花粉管通道介导的抗除草剂基因(bar)对大豆的遗传转化

采用花粉管通道介导法将含有bar基因的pPTN140质粒DNA导入8个黑龙江省大豆主栽品种（系）,导入1384朵花,共获得1164粒种子,经2次Basta除草剂筛选后共获得3个品种的除草剂抗性植株8株.对其进行PCR以及PCR-Southern杂交检测均为阳性结果,Southern杂交结果显示,8个除草剂抗性后代植株整合数目不同,其中2株整合单拷贝基因,另外6株分别整合3～8个拷贝的bar基因.对8个抗性植株的后代进行了除草剂抗性分析,D1-D3代均出现除草剂抗性植株,表明bar基因可以在转基因植株后代中遗传,抗性遗传分析结果表明不同株系间以及株系内除草剂抗性缺乏规律性,分离比率不符合孟德尔遗传规律.说明大豆花粉管通道法转化基因存在多拷贝共抑制现象.目前获得除草剂抗性稳定的D3代株系82个.试验说明利用花粉管通道技术进行大豆转化是可行的.     

利用双T-DNA载体系统培育无选择标记转基因大豆

利用PCR和Southern杂交检测了161株转△^6-脂肪酸脱氢酶基因（D6D）的T1代植株,初步筛选出只含有功能基因（D6D）而不含有筛选标记基因（bar）的转基因大豆植株9株,为获得富含γ-亚麻酸但不含选择标记基因的转基因大豆奠定了基础,并为转基因大豆的安全性种植提供了保障。同时对无标记基因的转基因植株进行了叶片涂抹除草剂验证,探讨了叶片涂抹除草剂结合目的基因PCR检测筛选无选择标记转基因植株的可行性。     

GmAOC3基因转化载体构建及转化大豆的初步研究

选用内切酶SacⅠ和MluⅠ切割目标基因和载体,构建了携带bar基因的重组载体p BA002-Gm AOC3,选用2个大豆品种(Jack和南农88-1)和2种外植体(子叶节和整个子叶节),研究大豆品种和外植体对根癌农杆菌介导的子叶节转化Gm AOC3基因的影响。结果表明:外植体为整个子叶节的大豆品种Jack的出芽率和转化率最高,分别为79.5%和2.27%。经Quick Stix PAT/bar基因试纸条检测、目标基因的分子检测和草丁膦抗性鉴定,共得到转Gm AOC3基因的T0代阳性株系3株,T1代阳性转基因大豆6株,其中5株以Jack品种为受体的转基因大豆Gm AOC3基因的表达量均显著高于非转基因植株,荧光定量拷贝数检测结果显示,4株转基因单株为单拷贝,2株为双拷贝。     

转hrpZ_(Psta)大豆株系的分子检测和抗性分析

为考察转基因大豆株系JN27-119-21后代中hrpZ_(Psta)外源基因的遗传稳定性、检测JN27-119-21后代的抗病能力,从而为培育抗疫霉根腐病的大豆新品种提供理论参考,以转hrpZ_(Psta)基因大豆株系JN27-119-21的T_7、T_8代为供试材料,通过PCR和Southern Blot分子生物学检测方法和下胚轴侵染法鉴定转基因株系后代抗疫霉菌能力。研究结果表明:外源hrpZ_(Psta)基因在高世代转基因株系中能够稳定遗传,hrpZ_(Psta)基因已被成功整合到大豆受体吉农27的基因组中,且整合方式为单拷贝,整合位点不同。hrpZ_(Psta)基因在转化株系的根、茎、叶中均有表达,T_7代平均相对表达量分别为2.877,1.336和7.734,T_8代平均相对表达量分别为3.612、1.746和8.627,2个世代相对表达量水平均为叶根茎。转基因株系后代对疫霉根腐病的抗病级别为抗性,而受体株系为中抗,抗病能力明显提高。     

转WYMV-Nib8基因抗黄花叶病小麦的鉴定及优良株系的选育

小麦黄花叶病是我国冬麦区亟待解决的重要病害之一。为了给应用病毒复制酶基因介导的转基因抗病小麦新品种（系）选育提供依据，对利用基因枪法将WYMV-Nib8基因和bar基因共转化扬麦158获得的15个T2代株系进行了黄花叶病抗性鉴定，筛选出4个高抗病株系和1个剔除bar基因的高抗病株系；连续多年抗病性鉴定结果表明，通过转基因技术获得的5个株系不但抗病性优良而且可以稳定遗传。以转基因材料为亲本之一，通过常规杂交、回交获得1个兼抗小麦黄花叶病和白粉病且农艺性状优良的新品系BR1014。     

利用qPCR法检测OsPIMT1转基因水稻中的外源片段拷贝数

水稻转化过程中,多个拷贝数整合到基因组中影响遗传稳定性和基因表达。传统的Southern杂交检测法鉴定费时费力,不适合目前高通量和自动化的检测要求。因此研究通过比较定量除草剂草铵膦抗性基因(bar)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH2,建立了基于实时荧光定量PCR的拷贝数检测法。利用此体系对9个独立的异天冬氨酸甲基转移酶OsPIMT1转基因T0代植株进行了荧光定量分析,其中6个为单拷贝,3个为双拷贝,经过Southern杂交和分离比分析验证,表明该方法能够快速,准确的鉴定水稻含有草铵膦抗性基因的水稻转基因植株。     

转TaDREB3基因大豆的品质等同性分析

将抗逆基因TaDREB3转入大豆品种东农50,得到3个稳定遗传的株系,并将T4代株系种子播于大田中。对3个转TaDREB3基因株系及非转基因对照株系的种子分别进行蛋白质含量、油份含量、脂肪酸含量、异黄酮含量等品质性状的等同性分析,研究转化外源基因TaDREB3后大豆原有品质性状是否有改变。结果表明：3个转基因株系和对照植株相比,蛋白质含量、油分含量和脂肪酸含量均没有显著性差异;转基因株系1的大豆黄素虽然和对照差异显著,但是异黄酮总含量和对照没有显著性差异。说明TaDREB3基因的导入并没有改变大豆的品质性状。     

双T-DNA表达载体转化大豆的研究

利用含有筛选标记基因和目的基因△6-脂肪酸脱氢酶基因的双T-DNA共转化表达载体pLIN61,经农杆菌EHA101介导,采用子叶节转化法转化大豆,使用除草剂Glufosinate作为筛选剂,获得了一批携带有玻璃苣△6-脂肪酸脱氢酶基因的转基因大豆,转化效率为2.0%,共转化频率及实际转化率分别为56.25%、1.12%.PCR检测和Southern杂交结果证明,玻璃苣D6D已经整合到大豆的基因组上.RT-PCR检测结果显示,玻璃苣△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因大豆的转录水平上得到了表达.     

高赖氨酸蛋白基因导入小麦的研究

为了培育高赖氨酸含量的小麦新材料,利用基因枪转化法将辣椒高赖氨酸蛋白Cflr基因导入到小麦品种扬麦16中,轰击了2 500枚小麦幼胚,获得抗除草剂Basta的再生植株176株(遗传转化采用的筛选标记基因为bar基因),经PCR鉴定Cflr基因阳性的转基因植株为23株.T1代幼苗喷洒130 mg·L-1的Basra溶液进行除草剂抗性鉴定,发现T1代幼苗的除草剂抗性出现了分离.PCR-Southern杂交进一步证明外源高赖氨酸蛋白基因Cflr基因已经整合到小麦的基因组中.通过种子赖氨酸含量和总蛋白质含量的测定,发现75.00％的转基因株系的赖氨酸含量高于受体扬麦16,77.78％的转基因株系的蛋白质含量高于受体扬麦16.本试验获得了一批赖氨酸含量提高的小麦转基因株系,这些高赖氨酸含量的转基因株系可进一步用于小麦高赖氨酸分子育种研究.     

大豆对大豆花叶病毒SC18株系的抗性遗传和基因定位

大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,SMV)病是我国大豆生产上的一种主要病毒病害,SMV株系SC18是我国东北和南方两大产区的优势株系,在黄淮大豆产区亦零星发生。本研究对5个抗×感杂交组合衍生后代分离群体接种SC18后,发现各组合F_1均抗病,F_2表现3∶1(抗∶感)分离比,F_(2∶3)表现1∶2∶1(抗∶分离∶感)的分离比,表明5个抗病亲本(中作00-683、滨豆95-20、东大2号、中品661和RN-9)对SC18的抗性由一对显性基因控制。抗×抗杂交组合"中作00-683×东大2号"衍生后代分离群体接种SC18,F_2出现15∶1(抗∶感)的分离比,表明中作00-683与东大2号可能各携带一对显性基因,控制对SC18的抗性,且独立遗传;抗×抗杂交组合"中作00-683×滨豆95-20"的F_1、F_2和F_(2∶3)在接种SC18后均未检测出感病株,表明中作00-683与滨豆95-20所携带的对SC18的抗性基因是等位的。利用RN-9×7605重组自交家系将RN-9对SC18的抗病基因Rsc18定位到大豆6号染色体(C2连锁群)SSR标记Satt286和Satt277之间,遗传距离为6.12和4.69 cM。     

大豆对大豆花叶病毒病抗性的研究进展

大豆花叶病毒病是我国大豆生产上的最主要病害之一,在我国东北、黄淮及南方大豆产区普遍发生,严重降低大豆产量和品质。我国不同学者曾将江苏、东北、湖北及山东等地的SMV株系做过局部划分。为促进大豆抗病育种研究成果的交流和种质的交换,南京农业大学国家大豆改良中心从不同类型种质资源和国内外鉴别系统中筛选出10个鉴别能力强、反应稳定的鉴别寄主,将我国大豆产区25个省(市)的SMV划分为22个株系;通过不同病毒分离物的全基因组序列分析,发现大豆花叶病毒和菜豆普通花叶病毒基因组重组形成的SMV新类型;从种质资源中发掘出广谱抗源科丰1号和齐黄1号等优异抗源;发现其对15个株系的抗侵染作用分别由单显性基因控制;将15个抗侵染基因定位在大豆2、6、13和14号染色体上,完成Rsc3、Rsc4、Rsc6、Rsc7、Rsc8、Rsc13、Rsc14、Rsc15、Rsc17、Rsc18等抗性基因的精细定位,发现抗性基因成簇存在;证明抗病、系统坏死、系统花叶3类症状由一组复等位基因控制;发现大豆对SMV存在数量抗性(抗扩展),它由一对加性主基因+加性-显性多基因共同控制;利用分子标记辅助选择,聚合3个抗源品种、3条染色体上的多个抗性基因,创造了兼抗20个株系的新种质;利用基因干扰原理,完成了SMV基因HC-Pro和CP及隐性大豆抗病基因eIF4E的遗传转化,在阳性后代中获得一批优异抗性材料。     

转cry 1Iem基因大豆的培育及抗虫性检测

以大豆子叶节为外植体,应用农杆菌介导法,将抗虫(cry1Iem)基因转化大豆.筛选标记为bar基因.经Glufasinate筛选,获得大量抗性植株.对转基因T_0、T_1、T_2代植株进行PCR检测,初步证明cry1Iem基因已经整合到大豆基因组中.对T2代PCR阳性植株幼嫩豆荚,采用圆盘分隔法接人初孵幼虫,进行初步的抗虫性检测,得到1株具有明显抗虫效果和7株抗虫效果较好的转基因植株.     

子房滴注法将GUS基因表达框转入大豆的研究

为了验证大豆子房滴注转化方法的可重复性与遗传稳定性,将由报告基因GUS、表达调控序列(35S肩动子,NOS终止子)和T-DNA边界序列3部分组成的基因表达框转入大豆.对T0代转化材料进行GUS组织化学染色分析和PCR检测.结果表明:在检测的340个幼胚中有12个呈GUS阳性,且在180个转化植株中有6个呈PCR阳性同时其叶片也呈GUS阳性,转化率分别为3.53%和3.33%.Smthern杂交表明外源GUS基因表达框以低拷贝的形式整合到大豆基因组中对转基因后代叶片GUS染色、PCR分析及Northern blot检测结果表明外源基因已遗传给了后代,其中S2株系符合盂德尔分离规律.     

转NPR1和CHR3抗病基因提高大豆对疫霉根腐病抗性研究

为检测GmCHR3和广谱抗病基因NPR1双抗基因转化到大豆吉林30中的遗传稳定性和抗病能力,从而为培育出抵抗疫霉根腐病大豆新品种提供有效参考,以大豆品种吉林30转CHR3抗病基因转化品系JL30+GmCHR3为目标受体材料,以吉林30为对照受体材料,利用农杆菌介导法将NPR1导入受体中.利用常规PCR检测基因转化情况,利用Southern杂交和qRT-PCR技术分别鉴定JL30+GmCHR3受体和双抗基因转化株系T1和T2代中两个基因的整合和表达情况,采用下胚轴侵染法鉴定转基因大豆植株对疫霉根腐病的抗性.PCR研究结果显示:转化元件的启动子35s、终止子Nos、筛选标记基因Bar以及目的基因NPR1全部转入到受体基因组中;NPR1基因以单拷贝的形式在转化植株中完成整合;NPR1基因在大豆植株根、茎和叶中均有表达,其中T1代株系在3个部位的相对表达量分别是2.732,1.614和3.316,T2代株系的相对表达量分别是2.936,2.084和3.864;NPR1基因在各组织中的相对表达量为茎＜根＜叶.CHR3和NPR1双抗基因转化株系对疫霉根腐病表现为高抗,NPR1单抗基因转化株系表现为中抗,非转基因吉林30植株表现为感病.结果说明大豆吉林30转入双价抗病基因GmCHR3和NPR1可以增强其对疫霉根腐病的抗性.     

花生FAD2基因RNAi载体转化及转基因籽粒脂肪酸分析

在构建了以花生△12脂肪酸去饱和酶（FAD2）基因自身启动子驱动、有内含子间隔的该基因编码序列反向重复片段的RNA干扰载体的基础上,对上述干扰载体进行了农杆菌介导的花生胚小叶的遗传转化,以期特异调控花生籽粒中油酸、亚油酸含量。 在2个受体品种中获得105株抗性再生植株,用两对引物对其进行了PCR扩增,其中32株初步证实为转基因植株。采用近红外分析仪对转基因T1籽粒油酸和亚油酸含量的检测表明,转基因株系内油酸/亚油酸比值的变异高于对照,多数转基因株系油酸亚油酸比值平均数也显著高于对照。     

几个转bar基因水稻外源基因的遗传学行为研究

利用春江03等4个品种的转基因株及后代稳定系进行遗传研究表明,bar基因作为一个显性单位已整合在水稻核基因组中,转基因株稳定系TR3、TR4、TR5、TR6对除草剂Basta的抗性均受1对显性基因控制,且4个转基因株稳定系间bar基因互不等位,不同位点的bar基因之间存在基因互作,表现为基因重叠作用。Southern杂交分析结果表明,TR5、TR6的bar基因整合位点互不相同,但可通过杂交育种重组到同一个水稻核基因组中。     

大豆花叶病毒病的抗性研究进展

近几年来大豆对大豆花叶病毒病的抗性研究侧重于三个方面:1.筛选抗性基因并应用于抗性遗传与育种研究;2.研究不同抗源的抗性基因的遗传模式及其关系;3.通过SMV的外壳蛋白基因序列分析来鉴定株系及病毒蛋白酶的作用。     

共转化法获得无筛选标记的转PEPC、PPDK基因水稻恢复系纯合体

用根癌农杆菌共转化的方法将pSB130/CK质粒[目的基因磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)、磷酸丙酮酸二激酶基因(PPDK)与筛选标记潮霉素抗性基因HPT分别构建于2个T-DNA区]导入水稻恢复系R299,经PCR、Southern检测,筛选到T0代13个转基因植株。对T1～T3代转基因后代进行PCR跟踪鉴定,分离出无潮霉素抗性基因的转基因植株(PEPC PPDK HPT-),分离株系比率为15%～21%,分离株系中PEPC PPDK HPT-型单株分离频率为7.2%～10.0%。在T3代成功获得了无筛选标记的转基因纯合系3个(06D351,06D352和06D353),PEPC酶活性和光合速率分析结果表明,其PEPC活性比对照提高了1.5～4.9倍,光合速率提高了19%～40%,说明这些转基因纯系材料在水稻高光效育种上具有很大的应用价值。     

HSSP基因植物表达载体构建及其对大豆的遗传转化

大豆中含硫氨基酸匮乏,限制了大豆的营养价值和商业价值。为了提高大豆的含硫氨基酸含量,利用人工设计合成的高含硫氨基酸贮藏蛋白基因(HSSP)转化大豆。以载体p TF101.1为骨架,构建植物表达载体p TFGS,利用农杆菌介导法转化大豆品种东农50,经PCR及试纸条检测,获得转基因大豆16株,基因的转化效率为1.94%。对转基因大豆株系GSDL5进行组织特异性分析,结果表明,HSSP基因在种子中超量表达,而在其它组织部位仅有微量表达。采用接头PCR方法对株系GSDL5基因组插入位点侧翼序列进行克隆,获得与大豆基因组序列匹配的436 bp侧翼序列,HSSP基因插入2号染色体基因的非编码区。经研究,获得了遗传背景明确的,仅在大豆种子中超量表达HSSP的转基因株系GSDL5。     

大豆高代抗虫转基因后代分子检测与抗蚜虫鉴定分析

采用PCR扩增对大豆抗虫转基因高代株系目的基因进行检测,并通过生物鉴定的方法检测转基因后代抗虫性.结果表明:在共转化的3个目标基因中,含有单基因植株共409株,双基因179株,三基因36株,占所检测植株总数的百分比分别为37.8%、17.0%和3.4%;含有单个pta基因的植株数量最多,为239株,占检测植株总数的22...