链霉菌几丁质酶基因分子检测、克隆及原核表达

随着分子生物学的发展,近几年生物防治分子水平的研究也发展很快,在植物抗性基因和病原菌无毒基因的鉴定与分离、真菌酶抑制剂、抗真菌蛋白质等方面取得了很大进展。在抗真菌蛋白方面, 报道最多的是几丁质酶,它催化几丁质的水解,从而破坏植物病原真菌细胞壁的主要组分。链霉菌是一类重要的天然抗生素和几丁质酶生产菌,能分泌多种胞外酶,如纤维素酶、几丁质酶和木聚糖酶等,以分解和利用土壤环境中的多种有机质。本试验建立的PCR分子检测方法,可以从土壤细菌中直接筛选产生几丁质酶的链霉菌菌株,发掘几丁质酶资源。在此基础上克隆了一株链霉菌菌株的几丁质酶基因,并在大肠杆菌中进行了表达。     

哈茨木霉对接种尖孢镰刀茵后黄瓜根系次生代谢物的影响

采用室内筛选与田间试验相结合的方法,对哈茨木霉抑制黄瓜枯萎病菌的拮抗机制进行了研究.对峙培养结果显示木霉菌和病原菌之间形成了较明显的抑菌圈,其中菌株TN对枯萎病菌抑制作用较强.接种木霉菌植株显著提高了植株中肉桂醇脱氢酶（CAD）、多酚氧化酶（PPO）、愈创木酚过氧化物酶（G-POD）、咖啡酸过氧化物酶（CA-POD）和绿原酸过氧化物酶（CGA-POD）的活性及总酚、类黄酮、木质素的含量.接种木霉菌可诱导根系次生代谢相关基因的上调表达,C4H、CAD、CCOMT、G6PDH、PAL和PR-1的表达量分别为对照的 5.64、5.31、4.28、15.33、7.36 和 6.45 倍.表明木霉菌诱导的黄瓜根部对枯萎病的抗性与植物次生代谢密切相关.     

豇豆几丁质酶纯酶液对不同真菌的作用

几丁质酶(EC 3.2.1.14)广泛存在于植物中,当受到病原菌侵染或其它诱导因子诱导时,植物体内几丁质酶活性显著提高。菜豆纯几丁质酶具抗Trichoderma viridae活性,转菜豆几丁质酶基因的烟草植株增强了对Rhizoctonia solani的抗性。作者研究了经诱导、提纯的豇豆几丁质酶对不同真菌的作用,为开展抗真菌病基因工程研究奠定了基础。 1 材料与方法     

哈茨木霉对黄瓜尖孢镰刀菌的抑制作用和抗性相关基因表达

采用室内筛选与田间防效相结合的方法,对哈茨木霉抑制黄瓜尖孢镰刀菌的拮抗机制进行了研究。对峙培养结果显示,木霉菌和病原菌间均形成了较明显的抑菌圈,对病原菌的抑菌率达66.7%~85.8%,其中菌株TG、TM对枯萎病菌抑制作用较强。木霉菌可有效提高根系对病原菌的抗性,黄瓜植株接种枯萎病菌后,根系细胞大量死亡,而先接种木霉菌再接种病原菌后则减小了对根系的伤害。田间防效试验结果表明,TG和TM孢子悬浮液浓度在108个/mL时防效最好,分别为54.9%和49.4%。接种木霉菌植株根系抗性基因的表达量均高于对照植株,呈双峰趋势。在第6天时抗性基因表达量最高,WRKY6、MYB、PR-1、PAL、GST和GLU的表达量分别为对照的5.15、5.22、6.07、6.00、3.16、和16.15倍。表明木霉菌通过激活与胁迫相关的基因表达提高了对病原菌的抗性。     

pHBA对菜心炭疽病的诱导抗性及植株生理特性的影响

 以菜心品种为材料,设置不同浓度对羟基苯甲酸(pHBA)处理,并通过人工接种炭疽病菌,研究pHBA对菜心炭疽病的诱导抗性作用机理。结果表明,在菜心生长发育过程中根系可以分泌出pHBA。pHBA对菜心的生长、产量形成和炭疽病的发生有明显的影响。适宜浓度的pHBA处理可促进菜心生长,提高植株对炭疽病的抗性,显著地降低病情指数(DI),提高菜薹产量,但当pHBA积累到一定浓度时,就对菜心植株产生自毒作用,提高DI和降低菜薹产量。炭疽病菌的感染破坏了植株细胞膜,增强细胞膜透性水平,诱导产生病程相关蛋白(几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶)和细胞壁物质(木质素、富含羟脯氨酸糖蛋白(HRGP))。适宜浓度的pHBA处理可抑制炭疽病菌对细胞膜透性的伤害,加强诱导提高几丁质酶活性、β-1,3-葡聚糖酶活性、木质素含量和HRGP含量,引起细胞壁木质化加强,增加了菜心植株对炭疽病的诱导抗病能力,从而阻止病原菌进一步侵入和扩散,抑制炭疽病菌对菜心产量造成的损失。     

百日草炭疽病病原菌的分离鉴定及防治药剂筛选

为明确百日草炭疽病的病原菌,依据柯赫氏法则,对采集的病叶进行病原物分离并进行分离菌株致病性试验。确定菌株的致病性后,结合菌落形态,初步判断其为炭疽菌。运用分子生物学方法,扩增获得肌动蛋白基因 (actin gene, ACT)、几丁质合酶基因 (chitin synthase A gene, CHS)、磷酸甘油醛脱氢酶基因 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、核糖体内部转录间隔区 (ribosomal internal transcribed spacer, ITS)、锰超氧化物歧化酶 (manganese-superoxide dismutase, SOD2)、谷氨酰胺合酶 (glutamine synthatase, GS)、微管蛋白 (beta-tubulin-TUB2) 以及钙调蛋白 (calmodulin, CaM ) 8个基因序列,进行联合系统发育分析,确定该菌为暹罗刺盘孢菌Colletotrichum siamense。离体抑菌活性测定结果表明,9种杀菌剂制剂75%肟菌 ? 戊唑醇水分散粒剂、35%氟菌 ? 戊唑醇悬浮剂、75%百菌清可湿性粉剂、250 g/L嘧菌酯悬浮剂、50%咪鲜胺可湿性粉剂、10%苯醚甲环唑水分散粒剂、10%丙硫菌唑悬浮剂、500 g/L氟啶胺悬浮剂和25%溴菌晴可湿性粉剂对供试病原菌的EC₅₀值分别为0.152、0.407、2.48、252、0.0342、0.556、317、0.00291和27.4 mg/L,其中500 g/L氟啶胺悬浮剂和50%咪鲜胺可湿性粉剂抑菌活性最强。     

哈茨木霉几丁质酶诱导及其对水稻纹枯病菌的拮抗作用

 在实验室条件下分别以几丁质和水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)细胞壁作唯一碳源诱导哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌株NF9、TC3和P1产生几丁质酶,用硫酸铵沉淀法制备几丁质酶粗提液。上述木霉菌株内切几丁质酶活性(对胶体几丁质浑浊度的减少率)分别为79.8%、74.4%和76.0%,均显著高于非诱导的阳性对照。培养第5 d几丁质诱导的木霉菌株NF9和TC3内切几丁质酶活性显著高于由水稻纹枯病菌细胞壁诱导的酶活性。体外测定表明,通过诱导的木霉菌株TC3、NF9和P1几丁质酶粗提液对水稻纹枯病病菌的拮抗圈直径可达38、21和23 mm,与非诱导的阳性对照比较有显著性差异。对木霉几丁质酶拮抗作用的特点及生防应用进行了讨论。     

大批量生产百日草链格孢菌孢子的技术

通过研究光照、菌丝体粉碎、培养基等因素对百日草链格孢菌孢子形成的影响，试图探寻大批量生产该菌孢子的条件和方法。结果显示，低氮培养、近紫外光照射、适当适时的菌丝体粉碎能诱导百日草链格孢菌形成大量的孢子。在上述条件下，应用液体发酵培养菌丝体，结合固体培养诱导孢子，是一种可行的方法。     

球孢白僵菌定殖提高番茄对灰霉病抗性及其作用机理

为明确球孢白僵菌Beauveria bassiana定殖对番茄植株抗病性的影响及作用机理,采用灌根法将球孢白僵菌芽生孢子悬浮液接种于番茄植株内,并通过人工接种灰霉菌Botrytis cinerea评价球孢白僵菌定殖后番茄对灰霉病的抗性水平;检测灰霉菌胁迫下番茄植株不同位置叶片内球孢白僵菌的相对含量;测定番茄叶片内草酸氧化酶（oxalate oxidase,OXO）、几丁质酶（chitinase,CHI）和ATP合成酶（ATP synthase,atpA）3种抗病相关基因的表达量。结果表明,球孢白僵菌定殖能够提高番茄植株对灰霉病的抗性,接种灰霉菌第5天,番茄植株发病率、病斑直径和病情指数分别下降了61.6%、41.4%和26.4%;在灰霉菌胁迫下番茄植株内球孢白僵菌偏好于在病原菌感染位置定向聚集,并且引起植物抗病基因OXO、CHI和atpA的表达量上调。表明球孢白僵菌能通过内生定殖与植物互作提高植物抗病性,在植物病害生物防治领域有较大应用潜力。     

棉花黄萎病原真菌菌体对链霉菌4 种胞外水解酶活性的影响

 以大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb. )菌体为唯一碳源,采用液体培养法测定供试病原菌菌体对4 株拮抗链霉菌胞壁水解酶合成的诱导作用;采用平皿气生菌丝水解和显微观察法验证4 株拮抗链霉菌对大丽轮枝菌菌丝的溶解作用。结果表明:①大丽轮枝菌菌体可以诱导供试链霉菌合成几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶及滤纸纤维素酶;当菌体添加量为10 g·L - 1 ,28℃ 培养7 d 时,上述4 种诱导酶活性可达峰值,其值分别为70. 13 - 129. 05、31. 04 - 37. 34、6. 24 -8． 75 及1. 84 - 3. 35 U。②链霉菌粗酶液对大丽轮枝菌菌丝有溶解作用。③4 株链霉菌菌丝均可缠绕在大丽轮枝菌菌丝上,并在缠绕处使病原菌菌丝溶解。