核苷酸基序以CAG/GTC出现的频率最高（10.63%）。进一步运用Primer 5.0软件设计了108个引物对,并交上海桑尼公司合成。PCR检测表明,92个引物对（85.19%）在高羊茅中均可以扩增出稳定清晰的带型。从498对（其中5种作物的406对,高羊茅的92对）有效扩增的EST-SSR引物中随机选取81对引物,对12个高羊茅品种（系）进行扩增。79个引物对显示出多态性（97.53%）。共检测到133个等位变异,平均每对引物有1.68个等位变异;多态性信息含量（PIC）值最高为0.66,最低为0.14,平均为0.48。聚类分析结果表明,12份材料在相似系数为0.61处可分为5大类：第Ⅰ类为‘爆发力’和‘法思’;第Ⅱ类为‘强劲’、‘家园’和‘翠碧A’;第Ⅲ类为‘可其思3号’和‘凌志’;第Ⅳ类为‘雅典娜2号’、‘美洲虎3号’、‘火凤凰’和‘TF160’;‘球道’单独为第Ⅴ类。     

杏叶片DNA提取和荧光AFLP反应体系的建立

以杏嫩叶为材料,利用改进的CTAB法,提取到高质量的杏叶片总DNA,通过优化酶切、连接、预扩增、选择性扩增等试验条件,建立了高效稳定的杏荧光AFLP反应体系;筛选出多态性好的12对引物组合,均获得稳定、清晰的扩增图谱,可进行杏品种鉴定、种质资源的遗传多样性和亲缘关系分析等研究。     

Genomic instability of spontaneously hypertensive rats

AIM:To assess the genomic polymorphism of spontaneously hypertensive rats (SHR) by using random amplified polymorphic DNA PCR (RAPD-PCR). METHODS:The DNA of WKY rats and SHR was amplified with RAPD-PCR using 100 single primers. The PCR products were resolved with electrophoresis on agarose gel and stained with ethidium bromide. RESULTS:Thirteen of the 100 single primers resulted in genomic polymorphism. In the RAPD method, genetic alterations appeared as either loss or gain of a band, shift of a band, or decrease or increase in intensities of a band of SHR DNA relative to WKY rat tissue DNA. The other primers produced amplification products were not different in two groups. CONCLUSION:It is suggested that SHR present genomic polymorphism. RAPD-PCR is an effective technique to detect genomic polymorphism in SHR.      

甜瓜杂交种SSR指纹图谱的构建

以2个甜瓜杂交品种(系)的种子东方蜜1号和01-31为试材,从63对SSR引物中筛选出10对扩增产物具有稳定多态性的引物,这些引物分布在甜瓜整个基因组,每对引物可以检测到2～4个数目不等的多态性片段(allele),共27个多态性片段,平均为2.7个,片段大小介于85￣270bp之间,并从入选的10对SSR引物中选出7对构建了这2个甜瓜杂交种的指纹图谱。在比较分析各试材图谱的基础上,探讨了品种指纹图谱的统计学方法,并对构建的2个甜瓜杂交种的指纹图谱进行了可信度分析,建立了适于种子检验中使用的标准SSR标记指纹图谱。实验表明,利用SSR技术进行甜瓜杂交种的纯度鉴定是可行的、有效的。