意大利蜜蜂amPGI基因的克隆与表达分析

葡萄糖-6-磷酸异构酶（PGI）是糖酵解和几丁质合成途径中一种发挥重要作用的蛋白酶,为了探究意大利蜜蜂amPGI基因的分子特征及其在不同品级、不同发育时期的表达情况,采用RT-PCR技术克隆意大利蜜蜂葡萄糖-6-磷酸异构酶基因（amPGI）,应用生物信息学方法分析其序列特征;进一步通过 RT-qPCR技术检测amPGI基因在意大利蜜蜂不同品级、不同发育时期的表达模式。结果显示,克隆获得amPGI基因序列全长1 674 bp,共编码557个氨基酸。序列分析发现,amPGI与大蜜蜂PGI氨基酸序列相似度达到 96.3%,蛋白结构以α-螺旋为主,且含有2个保守结构域和9个磷酸化位点,是一种结构稳定的非分泌型的亲水性胞内蛋白。表达模式显示amPGI基因在意大利蜜蜂不同品级、不同发育时期均有表达,且差异显著 （P<0.05）,工蜂中幼虫期5日龄表达量最高,雄蜂中成虫期表达量最高,蜂王中幼虫期6日龄表达量最高,不同品级卵前期和蛹期表达量均较低,且卵的孵化和蛹的羽化过程中amPGI基因表达量都急剧增加。综上推测amPGI基因在意大利蜜蜂精巢和卵巢的发育及几丁质的合成过程中具有重要作用。     

生长激素诱导的跨膜蛋白基因(GHITM)在东方蜜蜂(Apis cerana)幼虫不同发育阶段的相对表达分析

蜜蜂社会中,工蜂与蜂王基因型相同但由于基因的表达差异、表观遗传差异及营养控制等因素造成工蜂和蜂王表型有很大的不同。GHITM基因是参与家蚕蜕皮与变态发育的pgdr基因的直系同源物,但关于其在蜜蜂中的研究目前未见报道。本研究利用实时荧光定量PCR技术研究了此基因在东方蜜蜂工蜂蛹和幼年工蜂以及蜂王蛹期的mRNA相对表达量,目的是为了探究GHITM基因在东方蜜蜂级型分化分子机理及预测可能由该基因产生的蜜蜂成虫的行为。结果表明:在工蜂蛹及工蜂成虫中GHITM基因表达量随日龄而增加;在蜂王蛹中GHITM的表达量从封盖蛹到2日龄蛹中呈下降趋势,2日龄后表达量随日龄增加。本研究结果可为东西方蜜蜂基因表达差异及级型分化分子水平的研究和GHITM基因功能的研究提供一定的理论依据。     

意大利蜜蜂（A.m.ligustica）雄蜂卵期发育蛋白质组分析

【目的】对原种意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica Spinola,1806)（意蜂）雄蜂的3 d卵期发育进行蛋白质组研究,以探明该蜂种雄蜂卵期蛋白质表达调控方面的一些特点,从而揭示其发育的分子机理。【方法】采用双向电泳法对意蜂雄蜂卵期蛋白质组进行研究。【结果】3 d的卵期发育中,按顺序分别检测到200、242、233个蛋白,这些蛋白的分子量在12.42～169.60 kD,等电点为4.50～9.00。164个蛋白在3 d卵期发育过程中均有表达,其中79 个蛋白在3 个日龄的表达量无显著差异（P＞0.05）,7个共有蛋白表达量随卵期发育呈显著上调（P＜0.05）趋势,而4个共有蛋白呈显著下调（P＜0.05）趋势。同时卵期3 d分别有11、18和18个特异的蛋白表达。除共有及特有蛋白外,还有17个蛋白在第1 日龄和第2日龄表达而在第3 日龄关闭;43个蛋白在第2日龄和第3日龄表达而在第1日龄关闭;仅有8个蛋白在第2日龄关闭,而在第1日龄和第3日龄表达。【结论】结果初步表明意蜂雄蜂卵期发育过程中第2日龄蛋白表达最为活跃;卵期3 d所表达的共有蛋白,可能是调控意蜂雄蜂卵期发育所必需的保守蛋白,这些蛋白的表达模式存在一定的差异;不同日龄表达的特异性蛋白,表明不同发育阶段的卵需要不同的特异性蛋白来调控。同时也表明雄蜂卵期发育较工蜂卵表达的保守蛋白更多,这将给蜜蜂的基因改良带来便利。     

意大利蜜蜂胚后发育的观察与研究

在安徽江淮地区,意大利蜜蜂胚后发育期：蜂王平均为15．28d（355－376h）,工蜂平均为20．49d（477－498h）,雄蜂平均为23．87d（560－583h）;周年季节（春、夏、秋）不同,意大利蜜蜂三型蜂的胚后发育历期存在差异。意大利蜜蜂初生重蜂王平均为231．8mg109．3mg,雄蜂平均为189．5mg。意大利蜜蜂受精卵与未受精卵的外部形太怃明显差异;未封盖幼虫期和蛹期,复、腹节、螫针、绒毛的出现与变化是蛹期的重要特征;未封盖幼虫期与前蛹期虫体生长发育经过5次蜕皮。     

王浆主蛋白MRJP7基因在意大利蜜蜂(Apis melliferaligustica Spinola)体内的表达

王浆蛋白是蜂王浆生物功能的物质基础,是由王浆蛋白基因家族(mrjps)编码合成的。但部分家族成员如MRJP7在王浆中的含量极少甚至检测不到。基因功能与其在生物体内的时空表达特性相关,为探究蜂王浆中含量较少的王浆主蛋白基因mrjp7在蜜蜂体内的表达和生物学功能,本研究利用荧光定量PCR技术对mrjp7在不同发育时期的工蜂和、成年工蜂、雄蜂和蜂王的不同发育时期和不同组织部位的表达进行定量分析检测。结果显示mrjp7在成年雄蜂体内的表达水平最低,成年蜂王次之,且在这两种蜜蜂类型它们的各不同发育时期和不同组织部位之间的表达量差异较小,其表达基本没有时空特异性。该基因在工蜂幼虫和蛹期的表达量同样较低且没有组织特异性,但在羽化后9日龄前后的哺育蜂王浆腺和头部脑组织内特异性高表达,其表达与工蜂的发育时期和组织密切相关。mrjp7在这与哺育蜂分泌蜂王浆王浆腺中的特异性高表达与哺育蜂所担负的哺育幼虫和蜂王的功能是相适应的,该结果在转录水平上证实了mrjp7该基因的的营养功能,为进一步的研究和应用打下了理论基础。。其在生殖和非生殖蜜蜂体内的差异表达可能与蜜蜂的生殖调控有关。     

中华蜜蜂离子型受体AcerIR76b、AcerIR75f.1生物信息学和差异表达分析

【目的】从中华蜜蜂Apis cerana cerana触角转录组测序结果中筛选获得中华蜜蜂离子型受体IR76b、IR75f.1的基因序列,对其进行蛋白结构预测和表达谱分析,为该基因的功能研究提供依据。【方法】利用多种生物信息学软件对其编码蛋白的理化特性进行分析;采用qRT-PCR技术对AcerIR76b、AcerIR75f.1在中蜂1日龄工蜂和采集蜂、1日龄雄蜂和性成熟雄蜂各部位(触角、头、胸、腹和足)中mRNA的表达情况进行比较分析。【结果】成功获得了AcerIR76b、AcerIR75f.1的完整开放阅读框ORF序列,全长分别为1 635 bp和1 686 bp,分别编码545、562个氨基酸。预测AcerIR76b分子量为63.09 ku,AcerIR75f.1分子量为62.28 ku,它们均具有3个跨膜结构。qRT-PCR结果显示,AcerIR76b在1日龄工蜂和采集蜂、1日龄雄蜂和性成熟雄蜂的各部位中均有表达,但在触角中的表达量极显著的高于其它部位(P0.01);AcerIR75f.1在1日龄工蜂和采集蜂中,均在触角中高表达,而在1日龄雄蜂和性成熟雄蜂中,均在足部高表达。【结论】AcerIR76b和AcerIR75f.1的编码产物均具有昆虫离子型受体的典型结构特征,2个离子型受体在中华蜜蜂工蜂和雄蜂各个部位均有表达,推测其不仅参与气味分子的识别过程,在味觉感知中也同样发挥着一定作用。     

意蜂三型蜂间哺育王浆蛋白组分差异的研究

为研究蜜蜂三型蜂幼虫期间食物的差异,现对意大利蜜蜂三型蜂间哺育王浆蛋白组分的差异性进行研究。对工蜂幼虫哺育浆、雄蜂幼虫哺育浆、蜂王幼虫哺育浆分别用水和磷酸缓冲液进行提取,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果表明:工蜂和雄蜂各日龄幼虫哺育浆间存在不同程度的差异;各个日龄蜂王幼虫哺育浆的蛋白质谱带基本相同;哺育浆分别经水和磷酸缓冲液提取,结果存在差异。     

王浆高产蜜蜂和原种意大利蜜蜂雄蜂卵期发育蛋白质组分析

 【目的】比较王浆高产蜜蜂（Apis mellifera L.浆蜂）与原种意大利蜜蜂（Apis mellifera L. 原意）雄蜂卵期3 d发育阶段蛋白质组的特点。【方法】根据双向电泳所得表达谱,对两个蜂种雄蜂卵期发育的蛋白质的种类、等电点、分子量和表达量进行分析。【结果】浆蜂雄蜂卵期所表达的蛋白数（332、377和339）显著的高于相应日龄原意雄蜂卵期3个日龄所表达的蛋白数（283、305和293）（P＜0.05）,其中在两蜂种3个日龄共同表达的蛋白数为254个。通过雄蜂卵期3 d发育过程蛋白质表达谱的比较,两个蜂种分别检测到274、298 和285个共有蛋白。在这些共有蛋白中,浆蜂雄蜂分别有54、42和47个蛋白的表达量显著高于（P＜0.05）原意,18、75和61个蛋白显著低于（P＜0.05）原意。同时,浆蜂还检测到58、79和54个特异蛋白,而原种意大利蜜蜂也分别检测到9、7、8个特异蛋白。【结论】浆蜂和原意雄蜂卵期发育的蛋白质组表达谱存在显著差异,但都在2日龄蛋白表达最活跃;两个蜂种雄蜂卵期发育所表达的共有蛋白可能是其发育所必须的管家蛋白,但它们的表达模式存在较大差异,不同日龄的特异蛋白表明雄蜂卵在不同的发育阶段需要不同的蛋白来调控;浆蜂和原意雄蜂卵期表达的特异蛋白是否是与王浆高产相关的功能蛋白,有待进一步的研究。     

蜜蜂（Apis mellifera L.）幼虫级型分化差异蛋白质组分析

【目的】对蜜蜂（Apis mellifera L.）蜂王与工蜂级型分化期的蛋白质组进行比较,以探明蜂王和工蜂在级型分化时期蛋白质表达调控方面的异同。【方法】采用双向电泳建立蜂王和工蜂级型分化期蛋白质组表达 谱,获得图谱中蛋白质表达的数量、表达量、等电点和分子量等信息,然后进行比较蛋白质组研究。【结果】在幼虫3日龄,蜂王表达288个蛋白质,工蜂表达259个蛋白质,2种级型蜂共有蛋白质为156个,其中25个蛋白质在蜂王中的表达量显著大于（P＜0.05）工蜂,34个蛋白质工蜂表达量显著大于（P＜0.05）蜂王,而蜂王和工蜂的特异蛋白质分别为132个和103个;到幼虫5日龄时,蜂王表达274个蛋白质,工蜂为236个,这2种级型蜂共有蛋白质点为95个,其中蜂王15个蛋白质的表达量显著大于（P＜0.05）工蜂,工蜂26个蛋白质的表达量显著大于（P＜0.05）蜂王,而蜂王特异蛋白质点为179个,工蜂特异蛋白质点为141个;到蛹11日龄时,蜂王蛋白质组有311个蛋白质点,而工蜂则有278个蛋白质点,2种蜂共有蛋白质点为194个,其中蜂王45个蛋白质的表达量显著大于（P＜0.05）工蜂,工蜂35个蛋白质的表达量显著大于（P＜0.05）蜂王,而蜂王的特异蛋白质点为117个,工蜂特异蛋白质点为84个。【结论】在蜜蜂3日龄、5日龄、11日龄时,蜂王和工蜂的蛋白质表达谱存在显著差异,蜂王表达的蛋白质总数和特有蛋白质数都较工蜂多,说明蜂王幼虫的基因表达和代谢比工蜂幼虫更加旺盛。2种级型蜂发育中所表达的共有蛋白质可能是它们发育所必须的管家蛋白质,但级型间部分共有蛋白质的表达模式存在较大差异,在3个日龄中蜂王和工蜂中所表达的特异蛋白质表明在级型分化中,不同级型需要不同的蛋白质来调节各自的发育。这些特异蛋白质是否是级型发育相关的功能蛋白质,还有待进一步的研究。     

球囊菌侵染对意大利蜜蜂成年工蜂的影响

为了探究球囊菌侵染对意大利蜜蜂成年工蜂存活率、免疫基因、发育基因及肠道菌群的影响，将纯化培养的球囊菌孢子接种6日龄意大利蜜蜂成年工蜂，利用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测球囊菌侵染对意大利蜜蜂成年工蜂免疫基因、发育基因及肠道菌群的影响。结果表明，连续3 d接种球囊菌孢子对意大利蜜蜂成年工蜂存活率无显著影响(χ²=0.133,P=0.715)。意大利蜜蜂工蜂中肠与后肠球囊菌孢子含量在接种球囊菌孢子4 d时分别显著高于接种8 d时(P<0.05)。与未接种组相比，接种球囊菌孢子4 d，意大利蜜蜂成年工蜂免疫相关基因abaecin、apidaecin、defensin-1、defensin-2、hymenoptaecin、GNBP-1和IMD均显著上调表达(P<0.05)；接种球囊菌孢子8 d，意大利蜜蜂成年工蜂免疫相关基因相对表达量无显著差异(P>0.05)；接种球囊菌孢子4 d和8 d，发育相关基因VGMC、usp、kr-h1、AMHex10869相对表达量无显著差异(P>0.05)。与未接种组相比，接种球囊菌孢子4 d，意大利蜜蜂成年工...     

东方蜜蜂幼虫封盖信息素含量及生物合成通路

【目的】在蜜蜂中,甲基棕榈酸酯（MP）、甲基油酸酯（MO）、甲基亚油酸酯（ML）和甲基亚麻酸酯（MLN）是重要的封盖信息素成分,它们触发成年工蜂对幼虫的封盖行为。本研究旨在比较封盖信息素化学成分在不同封盖时期的东方蜜蜂（Apis cernana）工蜂与雄蜂幼虫体内的含量,并分析其在幼虫体内的生物合成通路,进一步探索蜜蜂幼虫与成年工蜂之间的信息素交流机制。【方法】以中华蜜蜂（Apis cernana cernana）为实验材料,分别取未封盖、正在封盖和已封盖的工蜂与雄蜂幼虫,利用GC/MS分析技术,比较4种封盖信息素成分在不同封盖时期的工蜂与雄蜂幼虫体内的含量;同时利用RNA-seq技术对不同封盖时期的工蜂与雄蜂幼虫进行转录组测序,分析其基因表达差异,并根据差异表达基因KEGG富集分析推测封盖信息素的生物合成通路。【结果】在工蜂幼虫中,4种封盖信息素成分在正在封盖和已封盖幼虫体内的含量均显著高于未封盖幼虫,其中MP和MO的含量均随幼虫日龄增长而显著增加,而ML和MLN的含量在正在封盖和已封盖幼虫体内差异不显著;在雄蜂幼虫中,4种信息素成分含量均随日龄增长而增加,且已封盖幼虫的信息素含量显著高于未封盖和正在封盖的幼虫。对工蜂与雄蜂3个封盖时期幼虫的基因表达量进行组间比较分析,分别从3个比较组中获得4 299和3 926个差异表达基因,并且在差异表达基因KEGG注释分析中分别获得152和130个KEGG通路。根据差异表达基因KEGG富集结果,推测出东方蜜蜂工蜂与雄蜂幼虫可能利用乙酰辅酶A合成MP、MO、ML和MLN的生物合成通路以及11个调控候选基因,并发现该生物合成通路与西方蜜蜂相同。【结论】东方蜜蜂工蜂幼虫与雄蜂幼虫在被封蜡盖的关键阶段增加了MP、MO、ML和MLN的释放量,进一步验证了它们是与蜜蜂封盖行为相关的信息素,并且推测这些信息素可能是在相关基因的调控下由乙酰辅酶A从头合成,而东方蜜蜂幼虫与西方蜜蜂幼虫可能利用相同的生物合成通路进行信息素的生物合成。     

中华蜜蜂NPC2基因家族克隆及表达模式分析

【背景】 作为我国本土重要的资源昆虫,中华蜜蜂（Apis cerana cerana,简称中蜂）对我国初冬季低温开花植物的传粉具有重要的生态价值,其传粉习性与嗅觉系统密切相关。前期对中蜂采集蜂高、低温处理后的触角转录组数据分析发现,与昆虫嗅觉相关的尼曼匹克C2型蛋白（Niemann-Pick type C2 protein,NPC2）基因家族在低温时表达量上升。【目的】 以中蜂NPC2家族基因为研究对象,克隆并分析其结构特征和表达谱以及高、低温处理下表达量的差异,为深入研究中蜂NPC2基因家族在中蜂低温适应的嗅觉感受功能提供参考。【方法】 基于中蜂高、低温转录组测序结果,利用RT-PCR克隆获得中蜂NPC2基因ORF序列,进行系统进化树分析和三维结构预测,然后通过实时荧光定量PCR分析中蜂NPC2基因在不同发育时期、组织的时空表达谱,以及高、低温时的表达量变化。【结果】 获得4个中蜂NPC2基因——AcNPC2a、AcNPC2b、AcNPC2c、AcNPC2d的ORF全长,分别为447、480、459和465 bp,编码148、159、152和154个氨基酸,预测蛋白分子量为16.12—18.53 kD,等电点分别为7.98、7.57、6.56和6.34。进化树分析显示AcNPC2与意大利蜜蜂的NPC2同源序列亲缘关系最近,与其他膜翅目昆虫NPC2也有一定相似性。实时荧光定量PCR结果显示,AcNPC2a在新出房蜂的腹部表达量最高,其次是在哺育蜂的腹部以及幼虫期;AcNPC2b在新出房蜂的胸部表达最高,在采集蜂的头部、胸部和后足也有表达;AcNPC2c在哺育蜂和采集蜂的触角中呈高丰度表达;AcNPC2d在采集蜂的头部表达量最高。经低温处理后,4个AcNPC2基因在采集蜂触角中的表达量均有所上升,但差异不显著。【结论】 AcNPC2具有NPC2蛋白的保守结构,其基因家族成员在中蜂的时空表达谱中呈现多样性,其中AcNPC2c在触角中呈高丰度表达,表明其与中蜂嗅觉感受功能关系密切。AcNPC2基因家族在低温时采集蜂触角中表达量均有所上升,表明该基因家族有可能参与中蜂的低温适应性,或与初冬季访花行为有关。     

莲草直胸跳甲Halloween基因家族鉴定及表达分析

【背景】 莲草直胸跳甲（Agasicles hygrophila）是世界恶性入侵杂草空心莲子草（Alternanthera philoxeroides）的专一性生防天敌;莲草直胸跳甲种群动态呈季节性波动趋势,在我国湖南地区其夏季种群数量骤减,导致对空心莲子草的防控效果大大降低。而Halloween基因家族参与昆虫蜕皮激素的合成,影响昆虫生长和繁殖,进而对昆虫种群动态具有一定影响。【目的】 揭示Halloween基因家族在莲草直胸跳甲不同发育时期和不同组织中的表达模式,为进一步探究Halloween基因家族在莲草直胸跳甲中的功能打下基础,进而为生防天敌的扩繁提供新思路。【方法】 通过筛选莲草直胸跳甲卵巢转录组数据并结合生物信息学分析,找到并克隆其体内Halloween基因家族成员;使用NCBI在线分析其保守结构域,利用MEGA6.0对Halloween家族基因进行多序列比对并构建系统发育树;通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测各基因在莲草直胸跳甲不同发育时期（卵、幼虫、蛹、雌成虫）和雌成虫不同组织（头、胸、中肠、卵巢、脂肪体）中的表达水平。【结果】 莲草直胸跳甲中存在6个Halloween基因家族成员,分别为AhCYP302A1、AhCYP306A1、AhCYP307A1、AhCYP307A2、AhCYP314A1和AhCYP315A1;分析发现其均属于P450超家族且具有一定保守性,其中AhCYP306A1、AhCYP307A1、AhCYP307A2聚为一支,属于P450超家族中CYP2集团,AhCYP302A1、AhCYP314A1、AhCYP315A1聚为一支,属于线粒体集团;同时,AhCYP306A1、AhCYP314A1、AhCYP315A1在5′端存在跨膜区域。6个Halloween基因在莲草直胸跳甲整个生活史及各个组织中均有不同程度的表达。其中,AhCYP302A1在蛹期第6、7天表达量最高,成虫期表达量整体较低;AhCYP306A1在整个生活史中波动表达,以幼虫期第10天表达量最高;AhCYP307A2在末龄幼虫和化蛹初期的表达量较高;以上3个基因在幼虫期和蛹期的表达量较高。AhCYP307A1在卵期高表达,此后各个时期呈波动下降;AhCYP314A1、AhCYP315A1在成虫期和卵期的表达量相对高于其他两个时期。在头、胸、中肠、卵巢、脂肪体5种组织中,除AhCYP307A1外,Halloween家族其他基因在卵巢中表达量均较高;AhCYP307A1在雌成虫头部显著性高表达。【结论】 克隆并鉴定得到6个莲草直胸跳甲Halloween基因家族成员,其在不同发育时期及不同组织中的表达具有一定差异。通过其表达模式推测Halloween基因家族在莲草直胸跳甲幼虫发育及成虫繁殖过程中可能发挥重要作用,对其幼虫蜕皮与成虫卵巢发育均有一定影响。     

吡虫啉在棉花上的残留消解动态及对意大利蜂的急性毒性

【目的】分析吡虫啉在棉花植株上的残留消解动态;测定在接触暴露途径下,吡虫啉对意大利蜜蜂的急性毒性。【方法】前处理采用改进的 QuEChERS 方法,用UPLC-MS测定吡虫啉在棉花叶片、花及土壤上的残留消解动态;采用点滴法测定吡虫啉对意大利蜜蜂的急性接触毒性。【结果】吡虫啉标样的峰面积(y)与浓度(x)呈线性关系,回归方程为y=4 010.25x+2 746.69,相关系数r为0.998 7,最低检测浓度LOQ为0.02 mg/kg。吡虫啉在棉花植株和土壤样品的添加回收率介于94.27%～101.63%,相对偏差率介于2.01%～3.85%,符合农药残留试验准则中对残留检测方法的要求。吡虫啉在棉花叶片、花及土壤的残留量半衰期分别是4.02、4.30和5.27 d,属于易降解农药。吡虫啉对意大利蜜蜂的急性毒性48 h LC₅₀为0.064 9μga.i./bee。【结论】吡虫啉对意大利蜂的急性接触毒性为高毒,应关注其在新疆棉田使用时对传粉昆虫及其他天敌的安全性。     

中华蜜蜂气味结合蛋白AcerOBP7的表达及结合特性

[目的]中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)是我国本土蜂种,也是重要的传粉昆虫和经济昆虫.气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)是蜜蜂嗅觉感知中的关键蛋白.在前人对中蜂AcerOBP7基因序列特征分析的基础上,本研究进一步对其表达特性及与气味物质的结合能力进行探究,...     

微小RNA及其介导的竞争性内源RNA调控网络在意大利蜜蜂工蜂中肠发育过程中的潜在作用

【目的】微小RNA（microRNA,miRNA）能够通过靶向结合导致mRNA的抑制或降解,从而对基因表达进行负调控。MiRNA在昆虫的生长、发育、免疫和细胞生命活动调控方面扮演关键角色。本研究旨在对意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica,简称意蜂）工蜂中肠的差异表达miRNA（differentially expressed miRNA,DEmiRNA)及其调控网络进行深入分析,并结合前期在mRNA、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和环状RNA(circular RNA,circRNA)组学层面的相关研究结果,系统解析中肠发育过程的miRNA差异表达谱及竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）调控网络介导的中肠发育机理。【方法】利用small RNA-seq技术对正常的意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠（Am7和Am10）进行测序。将质控后的测序数据比对西方蜜蜂基因组,再将比对上的序列标签（tags）比对到miRBase数据库以鉴定已知miRNA。利用每百万标签序列（tags per million,TPM）算法对miRNA表达量进行计算和归一化处理。根据|log₂fold change|≥1且P≤0.05的标准筛选得到显著性DEmiRNA;利用相关软件进行靶mRNA的预测及GO和KEGG数据库注释。根据靶向结合关系及前期研究结果,利用Cytoscape软件对AMPK、PI3K-Akt、Wnt、cAMP、Hippo、mTOR、Toll/Imd、TGF-beta和MAPK 9条信号通路相关的DElncRNA/DEcircRNA-DEmiRNA-DEmRNA网络进行可视化;构建以miR-342-y为核心的ceRNA调控网络,进一步对网络中的靶mRNA进行代谢通路注释。利用茎环实时荧光定量PCR（Stem-loop RT-qPCR）验证测序数据及miRNA差异表达的可靠性。【结果】Am7 vs Am10比较组中共有112个显著性DEmiRNA,包括38个显著上调miRNA和74个显著下调miRNA,分别靶向结合7 434和9 559个mRNA,它们可注释到生物学进程相关的21和23个功能条目,细胞组分相关的16和17个功能条目,以及分子功能相关的10和11个功能条目;此外还能注释到果糖和甘露糖代谢、嘌呤代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等物质代谢相关的83和86条通路;内吞作用、泛素蛋白水解、黑色素生成等细胞免疫相关的10和10条通路;MAPK、Jak-STAT、NF-κB等体液免疫相关的5和5条通路;以及Hippo、FoxO、Notch等涉及生长发育的13和11条信号通路。进一步构建上述9条信号通路相关的ceRNA调控网络,分析发现意蜂中肠发育过程中DEmiRNA与DElncRNA、DEcircRNA和DEmRNA之间存在复杂的调控关系;DEmiRNA位于网络中心,而DElncRNA、DEcircRNA和DEmRNA位于网络的外周。miR-342-y在意蜂工蜂中肠和幼虫肠道发育过程中均为显著性下调表达,可靶向结合3个DEcircRNA、4个DElncRNA和327个mRNA。Stem-loop RT-qPCR结果显示4个DEmiRNA的差异表达趋势与测序结果一致,说明本研究中测序数据及miRNA差异表达趋势真实可靠。【结论】DEmiRNA可能通过参与调控物质和能量代谢通路、Hippo和Wnt等信号通路以及细胞和体液免疫通路相关基因的表达影响意蜂中肠的生长和发育;miR-182-x、miR-291-y、miR-342-y、ame-miR-6001-3p等关键DEmiRNA介导的ceRNA调控网络可能在意蜂中肠发育过程发挥重要的调控作用。     

绿盲蝽雷帕霉素靶蛋白的克隆、抗体制备及在蜕皮激素诱导下的应答

【目的】克隆绿盲蝽（Apolygus lucorum）雷帕霉素靶标全长基因（AlTOR）,研究AlTOR时空表达特性及在外源蜕皮激素（20E）诱导下的应答响应,进一步获得原核表达的重组蛋白及制备多克隆抗体,分析该抗体的特异性,为后续研究AlTOR蛋白功能打下基础。【方法】RACE法克隆AlTOR基因序列全长,qRT-PCR分析AlTOR表达特性以及在20E及其抑制剂U73122诱导下的应答响应;将含有AlTOR序列T载体经EcoR I及Xho I双酶切,构建原核表达载体pCzn1-AlTOR,经20℃、0.5 mmol·L^-1 IPTG诱导表达、变性、复性和蛋白纯化后,以获得AlTOR重组蛋白,最后再通过免疫,制备AlTOR蛋白多克隆抗体,Western blot评价该抗体的特异性。【结果】AlTOR的开放阅读框编码包含435个氨基酸,具有典型的TOR基因序列特征,即SIN1结构域、高度保守的CRIM结构域及PH域;AlTOR在绿盲蝽不同日龄、不同组织中均有表达,且在1日龄以及脂肪体中表达量最高;20E可诱导绿盲蝽不同日龄若虫期AlTOR的表达,同时也能诱导成虫头、翅、卵巢和脂肪体中AlTOR表达上调,分别上调200.00%、118.89%、20.53%和60.82%,而U73122在中肠和卵巢中会显著抑制AlTOR的表达。经双酶切的重组克隆载体可成功亚克隆到pCzn1载体上,命名为pCzn1-AlTOR;IPTG诱导的重组质粒可特异性表达一个约36 kD的蛋白,且主要以包涵体形式存在;经Ni-IDA亲和层析纯化后,仅在36 kD附近有一条明显的特异性条带。进一步免疫及间接ELISA方法确定抗血清对TOR蛋白的效价,Western blot分析表明制备的多克隆抗体可以特异性与AlTOR重组蛋白及绿盲蝽3龄若虫总蛋白结合,说明制备的AlTOR多克隆抗体特异性较好,可以用于后续的蛋白研究。【结论】AlTOR在绿盲蝽体内的表达谱显示出发育阶段特异性和组织特异性;20E及其抑制剂诱导后,AlTOR呈现出相反的应答反应;本研究获得的AlTOR重组蛋白的多克隆抗体具有高特异性。     

棉蚜ATP合成酶基因AgoATPb的克隆与表达

为确定棉蚜(Aphis gossypii)ATP合成酶B亚基基因在棉蚜不同组织和日龄,以及取食不同植物的表达情况,以棉蚜为研究对象,采用RT-PCR和RACE技术获得AgoATPb的全长cDNA序列,通过Expasy、Sig-nalP-4.0 Server等在线工具对其进行了生物信息学分析,同时利用实时荧光定量PCR技...     

气味受体基因Orco在中华蜜蜂雄蜂触角中的表达及定位分析

【目的】昆虫气味受体（odorant receptors, Ors）在其发挥嗅觉识别过程中采用的是配体门控离子通道信号传导机制,这一离子通道是由一个特定的共受体与一个普通气味受体结合为异源二聚体而形成的。其中,气味共受体（odorant receptor coreceptor, Orco）是一个十分独特的家族,在不同种类昆虫中高度保守,并在调控昆虫的嗅觉行为方面发挥关键作用。论文在对中华蜜蜂（Apis cerana cerana,简称中蜂）工蜂Orco研究基础之上,进一步探讨雄蜂Orco的表达特性。【方法】采集中蜂1日龄雄蜂的触角、头（去除触角）、胸、腹、足5部分组织,以及不同发育阶段的幼虫、蛹及成蜂触角。提取各样本的总RNA,利用real-time quantitative PCR（qPCR）技术鉴定Orco在雄蜂不同组织及不同发育时期的表达谱;采集1日龄雄蜂触角制备冰冻切片,合成地高辛标记的寡核苷酸探针,利用原位杂交技术对Orco在雄蜂触角中的表达进行细胞定位分析。【结果】qPCR分析结果表明,Orco转录本在不同组织中的表达量表现为触角>头>足>腹>胸,其中触角表达量约为头部的100倍;Orco在雄蜂不同发育阶段均有表达,其中幼虫期和蛹期表达量较低,羽化后开始逐渐升高,性成熟后维持在一个较高的水平。此外,结合前期工蜂荧光定量试验数据,分析得到Orco在雄蜂触角中的表达量极显著高于工蜂触角表达量（P＜0.01）。原位杂交结果显示,Orco阳性杂交信号大量表达于雄蜂触角的板型感器和毛型感器的神经元细胞中。【结论】气味受体基因Orco在中蜂雄蜂的触角中大量表达,且在性成熟后表达量达到高峰。结合前期研究结果,推测Orco在中蜂中是偏雄性表达的。     

微小RNA介导东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂的分子机制

【目的】通过对东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）纯化孢子与侵染意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica,简称意蜂）工蜂的东方蜜蜂微孢子虫的差异表达miRNA（DEmiRNA）及其靶mRNA进行系统分析,筛选、分析和探讨病原毒力因子和侵染因子相关的DEmiRNA及调控网络,在miRNA组学层面揭示东方蜜蜂微孢子虫对意蜂的侵染机制。【方法】利用small RNA-seq（sRNA-seq）技术对东方蜜蜂微孢子虫感染7 d和10 d的意蜂工蜂中肠和东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子（NcCK）进行深度测序,通过连续比对rRNA数据库、西方蜜蜂（Apis mellifera）基因组和东方蜜蜂微孢子虫基因组筛滤出处于侵染过程的东方蜜蜂微孢子虫（NcT1和NcT2）数据和东方蜜蜂微孢子虫孢子的测序数据。根据P≤0.05,|log₂ fold change|≥1的标准,通过比较分析筛选出各比较组中的差异表达miRNA（differentially expressed miRNA,DEmiRNA）。通过相关生物信息学软件对DEmiRNA进行表达谱分析,靶mRNA预测及功能和代谢通路注释,以及调控网络的构建与分析。通过Stem-loop RT-qPCR验证DEmiRNA的差异表达趋势及测序数据的可靠性。【结果】NcCK vs NcT1、NcCK vs NcT2和NcT1 vs NcT2比较组分别包含164、122和60个DEmiRNA。Venn分析结果显示,3个比较组共有的上调和下调miRNA分别为5和6个。上述DEmiRNA分别预测出1 885、1 733和1 524个靶mRNA。这些靶mRNA分别注释到27、25和26个功能条目,其中注释数量最多的是新陈代谢进程、催化活性、细胞进程、结合和细胞。上述靶mRNA可分别注释到84、84和84条代谢通路,其中注释数量最多的是代谢途径、核糖体和次级代谢产物生物合成。此外,对于NcCK vs NcT1、NcCK vs NcT2和NcT1 vs NcT2中的DEmiRNA,分别有35、26和12个靶向结合MAPK信号通路相关靶mRNA,分别有49、40和17个DEmiRNA靶向结合糖酵解/糖异生通路相关靶mRNA。进一步分析发现,东方蜜蜂微孢子虫的DEmiRNA参与调控蓖麻毒素B凝集素、细胞凋亡抑制因子、极管蛋白和孢壁蛋白等病原毒力因子的基因表达,以及己糖激酶、ATP/ADP移位酶、ABC转运蛋白和转录因子ste12等侵染因子的基因表达。【结论】通过对东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子与侵染意蜂工蜂的东方蜜蜂微孢子虫进行深入细致的miRNA组学分析和探讨,解析了病原侵染过程的miRNA差异表达谱,揭示了东方蜜蜂微孢子虫可能通过调节相应miRNA的表达水平对蓖麻毒素B凝集素、细胞凋亡抑制因子、极管蛋白和孢壁蛋白等毒力因子及己糖激酶、ATP/ADP移位酶、ABC转运蛋白和转录因子ste12等侵染因子基因表达进行调控,从而适应宿主细胞内的环境并促进自身的增殖与侵染。