广西昆虫微孢子虫资源调查及其特性分析

[目的]全面掌握广西昆虫微孢子虫资源及其分布情况,并进行感染性和分类研究,为经济昆虫微孢子虫病的防控提供参考依据.[方法]通过人工捕捉或诱虫灯引诱方式在广西蚕区的桑园、菜地及周围收集野外昆虫,显微镜检验各种野外昆虫微孢子虫的自然感染率;通过生物试验鉴定部分野外昆虫微孢子虫对家蚕的食下感染性,并分别检测桑尺蠖微孢子虫和菜粉蝶微孢子虫对原始寄主的胚种传染性;基于SSU rRNA序列构建昆虫微孢子虫系统发育进化树,明确昆虫微孢子虫的分类特征.[结果]广西昆虫微孢子虫资源分布广泛,大部分昆虫已感染微孢子虫,其中菜粉蝶、稻纵卷叶螟、桑螟、桑尺蠖、斜纹夜蛾和红腹灯蛾的微孢子虫自然感染率分别为54.95%、4.38%、0.08%、0.28%、0.64%和1.14%,其他鳞翅目昆虫的总体微孢子虫感染率为0.75%.部分昆虫微孢子虫可食下感染家蚕,交叉感染率达40.00%;部分昆虫微孢子虫还具有很强的胚种传染力,其中桑尺蠖微孢子虫和菜粉蝶微孢子虫对原始寄主的胚种传染率分别为77.48%和66.15%.从桑尺蠖分离获得的3株微孢子虫虽然为不同的微孢子虫,但均属于Nosema属,与家蚕微孢子虫同属异种.[结论]在广西各地区存在丰富的昆虫微孢子虫资源,种类多样,且大部分昆虫微孢子虫属于Nosema属,与家蚕微孢子虫亲缘关系密切;部分野外昆虫微孢子虫还对家蚕形成交叉传染危害的风险,因此杜绝昆虫微孢子虫污染桑叶交叉感染家蚕是控制家蚕微粒子病发生的重要措施.     

一株从原蚕分离的微孢子虫的生物学特性及其系统发育分析

[目的]研究从广西蚕种繁育中分离获得的微孢子虫,调查其感染性和分类地位,为蚕种生产掌握病原来源及有效控制家蚕微粒子病流行提供参考依据.[方法]采用生物试验测定从蚕种生产一线分离获得微孢子虫(GXM14)对家蚕的半数感染浓度(IC50)和胚种传染率,显微镜观察其孢子形态,采用吉姆萨染色法观察孢子的生活史;通过PCR扩增及测序获得GXM14的SSU rRNA基因序列和ITS序列,并利用MEGA 5.0和DNASTAR中的Megalign构建系统发育进化树及进行相似性和遗传距离分析.[结果]GXM14孢子呈卵圆形,大小为(1.68±0.15)μm×(3.06±0.15)μm,其孢子生活史中有双核,以二分裂方式进行增殖,符合Nosema属的特征.GXM14对家蚕的IC50为3.53×105个/mL,是家蚕微孢子虫(N.b)的5.8倍;对家蚕的胚种传染率为5.0%,只是N.b的1/9.GXM14的SSU rRNA基因序列长度1226 bp,G+C含量为34.42%;ITS序列长度503 bp,G+C含量为29.82%.GXM14的SSU rRNA基因序列与甜菜夜蛾微孢子虫(Nosema sp.SE)SSU rRNA基因序列(KT336240.1)的遗传距离为0.2,相似度达98.9%,即GXM14与甜菜夜蛾微孢子虫(KT336240.1)的亲缘关系很近.基于微孢子虫ITS序列的相似性和遗传距离分析结果表明,GXM14与12株已知No-sema属微孢子虫的相似度均低于91.0%,而遗传距离在4.0以上,证实GXM14是一种新的微孢子虫,故将其暂命名为Nosema sp.GXM14.[结论]从蚕种生产一线分离获得的家蚕病原性微孢子虫(GXM14)属于Nosema属,与N.b同属异种,是一株新的微孢子虫,可能是野外昆虫微孢子虫交叉感染家蚕的病原.因此,在蚕种繁育中加强防虫杀虫,防止昆虫微孢子虫污染桑叶交叉感染家蚕,是控制家蚕微粒子病暴发流行的重要措施.     

家蚕病原性微孢子虫多样性调查分析

[目的]从分布、感染性和分类特征三方面调查家蚕病原性微孢子虫多样性,为蚕业生产上有效防控家蚕微粒子病提供参考依据.[方法]跟踪蚕种生产微粒子病检疫数据及抽样检验家蚕受微孢子虫感染的情况,调查家蚕病原性微孢子虫的分布;通过测定微孢子虫对家蚕的半数感染浓度(IC50)和胚种传染率及检验带毒蚕种的微粒子病胚种传染率,调查家蚕病原性微孢子虫的感染性;基于微孢子虫SSU rRNA序列构建家蚕病原性微孢子虫系统发育进化树及进行相似性和遗传距离分析,调查家蚕病原性微孢子虫的分类特征.[结果]不同时间和不同蚕区生产饲养的广西家蚕均存在一定量的微孢子虫感染,蚕种微粒子病发生率(毒率)呈波动起伏态势.GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9、GXM10、GXM11、GXM12和GXM13等11株异型微孢子虫对家蚕均具有较强食下传染力,大部分异型微孢子虫对家蚕的IC50与N.b同一级别;各种微孢子虫对家蚕的胚种传染力存在明显差异,N.b的胚种传染率达51.67%,其他异型微孢子虫均比N.b低,部分异型微孢子虫(GXM6和GXM13)对家蚕无胚种传染力.GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9和GXM11等8株异型微孢子虫均位于Nosema属的类群分支上,除GXM7与GXM9、GXM3与GXM5间存在较低分化度和较高相似度外,其他微孢子虫间的分化度和相似度均存在明显差异.[结论]广西蚕区家蚕病原性微孢子虫分布广泛,种类繁多,且各种微孢子虫的感染力存在明显差异,即广西家蚕病原性微孢子虫存在丰富的种类多样性.     

我国四省区熊蜂中微孢子虫的自然感染率

采用SSUrRNA基因序列检测鉴定方法,初步调查了甘肃、青海、四川、内蒙古26种1008只熊蜂的微孢子虫感染情况及种类.结果表明:其中有16种210只被微孢子虫感染,感染率为20.8%,白背熊蜂和西伯熊蜂的微孢子虫感染率最高,红束熊蜂的感染率最低.内蒙古地区熊蜂微孢子虫的感染率最高,四川次之,甘肃与青海地区熊蜂的微孢子虫感染率最低.感染熊蜂的微孢子虫有熊蜂微孢子虫、东方蜜蜂微孢子虫和发现于鳞翅目卷叶蛾科寄主上的Nosema thomsoni.这说明微孢子虫对我国熊蜂的感染很广泛.     

家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2的保守性及转录活性分析

为研究家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2的保守性及转录活性,采用生物信息学相关软件对微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶slp2基因共线性、多重序列及系统进化进行比对分析,并通过Western blot分析Nbslp2在家蚕微孢子虫、柞蚕微孢子虫及纳卡变形微孢子虫中的表达特征,以验证其保守性;进一步以感染家蚕微孢子虫不同天数的家蚕中肠组织为材料,利用RT-PCR检测Nbslp2的转录活性。共线性、多重序列比对及系统进化分析发现,Nbslp2在微孢子虫基因组中的位置较保守,Western blot结果显示Nbslp2抗体在柞蚕微孢子虫总蛋白中杂交出2条带,而在纳卡变形微孢子虫没有杂交条带,说明Nbslp2相对保守,并且可将Nbslp2作为区分柞蚕微孢子虫和纳卡变形微孢子虫的靶标;RT-PCR结果显示Nbslp2在感染家蚕微孢子虫后72 h检测到转录活性,进一步推测Nbslp2可能在家蚕微孢子虫感染家蚕早期发挥作用,为分子水平深入研究Nbslp2的功能奠定理论基础。     

10株微孢子虫Hsp70基因克隆及系统发育分析

对10株不同来源的微孢子虫Hsp70基因部分序列进行扩增,并进行了系统发育分析,结果表明:所设计的引物可以有效地扩增出10株家蚕等昆虫微孢子虫Hsp70基因中1136 bp大小的片段。遗传距离矩阵和系统发育分析表明,家蚕微孢子虫与野外昆虫微孢子虫的亲缘关系密切,再次从分子水平上证明了家蚕病原微孢子虫来自环境中的野外昆虫微孢子虫的可能性;不同微孢子虫在不同寄主中的寄生生活是一个相互选择和适应的过程;微孢子虫Hsp70基因具有遗传多样性;家蚕微孢子虫是一个种复合体。     

家蚕微孢子虫转宿主果蝇的研究初探

[目的]研究家蚕微孢子虫对果蝇的侵染性,为系统研究家蚕微孢子虫侵染机制提供新视野,也为探索微孢子虫的生物防治效果提供参考。[方法]用家蚕微孢子添食野生型和突变型果蝇,并用Calcofluor White M2R荧光染色法进行果蝇体液内的家蚕微孢子虫形态观察。[结果]结果表明,家蚕微孢子虫在转宿主情况下能够侵染果蝇,且被感染的突变型果蝇体内家蚕微孢子虫的数量多于野生型果蝇。[结论]家蚕微孢子虫能侵染果蝇,该研究结果为研究家蚕微孢子虫侵染其他宿主提供了初步参考,为进一步了解和认识家蚕微孢子虫侵染机制奠定了基础。     

五步蛇源隐孢子虫分离株的分子鉴定

【目的】采用分子生物学方法鉴定1个五步蛇(Deinagkistrodon acutus)源隐孢子虫分离株,了解中国蛇隐孢子虫感染的种类分布。【方法】利用巢式PCR方法,扩增隐孢子虫18S rRNA基因特异性片段,对PCR产物进行限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和同源性分析,构建其种系发育进化树。【结果】成功扩增出18S rRNA基因目的片段,PCR产物经SspⅠ酶消化后获得的酶切结果和先前报道的蛇隐孢子虫(Cryptosporidium serpentis)一致。获得的840 bp 18S rRNA基因序列与C.serpentis同源性达到99.8%。种系发育进化树分析表明,该分离株与C.serpentis位于同一分支,节点支持值达100%。【结论】本研究获得的五步蛇源隐孢子虫分离株为C.serpentis,说明C.serpentis有更宽的感染宿主范围。     

菜粉蝶微孢子虫对家蚕胚种传染性与蚕桑质量的影响

据报道,菜粉蝶微孢子虫能感染家蚕并对家蚕生理代谢产生一定的影响。近年来,笔者对家蚕各级原种、1代杂交种进行母蛾镜检发现椭圆形偏细的微孢子虫,而且检出率极高,其形态大小与家蚕微孢子虫存在一定差异,即长轴与家蚕微孢子虫长轴相当,而短轴偏短。经显微镜观察测量发现,该微孢子虫形态呈椭圆形,大小平均(3.52±0.38)μm×(1.52±0.13)μm,与野外菜粉蝶寄生的微孢子虫形态相似,大小、体积、长短轴比相当。同一地理位置野外分离得到的微孢子虫与家蚕寄生微孢子虫亲缘关系较近,对家蚕的胚种传染性如何?为了进一步弄清楚菜粉蝶微孢子虫对家蚕的危害情况,对正常家蚕添食当地桑园收集纯化的菜粉蝶微孢子虫,分析微孢子虫对当代蚕和子代蚕的胚种传染性,并综合评价菜粉蝶微孢子虫对蚕桑质量的影响。结果表明,感染微孢子虫的家蚕生长发育正常并能完成其生活世代,对体质、茧质、卵量的影响不明显,但对种茧育母蛾检验毒率的判定影响很大。     

蚕种生产大环境中微孢子虫污染情况调查分析

调查分析了2005～2008年广西桂中蚕种场、柳城县蚕种场蚕种生产大环境中微孢子虫的污染情况。结果表明,蚕种生产环境被微孢子虫污染的情况在逐年加重,桑园、桑叶是微孢子病原的重要污染源;同一年内生产环境中微孢子虫的检出情况,总体上呈现出上半年微孢子虫检出率稍高于下半年的现象;野外昆虫微孢子虫检出率呈上升趋势,其严重程度与蚕种发生微粒子病关系密切;环境消毒可以有效杀灭大环境中的微孢子虫,大幅度降低环境中微孢子虫的分布机率。因此,应定期或不定期使用有效药物加强对蚕种生产环境的彻底消毒,可降低环境中微孢子虫的分布机率;而采取桑叶消毒可降低家蚕食下传染微粒子病的机会,达到有效控制蚕种生产微粒子病发生的效果。     

柑橘黄龙病病原菌非洲种和美洲种23S-5S rDNA序列的克隆及分析

 【目的】克隆柑橘黄龙病病原菌非洲种和美洲种23S-5S rDNA序列并和亚洲种相应区域进行比对,阐明黄龙病3个种核糖体RNA操纵子之间的关系。【方法】根据亚洲种23S-5S rRNA基因区域序列的保守性设计引物,在非洲种和美洲种DNA样品上扩增,对PCR产物进行克隆和测序,并对新获得的序列进行序列验证和分析。【结果】 非洲种获得了3 057 bp 序列包括23S rRNA 基因、细胞壁脱氢酶假基因和5S rRNA 基因;美洲种获得了3 033 bp序列包括23S rRNA 基因、glpK基因和5S rRNA 基因。3个种核糖体基因顺序分别是：亚洲种16S rRNA、tRNAIle、tRNAAla、23S rRNA、细胞壁脱氢酶假基因、5S rRNA 和 tRNAMet;非洲种16S rRNA、tRNAIle、tRNAAla、23S rRNA、细胞壁脱氢酶假基因和 5S rRNA;美洲种16S rRNA、tRNAIle、tRNAAla、23S rRNA、glpK 基因和5S rRNA。【结论】黄龙病病原菌核糖体RNA基因有特殊的排列方式,即在23S rRNA和5S rRNA基因区间均有反向编码的细胞壁脱氢酶基因,其中亚洲种和非洲种为假基因,美洲种为glpK基因。     

rRNA基因间隔区序列用于亲缘关系密切的根瘤菌种群鉴定及系统发育分析

通过rRNA基因内转录间隔区的碱基序列分析,对中华根瘤菌属Sinorhizobium、慢生根瘤菌属Bradyrhizobium和中慢生根瘤菌属Mesorhizobium种间亲缘关系十分密切的菌株进行区分．结果表明,rRNA基因间隔区序列能很好地区分种间亲缘关系十分密切的菌株．用rRNA基因间隔区序列构建的系统发育树与rRNA基因序列构建的系统发育树结果十分相似．     

外源16S rRNA在大肠杆菌中的可替换性研究

16S rRNA对于构建功能性核糖体是十分重要的,人们普遍将其作为原核生物进化中保守的系统发育标志.为了进一步研究16S rRNA的进化,本文将Escherichia coli中最后一个拷贝的16S rRNA基因替换为Bacillus subtilis的16S rRNA 基因,得到了菌株SQ110BSX.菌株SQ110BSX的代时与出发菌株SQ110基本一致,但是SQ110BSX表现出冷敏感性,而且rRNA/蛋白比值为SQ110的148%.实验结果表明,菌株SQ110BSX中的核糖体效率明显下降.由于E.coli和B.subtilis在遗传距离上较远,两者的可替换性证明了16S rRNA的高度保守性.     

牛瑟氏泰勒虫18S rRNA基因的克隆及分子分类学分析

为分析牛瑟氏泰勒虫延边株18SrRNA基因序列,根据GenBank上已发表的牛瑟氏泰勒虫18SrRNA基因序列设计2对特异性引物,通过PCR扩增目的基因片段,将扩增产物连接到pMD18一T载体中,经酶切鉴定和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序,对测序结果用DNAMAN软件时其与GenBmlk上8个虫株相关序列进行同源性比较,建立系统发育树。结果显示,牛瑟氏泰勒虫中国延边株的18SrRNA基因大小为1744bp,瑟氏泰勒虫延边株、兰州株、日本株以及水牛泰勒虫中国株彼此之间亲缘关系最近;瑟氏泰勒虫延边株与突变泰勒虫亲缘关系较远：     

珠颈斑鸠线粒体12S rRNA基因的克隆·测序和分子进化分析

[目的]获得殊颈斑鸠（Streptopelia chinensis）线粒体12SrRNA基因序列,并以此分析不同鸟类的分子进化关系。[方法]根据其他鸟类线粒体12SrRNA基因及侧翼序列设计引物,采用PcR的方法获得珠颈斑鸠线粒体12SrRNA基因片段,克隆后进行序列测定,利用Mega4．0软件Neighbor—Joining法分析不同鸟类的进化关系。[结果]获得珠颈斑鸠线粒体12SrRNA基因序列长度为970bp,碱基组成为：A=31．6％、C=28．9％、G=19．8％、T=19．7％,其中A＋T含量高于G＋C含量。通过与GenBank中环颈斑鸠（Streptopelia capicola）等其他8种鸟类12SrRNA基因序列比较发现,珠颈斑鸠与环颈斑鸩的同源性最高。为94．4％,与家鸭（Arias platyrhynchos）的同源性最低,为78．4％。并根据这9种鸟类序列用NJ法构建进化树,结果表明,珠颈斑鸠和其他8种鸟类在分子水平上反映的进化关系与在形态学上的进化关系基本吻合。[结论]首次得到珠颈斑鸠12SrRNA基因全长序列,并确定了珠颈斑鸠与其他8种鸟类的分子进化关系。     

RNA-protein interactions in 30S ribosomal subunits: folding and function of 16S rRNA

Chemical probing methods have been used to "footprint" 16S ribosomal RNA (rRNA) at each step during the in vitro assembly of twenty 30S subunit ribosomal proteins. These experiments yield information about the location of each protein relative to the structure of 16S rRNA and provide the basis for derivation of a detailed model for the three-dimensional folding of 16S rRNA. Several lines of evidence suggest that protein-dependent conformational changes in 16S rRNA play an important part in the cooperativity of ribosome assembly and in fine-tuning of the conformation and dynamics of 16S rRNA in the 30S subunit.     

Effect of the Vinca alkaloids on RNA synthesis in human cells in vitro

The Vinca alkaloids vinblastine sulfate and vincrystine sulfate, which are mitotic poisons, inhibit RNA synthesis in human (HEp-2) cells cultured in vitro. Analyses of RNA synthesis by cells treated with these drugs by acrylamide gel electrophoresis show that 28s rRNA and to a lesser extent 18s rRNA are preferentially inhibited. The synthesis of tRNA is affected much less than that of rRNA. The present experiments suggest that the drugs inhibit both the synthesis and processing of the nucleolar RNA precursors of rRNA. An explanation is also given for previous reports that these alkaloids preferentially inhibit the synthesis of tRNA in animal cells in vitro.     

真核生物核糖体RNA基因的转录调控

综述了真核生物核糖体RNA串联基因调控机制、转录预起始复合物的形成及核糖体RNA基因转录起始调控机制。     

鲢鳙打印病豚鼠气单胞菌主要特性及系统发育学分析

对从鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)鳙(Aristichthysnobilis)打印病病死鱼中分离到的豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae),进行了形态与理化特性等方面较系统的表观分类学指征鉴定。同时择代表菌株(HC960704-1)进行了16SrRNA基因的分子鉴定,测定了16SrRNA基因序列、分析了相关细菌相应序列的同源性,构建了系统发生树;HC960704-1的16SrRNA基因序列长度为1416bp(GenBank登录号:AY966888),与GenBank数据库中的气单胞菌16SrRNA基因序列的相似性在98%和100%。     

新疆南部图兰扇头蜱及卵携带R.raoultii的分子检测

【目的】世界上蜱类3科18属899种,中国有2科10属117种,新疆至少有2科10属45种,占全国蜱种类的1/3之多,分布也极其广泛。蜱直接危害和传播多种病原,且一些病原可经卵垂直传播,给畜牧业造成巨大经济损失,还严重威胁公共卫生安全。图兰扇头蜱是新疆南部荒漠及半荒漠地区常见种和优势种。确定新疆南部图兰扇头蜱及其卵是否携带立克次体,对该蜱及其传播立克次体病的防控意义重大。【方法】对新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室在新疆南部阿拉尔市某羊场收集的饱血雌性扇头蜱,置于一定湿度和一定温度的环境中产卵,随机取5个独立的卵样品及其对应的5只雌蜱为研究对象。通过对雌蜱及其卵分别处理后提取基因组DNA,进行PCR扩增蜱12S r RNA基因和立克次体16S r RNA基因,并对扩增产物测序,利用BLAST在线平台和多个分子生物学软件进行序列分析。【结果】5只雌蜱12S r RNA基因PCR扩增全部阳性,测序获得的4段蜱12S r RNA基因序列完全一致;Blast分析与Gen Bank数据库中图兰扇头蜱12S r RNA基因序列相似性高达99%以上,且高相似性前五基因序列均为图兰扇头蜱,其中包括来自新疆绵羊的图兰扇头蜱;本研究蜱12S r RNA基因序列提交Gen Bank数据库获得登录号为MG744514,与来自于Gen Bank数据库图兰扇头蜱、血红扇头蜱、微小牛蜱、边缘革蜱、草原革蜱、长角血蜱、小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱、残缘璃眼蜱、全沟硬蜱及外围群尘螨的22个12S r RNA基因序列的进化树显示,研究所获得的蜱12S r RNA基因序列与图兰扇头蜱进化关系最近,聚在同一个小分支;确定了该扇头蜱为图兰扇头蜱。5只产卵后的雌蜱和相应蜱所产的全部卵立克次体16S r RNA基因PCR扩增,有1只蜱和其产的卵样品阳性,蜱携带率为20%;雌蜱及其卵立克次体16S r RNA基因测序结果完全一致;Blast分析与Gen Bank数据库中Rickettsia raoultii 16S r RNA基因序列相似性高达99%以上,且高相似性前五基因序列为4个Rickettsia raoultii和1个Rickettsia sp.,其中包括来自新疆2011年的亚洲璃眼蜱和草原革蜱的立克次体;立克次体16S r RNA基因序列提交Gen Bank数据库获得登录号为MG744513,与来自于Gen Bank数据库的37个24种立克次体16S r RNA基因序列的进化树显示,研究获得的立克次体16S r RNA基因序列与Rickettsia raoultii进化关系最近,聚在同一个小分支,与其他15种立克次体同属于斑点热群立克次体;确定了本研究图兰扇头蜱及其卵均携带斑点热群立克次体R.raoultii。【结论】首次发现图兰扇头蜱及其卵携带R.raoultii。