棉花精氨琥珀酸合成酶基因GhASS1的克隆及表达分析

【目的】克隆棉花精氨琥珀酸合成酶基因GhASS1的cDNA序列,并利用原核表达系统高效表达融合蛋白,检测融合蛋白的精氨琥珀酸合成酶活性及其表达对工程菌生长、耐盐能力及与游离L-瓜氨酸（L-Cit）和L-精氨酸（L-Arg）含量的影响,为解析该基因的功能及作用机制奠定基础。【方法】以拟南芥推断的精氨琥珀酸合成酶cDNA序列作为探针,利用电子克隆和RT-PCR技术,从棉花幼叶中获得cDNA片段,T/A克隆测序后得其序列信息,利用生物信息学软件分析其DNA结构、蛋白质结构、功能域和同源性,并构建系统进化树。利用qRT-PCR检测其在盐胁迫下的表达模式;将GhASS1的开放阅读框连接到原核表达载体pCold-TF上,构建融合表达载体pCold-GhASS1,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中进行IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE法测定表达产物分子量,焦磷酸荧光法测定酶活性和比活力,HPLC法测定工程菌中L-Cit和L-Arg的含量,对比不同温度和不同NaCl浓度下工程菌与对照菌的生长速度及其体内L-Cit、L-Arg含量及L-Arg/L-Cit。【结果】棉花GhASS1存在于D基因组的第1染色体上,由10个外显子和9个内含子构成,其cDNA全长序列共1 584 bp,其中5′非翻译区22 bp,开放阅读框1 485 bp,3′端非翻译区77 bp,编码产物由494个氨基酸组成,推断分子量为54 kD,等电点6.74;序列比对分析表明GhASS1与大肠杆菌、酵母和拟南芥中同源蛋白序列一致性分别为21.81%、41.1%和78.5%,且具有典型的精氨琥珀酸合成酶结构模序;系统进化分析显示GhASS1与番茄、马铃薯和烟草中同源蛋白亲缘关系最近,而与云杉、卷柏中同源蛋白亲缘关系最远;盐胁迫可上调叶片中GhASS1的表达,1 d时达到峰值,随后逐渐下降,推测GhASS1参与棉花对盐胁迫的早期响应。表达载体pCold-GhASS1在工程菌中表达的融合蛋白分子量约108 kD,与预期相符,在体外具有精氨琥珀酸合成酶活性;与对照菌相比,pCold-GhASS1工程菌中游离L-Cit含量下降,L-Arg含量上升,且在生长周期中较快进入对数生长期;在含高浓度NaCl的培养基中pCold-GhASS1工程菌表现出更强的生长活力和较高的L-Arg/L-Cit值,显示了其具有较强的L-Cit向L-Arg的代谢流。【结论】从棉花中克隆了植物精氨琥珀酸合成酶基因cDNA序列GhASS1,推测其在植物体内可参与植物的生长和耐盐能力的调控。     

不同浓度氨基酸对仔猪原代肝细胞尿素循环的影响

【目的】研究不同浓度的氨基酸对仔猪原代肝细胞尿素循环的影响及其机理。【方法】5日龄仔猪门静脉灌流后从中分离纯化出肝细胞并进行培养,在培养基中添加不同浓度的氨基酸(分别为猪血液中氨基酸生理浓度的1、2和4倍),24 h后收集上清和细胞。用比色法检测上清中尿素、底物氨和细胞中氨的浓度以及谷氨酰胺酶(Glutaminase,GLS)和谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)的活性,实时荧光定量PCR法检测细胞中氨甲酰磷酸合成酶1(Carbamyl phosphate synthetase 1,CPS1)、精氨基琥珀酸合成酶(Argininosuccinate synthetase,ASS)、精氨琥珀酸裂解酶(Argininosuccinate lyase,ASL)、鸟氨酸氨甲酰转移酶(Omithine transcarbamylase,OTC)和精氨酸酶(Arginase,ARG)等尿素循环相关酶基因m RNA的表达。【结果】4倍氨基酸组显著提高了仔猪原代肝细胞培养上清中氨和尿素的浓度,增强了细胞中GLS的活性。荧光定量PCR结果表明,4倍氨基酸组显著提高了细胞中CPS1、ASS和ASL等基因m RNA的表达。1.0和2.0 mmol·L~(-1)的NH4Cl显著促进细胞尿素的合成。【结论】在仔猪原代肝细胞中,高浓度氨基酸可以通过提高GLS的活性等途径加速氨的积累,促进CPS1、ASS、ASL等尿素循环相关酶基因m RNA的表达,从而促进尿素的生成。     

芒果精氨酸脱羧酶基因MiADC的克隆及表达分析（英文）

精氨酸脱羧酶(Arginine decarboxylase,ADC)在植物多胺生物合成中发挥着重要作用。为了研究精氨酸脱羧酶基因(ADC)在芒果中的结构与表达情况,试验采用RACE技术从芒果嫩叶中克隆获得芒果精氨酸脱羧酶基因MiADC,并以MiADC基因的cDNA序列为基础,采用qRT-PCR分析该基因的表达情况。序列分析结果显示:芒果MiADC基因全长3 089 bp,包括575 bp 5’-UTR,2 178bpORF,311bp3’-UTR和25bppoly(A),且无内含子。NCBI比对分析显示:该基因与枳(Poncirus trifoliate)精氨酸脱羧酶基因(HQ008237.1)的相似性最高,为78%;其预测蛋白同样与枳(Poncirus trifoliate)精氨酸脱羧酶(AEE99192.1)的相似性最高,为78%。系统发生树分析表明:芒果MiADC与枳(Poncirus trifoliate)的精氨酸脱羧酶处于同一进化枝上。表达分析显示:MiADC基因在根、茎、叶、花、幼果、成熟果组织中均有表达,且该基因的转录水平受低温处理的影响。因此,芒果MiADC基因可能是一个低温胁迫应答基因。     

促生解淀粉芽胞杆菌SQR9定殖对黄瓜根系基因表达的转录组学研究

[目的]本文旨在阐明黄瓜植株接种促生解淀粉芽胞杆菌SQR9后其根系基因的表达谱变化特征,从植物响应微生物的角度揭示植物根际促生细菌(plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)的作用机制。[方法]利用Illumina高通量测序技术研究接种菌株SQR9对黄瓜根系基因表达谱影响的转录组特征,对显著差异表达基因进行GO功能和KEGG富集分析。[结果]与未接种的对照黄瓜植株比较,菌株SQR9接种72 h后黄瓜根系有484个基因的表达发生显著变化,包括300个上调基因和184个下调基因。Real-time PCR验证表明基因表达差异趋势与转录组测序结果一致,证明测序结果可信。黄瓜根系响应菌株SQR9的差异基因主要参与碳水化合物代谢、氨基酸代谢、次级化合物代谢和信号转导途径等。在植物促生方面,氨基酸代谢途径中ASP1基因(编码天冬氨酸转氨酶)表达上调约4倍;糖酵解途径中PDC基因(编码丙酮酸脱羧酶)和卡尔文循环中FBA6基因(编码果糖二磷酸醛缩酶)表达均上调3～5倍;生长素响应途径中编码生长素抑制子的IAA8基因表达显著下调,而编码响应蛋白的基因SAUR77和SAUR21表达均上调3倍左右,表明菌株SQR9产生的外源吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)激活了植物内源的IAA信号途径。在植物免疫方面,免疫信号途径转录因子的编码基因WRKY29和ERF1B表达上调,激活植物系统抗性并有助于提高抗病能力;编码抗胁迫因子的C_4H和ADH1基因表达也显著上调,提高植物抗逆能力。[结论]菌株SQR9可通过调控黄瓜根系代谢相关基因表达和激活免疫途径相关基因的方式促进黄瓜植株生长并提高其抗病能力。     

慢性缺氧对小鼠成纤维细胞氨基酸代谢通路基因表达的影响

目的 观察低氧诱导小鼠成纤维细胞L929中氨基酸代谢相关基因mRNA表达变化.方法 L929细胞分别在20％ O2和1％ O2环境中培养24 h,提取总RNA,Agilent mRNA芯片检测基因表达,分析与氨基酸代谢相关的差异表达基因及其信号通路.结果 低氧诱导24 h后,17个氨基酸代谢相关基因出现2.18～6.34倍差异表达(Ddc、Ogdh、Wars2、Il4i1、Haao、Ogdhl、Ehhadh、Cyp1a1、Gls2、Adc、Nos2、Nos3、Dao、Gls、P4ha1、P4ha2、Pycr1),其中14个表达上调,3个表达下降.富集分析表明差异基因聚集在色氨酸(P=0.0 195)、精氨酸和脯氨酸代谢通路(P=0.0297).结论 低氧可诱导小鼠L929细胞发生氨基酸代谢相关基因差异表达,其中色氨酸、精氨酸和脯氨酸代谢通路基因变化最显著.     

棉花E3泛素连接酶基因GhRING1-like的克隆及功能分析

[目的]RING(really interesting new gene) finger E3泛素连接酶在植物生长发育和抵御环境胁迫中具有重要作用。克隆棉花RING finger E3泛素连接酶基因GhRING1-like并分析其表达特征和功能,为该基因分子作用机制研究和育种应用奠定基础。[方法]根据棉花表达谱分析,选取并克隆干旱胁迫处理上调表达基因GhRING1-like,qRT-PCR分析GhRING1-like的组织表达特性及其对不同非生物胁迫和激素处理的响应模式;采用瞬时表达对GhRING1-like-GFP融合蛋白进行亚细胞定位分析;通过获得病毒介导的基因沉默(VIGS)棉花和过表达拟南芥植株,分析沉默或过表达GhRING1-like对植株生长发育及其抗旱性的影响。[结果]GhRING1-like基因序列全长996 bp,编码332个氨基酸,其C端含有RING-H_2(C3H_2C3)结构域。GhRING1-like定位于内质网上。GhRING1-like在叶片中优势表达; 200 g·L~(-1)PEG6000诱导处理1 h后瞬时显著上调表达12倍; GhRING1-like对Na Cl、ABA和SA的响应时间都在处理后3 h,上调表达均在5倍左右。干旱胁迫处理后,VIGS沉默GhRING1-like棉花叶片相对含水量和叶绿素荧光参数Fv/Fm分别较未沉默对照降低17.1%和30.6%,而电解质渗透率和丙二醛含量分别较对照提高70.8%和100%。过表达GhRING1-like显著提高了拟南芥种子萌发和幼苗期对于甘露醇引起的渗透胁迫的耐受性;可使营养生长中后期阶段的拟南芥在水分亏缺处理下的存活率提高2.4倍;转基因拟南芥叶片气孔开度降低51.2%,失水率明显降低。干旱胁迫下,过表达GhRING1-like使依赖于ABA诱导表达的At AREB1、At ERD15、AtRD29A上调表达,而对不依赖ABA的干旱胁迫诱导基因At DREB和脯氨酸合成基因At PLD没有影响。[结论]棉花GhRING1-like参与了植物非生物胁迫抗性的调控,主要通过依赖于ABA通路正向调控植物的抗旱反应。     

NaCl处理对小果白刺叶片主要渗透调节物质和 激素水平的影响

以1年生小果白刺幼苗为试验材料,采用水培处理法,研究不同处理时间(1 d和14 d)及不同浓度的NaCl(0、100、200、300、400 mmol·L~(-1))对小果白刺叶片中可溶性糖、氨基酸类等主要渗透调节物质及ABA(脱落酸)、IAA(生长素)、GA(赤霉素)、ZR(玉米素核苷)等植物内源激素变化的影响,探讨小果白刺对NaCl处理的生理代谢机制。结果表明:小果白刺叶片中可溶性糖质量分数在NaCl处理1 d时,随着NaCl的浓度的升高逐渐减少;在NaCl处理14 d时,随着NaCl摩尔浓度的升高可溶性糖质量分数逐渐增加。小果白刺叶片中脯氨酸质量分数和总氨基酸质量摩尔浓度在NaCl处理1 d时具有相似的变化趋势;NaCl处理14 d时,脯氨酸质量分数随NaCl浓度的升高而增加,而总氨基酸质量摩尔浓度只有在D处理(400 mmol·L~(-1)NaCl)时高于对照。ABA质量分数随着NaCl浓度的升高及处理时间的延长而增加。IAA和ZR质量分数在NaCl处理下,具有相似变化趋势,随NaCl处理时间的延长而减少,随NaCl浓度的升高而表现为先增加后减少,在A处理(100 mmol·L~(-1)NaCl)时,IAA和ZR质量分数最高。GA质量分数随NaCl处理浓度的升高而不断增加,在低浓度处理时增量较小,而高浓度处理增量较大;经长时间NaCl处理后,GA质量分数维持在相对较高水平。因此,小果白刺对盐渍环境的生理代谢响应机制是通过ABA质量分数的增加及IAA质量分数的减少等调控生理代谢和生长,改变正常代谢途径,进而促进可溶性糖及脯氨酸等主要渗透调节物质的积累进行渗透调节。     

外源氮对盐胁迫条件下长春花生长和氮代谢途径的影响

以药用植物长春花(Catharanthus roseus(L.)G.Don)为对象,研究不同形态外源氮供应条件下,长春花生长发育与体内氮代谢响应盐胁迫的变化特点。结果表明,无盐胁迫条件下,不同形态氮源供应对长春花生长影响不显著,但硝态氮与氨态氮混合供应的情况下,硝酸还原酶(NR)和谷氨酰胺合成酶(GS)的活性及游离氨基酸总质量分数显著高于其他氮源条件下的;在盐胁迫条件下,硝态氮和氨态氮混合供应显著增加了叶片生物量积累,同时,NR活性也显著提高。总体上,混合氮源供应可以减少盐胁迫对长春花的伤害。这种作用可能与氮代谢过程中关键酶活性的增加有关,特别是与氨代谢有关的酶有关,适量的氨离子可以节省植物代谢硝态氮的能量。     

不同品种哺乳仔猪精氨酸代谢特性比较研究

我国地方品种猪与外来猪生长速度差异明显。鉴于精氨酸对仔猪生长发育的重要性,本研究选用14日龄哺乳的宁乡猪、湘西黑猪、蓝塘猪、巴马香猪、环江香猪和长白猪各12头,公、母各半,前腔静脉采血,离心分离血清,测定其中游离精氨酸和一氧化氮(NO)的浓度;采集肠道、肌肉、肝脏和肾脏等组织,测定其中的游离精氨酸浓度和NO合成酶(NOS)活性以及N-乙酰谷氨酸合成酶(NAGS,内源性精氨酸合成限速酶)mRNA的绝对表达量。结果表明,长白猪的血清精氨酸浓度显著高于(P<0.05)其他地方品种猪,血清NO浓度高于(P＞0.05)其他地方品种猪;各品种猪空肠前段和肝脏中的NOS活性最高,肾脏中的NOS活性最低;长白猪的空肠前段NOS活性仅低于宁乡猪,肝脏NOS活性仅高于环江香猪;在各个组织均检测到NAGS mRNA不同程度的表达,其中肠道和肝脏中的表达水平最高。综上所述,本研究揭示了不同品种哺乳仔猪血清精氨酸和NO浓度、3种主要组织游离精氨酸含量和NOS活性以及12种组织中NAGS基因的表达谱差异,为解释不同品种猪的生长表型差异提供了营养生化基础。     

褪黑素对碱性盐胁迫下猴樟呼吸代谢相关酶活性的影响

碱性盐环境影响植物的生长发育，褪黑素能有效缓解盐碱逆境对植物的伤害，本研究以猴樟幼苗为材料，研究外源褪黑素处理对猴樟幼苗呼吸代谢相关酶活性的影响，以期为褪黑素处理提高植物耐碱性盐胁迫的机理研究提供依据。结果表明，30-50 μmol.L-1的褪黑素处理明显提高碱性盐胁迫下丙酮酸脱氢酶活性、柠檬酸合成酶活性、异柠檬酸合成酶活性、琥珀酸脱氢酶活性和苹果酸脱氢酶活性，100-150 μmol.L-1的褪黑素处理对呼吸代谢相关酶活性的促进作用不明显。结论，适宜浓度褪黑素处理能通过促进呼吸代谢提高猴樟幼苗耐碱性盐胁迫能力。     

棉花钠尿肽基因GhPNP1的耐旱功能分析

【目的】分析棉花中钠尿肽GhPNP1的结构特征、表达模式以及耐旱功能,并分析其耐旱机制,为将该基因应用于作物改良奠定基础。【方法】通过对从植物中水平转移到大丽轮枝菌中的钠尿肽基因AVE1进行同源性搜索,得到与AVE1蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列;使用MEGA5软件对AVE1蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树;利用MEGA和expasy在线工具进行蛋白序列分析;并根据编码该蛋白的核酸序列设计引物在陆地棉品种奥3503中克隆到其同源基因GhPNP1。使用多种生物信息学软件分析GhPNP1的分子特性,包括GhPNP1编码蛋白的等电点、分子量、信号肽、进化关系等进行预测分析。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析GhPNP1在不同器官部位的组织表达模式以及受到PEG模拟干旱胁迫处理后的表达模式。将GhPNP1的cDNA序列连入CLCrV沉默载体中,构建GhPNP1的病毒诱导基因沉默载体CLCrV:GhPNP1,转入农杆菌,并通过和辅助载体CLCrVB共侵润2叶期幼苗进行叶片注射,获得GhPNP1的沉默植株。利用PEG模拟干旱处理沉默植株检测其耐旱性,并测定沉默植株的失水率、相对含水量、丙二醛（MDA）含量、总抗氧化活性（T-AOC水平）、离子渗漏率等与植物抗逆相关的生理指标。【结果】从陆地棉奥3503中克隆到的GhPNP1的开放阅读框长度为396 bp,编码131个氨基酸,信号肽长度为15个氨基酸,通过系统进化树分析GhPNP1编码的蛋白含有保守的钠尿肽结构域,与可可树的PNP蛋白进化关系最近。GhPNP1在棉花植株的根、茎、叶中均表达且在茎中表达量较高,PEG模拟干旱处理后根、茎、叶中的GhPNP1均上调表达。GhPNP1沉默后棉花植株耐旱性显著降低。在干旱条件下,GhPNP1沉默植株的MDA含量、离子渗漏率、叶片失水率均高于对照的未沉默植株;而沉默植株的总抗氧化能力（T-AOC水平）、相对含水量显著低于对照的未沉默植株。【结论】从棉花中克隆得到一个植物钠尿肽基因,受干旱胁迫诱导上调表达,沉默后耐旱性降低。推测GhPNP1可能通过cGMP信号途径参与棉花的干旱胁迫,在干旱胁迫下对棉花耐旱性起正调控作用。     

高温对转基因抗虫棉中Bt杀虫基因表达的影响

 Bt抗虫棉中Bt杀虫基因能否稳定表达是影响转基因抗虫棉应用前景和商品化生产的重要因素。以转基因双价抗虫棉139-20的R5代材料，通过不同温度处理，研究温度处理对Bt杀虫基因表达的影响。结果表明，温度变化影响抗虫棉早期的生长发育和Bt杀虫基因的表达，从而影响了抗虫棉生长发育过程中Bt杀虫蛋白含量降低的时间。高温处理后可使Bt杀虫基因在生长发育期中的沉默时间提前，导致Bt杀虫蛋白含量急剧降低，具体原因可能是由于转录后水平的基因表达调控，引起特异Bt 杀虫基因mRNA的降解。因此，在生产实际中，应予以提前采取措施，预防高温期棉铃虫危害。     

棉花S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及表达分析

利用i TRAQ技术从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)HM-40中筛选并克隆到S-腺苷甲硫氨酸合成酶Gh SAMS基因。Gh SAMS基因的开放阅读框全长为1 182 bp,编码393个氨基酸,预测Gh SAMS蛋白质含有15个磷酸化位点,推测其功能的行使可能与激酶磷酸化相关,进化分析表明S-腺苷甲硫氨酸合成酶与茶树(Camellia sinensis)的SAMS蛋白质相似性最高。q RT-PCR分析表明,在接种黄萎病菌VD07菌系后,Gh SAMS表达量逐渐增加,随着接种时间的延长,其相对表达量随之增加,推测其在陆地棉抗黄萎病防卫反应中可能起重要作用。在嫁接棉株中,利用VIGS技术成功地沉默Gh SAMS基因,然后对沉默棉株接种黄萎病菌VD07,鉴定其病情指数为62.5,抗性级别为感病;而转化空载体和未接种载体处理的嫁接棉株病情指数分别为30.0和31.2,抗性级别为耐病,表明Gh SAMS基因沉默后嫁接棉对黄萎病的抗性丧失。推测Gh SAMS基因在陆地棉抗黄萎病的过程中可能起重要作用。     

酵母耐盐相关基因HAL1在棉花中的功能表达

【目的】克隆酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）耐盐基因HAL1（halotolerance）并转化棉花,探究该基因在棉花中的功能,进一步探究酵母耐盐相关基因在高等植物中的具体功能。【方法】根据NCBI核酸数据库中酵母耐盐基因HAL1的mRNA全长序列信息,利用RT-PCR技术从酿酒酵母As2.375中克隆该基因。选择酶切位点XbaⅠ和SmaⅠ对表达载体pBI121::GFP进行双酶切,采用In-Fusion技术构建pBI121-ScHAL1::GFP融合表达载体。以自发荧光较弱的陆地棉品种Y-2067、ZA-23、GZ-2的花粉为材料,用基因枪轰击棉花花粉进行瞬时表达研究。采用基因枪活体转化技术将外源基因表达载体pBI121-HAL1::GFP转化棉花盐敏感材料中s9612,获得T0棉花转基因种子。用100 mmol·L^-1 NaCl盐溶液对转基因T0种子进行耐盐性发芽试验,并进行分子检测,对鉴定出的转基因植株进行叶盘耐盐性分析。【结果】从酿酒酵母As2.375中克隆耐盐基因ScHAL1,基因全长885 bp,共编码294个氨基酸。对其序列进行分析,发现HAL1蛋白中丝氨酸所占比例最大,整个蛋白呈碱性且带正电,属于亲水性蛋白。根据蛋白二级结构预测结果,推测该蛋白的结构功能域可能主要由无规则卷曲和β-折叠片构成。棉花花粉瞬时表达结果表明,转化HAL1后,3种陆地棉花粉的绿色荧光现象都明显增强,说明该基因可以在这3种陆地棉的花粉中表达。用100 mmol·L^-1 NaCl盐溶液对转基因棉花T0种子和受体材料中s9612自交种进行胁迫,发现转基因种子萌发能力明显强于受体材料,表明HAL1可以提高种子耐盐性。根据基因核苷酸序列设计2对引物对T0转基因棉花幼苗进行分子检测,将纯化后的PCR产物进行直接测序,测序结果证明转基因成功。对鉴定出的转基因植株进行叶盘耐盐性分析发现,在600 mmol·L^-1 NaCl和400 mmol·L^-1 NaCl盐胁迫下转基因植株叶盘叶绿素含量均高于对照植株,且在600 mmol·L^-1 NaCl溶液胁迫后,转HAL1植株叶绿素含量反而高于400 mmol·L^-1 NaCl溶液处理后的叶盘。【结论】成功从酿酒酵母中克隆基因HAL1,酵母HAL1对提高棉花耐盐性具有重要作用。     

陆地棉细胞色素P450超家族基因GhCYP85A2-1的克隆与功能分析

【目的】研究细胞色素P450超家族CYP85A亚家族基因在棉花株高发育中的生物学功能,为陆地棉株高分子育种提供理论依据和基因资源。【方法】 采用同源克隆方法,从陆地棉中克隆CYP85A家族基因GhCYP85A2-1,利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)诱导的基因沉默技术(Virus-induced gene silencing, VIGS)构建GhCYP85A2-1基因沉默载体,利用qRT-PCR技术检测侵染棉花幼苗的基因表达量。【结果】 GhCYP85A2-1基因沉默植株的株高显著降低,基因的表达量也显著下降。【结论】 GhCYP85A2-1基因在棉花株高发育过程中起到重要调控作用。     

陆地棉GhBI-1基因在拟南芥中的异位表达及耐盐性研究

前期工作中,我们从陆地棉基因组中分离了GhBI-1基因全长cDNA,构建了GhBI-1过量表达载体并转化拟南芥。本研究在此基础上,利用卡那初步筛选获得转基因拟南芥,通过PCR进一步验证,得到具有卡那抗性并且遗传稳定的T3代纯合株系。利用不同浓度NaCl处理野生型和转GhBI-1基因拟南芥,结果表明,转基因拟南芥在200 mmol/L NaCl胁迫后,萌发率和生长情况要好于野生型拟南芥,过量表达GhBI-1基因能够提高拟南芥耐受盐胁迫的能力。     

陆地棉盐胁迫应答基因GhPEAMT1的克隆及功能分析

【目的】磷酸乙醇胺N-甲基转移酶（phosphoethanolamine N-methyltransferse,PEAMT）是植物磷酸胆碱合成的关键酶,而磷酸胆碱是可以增强植物抗性的甘氨酸甜菜碱合成底物胆碱的前体。通过对陆地棉磷酸乙醇胺N-甲基转移酶基因（GhPEAMT1）的克隆、表达模式分析,以及功能验证,探究GhPEAMT1在陆地棉响应盐胁迫中的生物学功能,为棉花耐盐品种的选育提供基因资源。【方法】根据转录组测序数据分析,最终确定GhPEAMT1为耐盐候选基因;通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因;通过生物信息学分析基因结构特征、预测蛋白质相对分子质量以及进化关系;利用荧光定量PCR（qRT-PCR）分析耐盐棉花品种早熟长绒7号和感盐棉花品种南丹巴地大花在NaCl胁迫后不同时间点不同组织的表达特征;构建亚细胞定位载体,进行烟草的瞬时转化,确定蛋白质在细胞中的位置;构建基因超表达载体,通过花序浸染法转化拟南芥,分析转基因拟南芥种子在盐胁迫下的萌发率和转基因拟南芥主根长度;利用病毒诱导基因沉默技术（virus induced gene silencing,VIGS）对早熟长绒7号棉花品种进行目的基因沉默,提取棉花叶片的RNA进行实时荧光定量用以检测基因沉默效率,随后用40 g·L^-1的NaCl溶液的处理对照棉花植株（CK）、注射TRV2:00的棉花植株、GhPEAMT1A和GhPEAMT1D沉默成功的棉花植株,测定棉花叶片过氧化氢酶（catalase,CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GPX）的活性。【结果】克隆获得GhPEAMT1的2个同源基因GhPEAMT1A和GhPEAMT1D,2个基因的CDS全长分别为1 488和1 485 bp;构建进化树发现,GhPEAMT1与海岛棉同源基因的亲缘关系最近,而与其他物种相比,与可可同源性最高;盐胁迫条件下,GhPEAMT1A和GhPEAMT1D在耐盐品种早熟长绒7号叶片和根中的表达量显著高于感盐品种南丹巴地大花。亚细胞定位显示该基因位于细胞质中;超表达转基因拟南芥后,在100和150 mmol·L^-1 NaCl的MS培养基上,转基因拟南芥的种子萌发率显著高于野生型拟南芥。在50和100 mmol·L^-1 NaCl的MS培养基上,转基因拟南芥的主根长极显著高于野生型拟南芥的主根长;用40 g·L^-1的NaCl溶液处理24 h后,GhPEAMT1A和GhPEAMT1D沉默成功的棉花植株叶片比CK和注射TRV2:00的棉花植株的棉花叶片萎蔫严重,盐胁迫后,与注射空载棉花植株相比,注射TRV2::GhPEAMT1A棉花植株过氧化氢酶（CAT）活性降低、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性降低。【结论】GhPEAMT1可以增强拟南芥对盐胁迫的耐性,GhPEAMT1能够响应盐胁迫并起正向调控作用。     

不同氮肥水平下叶面喷施烯效唑对套作大豆生长和氮代谢的影响

以大豆品种‘贡选1号’为试验材料,在玉米-大豆套作模式下,研究在不同氮肥水平下叶面喷施烯效唑对大豆植株生长和根系氮代谢的影响。结果表明:烯效唑在不同施氮水平下均具有显著的控旺效果,使株高、第1节间长以及株高/茎粗比值降低,茎粗、分枝数以及地上部干物质量增加;烯效唑促进植株氮代谢,使植株地上部、地下部全氮含量以及根系伤流量增多,伤流中NO3--N、NH4+-N含量、氨基酸总量以及天冬氨酸、苏氨酸等氨基酸含量上升,NH4+-N/NO3--N比值、谷氨酸、甘氨酸等氨基酸含量降低;在低氮肥水平(0kg.hm-2)下以喷施60mg.kg-1烯效唑,中氮肥水平(32.4kg.hm-2)下喷施30mg.kg-1烯效唑,高氮肥水平(64.8kg.hm-2)下喷施60、90mg.kg-1烯效唑效果较优,能有效控制植株地上部旺长和促进根系对氮素的吸收、同化能力、代谢能力,提高植株氮循环水平。     

GbCDPK83基因在干旱胁迫下的功能鉴定

为了探究 GbCDPK83基因在海岛棉响应干旱胁迫中的功能。利用PCR技术克隆 GbCDPK83基因，采用生物信息学方法分析GbCDPK83蛋白的理化性质、结构特征和在细胞中的位置，通过基因重组技术构建VIGS沉默载体并侵染棉花。本研究成功构建了沉默表达载体，沉默植株中 GbCDPK83的表达明显被抑制。干旱胁迫后， GbCDPK83沉默植株叶片比对照萎蔫更严重，相对含水量显著降低，相对电导率和丙二醛含量显著上升，脯氨酸含量升高但低于空载体及非转基因植株。沉默 GbCDPK83使海岛棉耐旱性减弱。