土壤微生物分子生态学研究方法

主要介绍了目前在土壤微生物生态学研究中的常用分子生物学方法,包括核酸探针杂交技术、基于PCR技术的研究方法、特异DNA片段的序列分析、DNA扩增片段梯度凝胶电泳检测技术等。     

基于物种特异性单一DNA标记扩增检测的食品真实性定性鉴别技术研究进展

脱氧核糖核酸(DNA)分析技术已经成为食品真实性鉴别中物种源性成分鉴定最主要也是最有效的技术,其中基于物种特异性单一DNA标记扩增检测的食品真实性定性鉴别技术是最准确可靠,也是目前最成熟、应用最广的技术。本文综述了该技术物种特异性单一DNA标记主要类型及目前常用的扩增检测技术优缺点,并探讨了该技术的未来发展趋势。     

三种土壤微生物总DNA提取方法的比较

本文对3种常用的土壤微生物总DNA提取方法Martin法、高盐改进法及试剂盒法进行了比较,并通过DNA得率、纯度及16S rDNA V3可变区的PCR扩增结合DGGE法（denatumg gradient gel electrophoresis）,分别对3种方法进行评价。结果表明,3种方法提取的DNA均能满足土壤微生物多样性分析的要求。其中试剂盒方法操作简单,提取的DNA质量较高,但DNA得率较低且成本昂贵。Martin法和高盐改进法用时较长,DNA得率较高,纯度较低,但对后续PCR扩增和DGGE分析没有明显影响,且成本低廉。     

甘蔗基因组DNA简单和快速提取方法

目前国内外关于提取DNA的方法很多(Honeycutt et al．，1992；顾红雅和瞿礼嘉，1998)，但因研究的对象和目的不同而有所差异。甘蔗含有大量的酚和多糖等有机物质，由于这些物质的干扰，按照常规提取植物组织总DNA的方法提取甘蔗基因组DNA，常常因产量小和纯度低而不能满足实验要求。本实验在前人研究的基础上(Honeycutt et al．，1992；顾红雅和瞿礼嘉，1998)，对所用药品及技术进行改进，摸索出一套快速、简便且可获得高质量基因组DNA的改良方法。用此方法提取的DNA进行酶切、RAPD和Southem杂交分析，都取得了良好的效果。     

基于锁式探针技术的番茄病原细菌DNA芯片快速检测技术

研究了番茄上番茄溃疡病菌、番茄细菌性叶斑病菌和番茄青枯病菌3种细菌的基于锁式探针扩增技术的DNA芯片检测方法。在锁式探针扩增方式上,选择连接酶依赖的PCR扩增,并用荧光素Cy3对扩增产物进行标记,结合DNA芯片技术进行研究,建立基于锁式探针技术的DNA芯片检测方法。结果显示,该方法能从供试的10菌株中分别检测出番茄上3种病原物;基于锁式探针技术的DNA芯片检测方法特异性强,在供试的菌种中,只有靶标细菌能被特异性地检测到,其他菌株检测均为阴性;基于锁式探针技术的DNA芯片检测方法灵敏度高,最低检测DNA浓度为500 fg/μL,比常规PCR检测灵敏度高出1个数量级;混合锁式探针与混合DNA的DNA芯片检测,能特异地检出靶标菌,适合口岸番茄种子的多病原高通量检测。     

RAPD技术在葡萄种质鉴定上的应用

为建立一种简单，快捷的方法以鉴定葡萄（Vitis)种质资源，对CTAB，SDS和高盐法3种DNA提取方法进行了比较。结果表明，改良的CTAB法较为适合葡萄基因组DNA的提取。通过对TaqE,Mg^2 ,dNTP，模板DNA，Primer不同浓度的优化实验以及对PCR反应程序的筛选，建立了适合葡萄基因组RAPD分析的技术体系。运用该体系对部分葡萄品种进行RAPD分析。结果表明，采用适合的引物在该体系条件下能够达到鉴定葡萄种质资源的目的，并可应用到葡萄的遗传图谱，指纹图谱及分子标记等分子生物学的研究中。     

小麦SSR分析体系的简化

摘要：SSR标记被广泛地用于小麦遗传育种研究，其技术流程主要包括基因组DNA提取、PCR扩增和PAGE凝胶电泳与染色。为了降低试验成本、缩短试验周期，建立一套经济、快捷的SSR分析体系，（1）比较了不同提取方法提取的DNA和从小麦幼苗叶片、种子和种胚中提取DNA的效果；（2）比较了不同的PCR反应体系；（3）比较了几种PAGE胶银染方法。结果证明，以简化CTAB法提取的小麦种胚DNA为模板，采用10µLPCR反应体系和快速银染法染色可以得到与原方法同样的效果，节省了50%的试验时间和50%的试验成本。     

水产品产地溯源技术研究进展

对水产品进行产地溯源和真实性研究,不仅为食品安全提供保障,而且有利于保护消费者权益。本文综述了稳定同位素技术、 DNA分析技术、矿物元素指纹图谱技术、气相色谱技术及近红外光谱技术在水产品产地溯源和真实性研究中的应用研究进展,并对其研究发展趋势进行展望。     

猪基因组AFLP指纹图谱的构建

摘要：对猪（Sus scrofa）基因组AFLP指纹图谱构建的各项条件进行了优化,包括双酶切消化、接头连接、预扩增和选择性扩增、凝胶电泳银染技术及荧光标记检测法等,建立了稳定的猪基因组DNA的AFLP指纹图谱构建方法,采用E32/T32引物组合在45个猪种基因组混合DNA中检测到28个多态标记。     

叠氮溴化丙锭筛选环境活性微生物的原理及其应用

环境微生物总DNA主要来源于游离DNA以及活性和非活性微生物群。因此,单纯基于环境微生物总DNA的直接研究技术可能无法反映出环境中真实的活性微生物群落结构及组成,极易造成微生物丰度及群落多样性的高估,急需建立有效可行的活性微生物筛选方法。叠氮溴化丙锭(Propidium monoazide,PMA)是一种能够不可逆地共价结合死细胞DNA和胞外DNA (统称为relic DNA)的光敏性核酸染料,致使relic DNA被钝化,不能完成PCR扩增。基于此,结合后续荧光定量PCR和高通量测序等分子生物学技术,可快速、准确且高效地筛选区分出环境样本中的活性微生物类群。本文针对近几年关于PMA染料法在底泥、土壤和水体等常见环境样品中的应用研究结果进行综述,并探讨了目前PMA染料法应用中存在的问题,提出了相应的改进和完善对策,为深入研究复杂环境样品活性微生物类群及其结构功能提供了新思路。     

水稻DNA损伤修复同源基因纯合突变系的鉴定

在长期的进化过程中,生物逐步形成了应对各种DNA损伤的修复机制,以保护基因组的完整性,减轻或消除DNA损伤的影响。本研究通过同源搜索找到了与DNA损伤修复相关水稻同源基因,在水稻插入突变体库中搜索出插入突变系,并成功引进了其中的26份T1代突变材料。通过对插入位点的分子鉴定和进一步培育,获得了14份涉及8个水稻DNA损伤修复同源基因的T3代纯合插入突变系,并对其进行了初步的遗传分析和表型考察。这些纯合突变系涉及的水稻基因可能在DNA错配修复(Os02g0592300、Os09g0407600、Os10g0509000)和碱基切除修复(Os02g0465112、Os06g0643600、Os05g0567500、Os04g0673400、Os09g0420300)中发挥重要作用。与亲本相比,除1份材料外,其他纯合突变体系及其野生型姐妹系的结实率均有显著降低;某些纯合突变系的千粒重与亲本相比有显著下降。这些水稻DNA损伤修复基因突变系的育成为开展水稻DNA修复的遗传学和分子生物学研究以及培育抗逆水稻提供了珍贵的实验材料。     

蔺草基因组DNA提取方法的比较研究

以16个蔺草品种实生苗和4个蔺草品种组培苗为材料,探讨了CTAB改良法与DNA试剂盒法对蔺草基因组DNA提取质量的影响。结果发现,对于同一品种而言,CTAB改良法提取获得的DNA A260nm和OD值远低于试剂盒提取法,前者的DNA浓度仅为0.65~4.90μg/ml,而后者则为5.10~32.80μg/ml,后者为前者的1.6~21.2倍。这表明试剂盒提取法更适合于蔺草基因组DNA的提取。试验还发现提取材料对基因组DNA的质量有显著影响,蔺草组培苗优于实生苗。     

苦瓜ISSR扩增条件优化的研究

本文对ISSR-PCR扩增苦瓜基因组DNA的主要影响因子进行了筛选和分析。试验结果表明,25μl的反应体系中采用20~30ng的模板DNA、1μmol/L ISSR引物1、U Tag DNA聚合酶,以及48℃~52℃的复性温度为苦瓜ISSR-PCR扩增条件的最佳选择。苦瓜ISSR-PCR扩增条件的优化为进行苦瓜种群间遗传分化的研究奠定了基础。     

分子生物学与系统生物学技术在土壤污染微生物生态研究中的应用

综述了当前国内外应用于土壤污染生态研究中的各种分子生物学和系统生物学技术,包括核酸杂交和DNA指纹图谱分析技术以及宏基因组学、宏蛋白质组学和代谢组学等“组学”技术.阐述了这些技术方法的原理、应用以及各自的优势和局限性,并对这些新兴生物技术在土壤污染生态学中的应用前景作一展望.     

烯效唑干拌种对小麦种子萌发过程中DNA合成的影响

以小麦品种绵阳 2 6为材料 ,利用3 H TdR掺入法 ,研究了烯效唑干拌种对小麦种子萌发过程中DNA合成的影响。结果表明 :烯效唑处理后 ,小麦种子萌发早期DNA合成加快 ,当浓度为 2 0mg kg时 ,DNA合成速率最快 ;同时 ,在小麦种子萌发早期烯效唑处理促进3 H 胸苷掺入可能反映了烯效唑有助于萌发中DNA修复和DNA复制 ,为种子萌发奠定了较好的基础。     

耐辐射奇球菌Deinococcus radiodurans中非编码RNA

耐辐射奇球菌(Deinococcus Radiodurans)对电离辐射、紫外线以及强氧化剂等方面具有惊人的抗性。非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)在参与转录调控、RNA的加工与修饰、mRNA的转录、蛋白质的运输与稳定性调节等方面具有非常明显的作用。本文通过概率上下文无关算法(Stochastic ContextFree Grammar,SCFG),对耐辐射奇球菌R1菌株的基因间序列进行相似二级结构预测,结果发现,在耐辐射奇球菌R1基因组的非编码区存在28个非编码RNA家族。其中IRE家族成员最多,其次是Histone3、tRNA和SECIS家族。所发现的DicF与ctRNA_pGA1t、mRNA等家族成员为细菌所特有。与其他生物比较分析结果显示,可以用这些非编码RNA来研究耐辐射奇球菌的生物学功能,并为进一步研究其DNA损伤与修复分子机制提供依据。     

红豆草胚性细胞系和非胚性细胞系DNA代谢动态的研究

以红豆草无菌苗胚轴为外植体诱导愈伤组织,在此基础上建立了“胚性细胞系”和“非胚性细胞系”。应用放射自显影方法研究了这两种细胞系的DNA合成动态,結果表明:前者DNA合成十分活跃,且DNA合成只限于发生胚的单细胞和细胞群。这些细胞迅速分裂,分别发育形成不同阶段的体细胞胚,在这一过程中,DNA代谢呈现有规律的变化,到球形胚时,DNA合成速率达到最高峰。体细胞胚中各细胞DNA合成速率的差异与体细胞胚形态学极性存在明显的相关性。至于“非胚性细胞系”,在启动分裂和形成愈伤组织过程中也是以细胞DNA复制为基础的,但在该类细胞系中,无论是DNA合成速率还是~3H-胸苷标记的细胞频率都远低于胚性细胞系。DNA代谢动态在这两类细胞系中存在着明显的差异。     

空间环境诱变甜椒基因组DNA变异的分子检测

为明确空间环境对甜椒后代的诱变影响,本研究以空间诱变的甜椒第4代及其地面对照为主要研究材料,采用RAPD技术对二者的基因组DNA进行了扩增分析,并对部分差异片段进行了测序。结果发现:空间诱变的甜椒后代与其地面对照变异情况相比,SP4的基因组DNA发生了变异,共检测出8个多态性位点,在对照和变异体中各扩增出4个位点。对其中2条特异片段进行回收测序,序列同源性为97%。研究认为空间环境条件可以诱导甜椒后代植株基因组DNA发生变异。     

脂质体介导的外源基因在黄瓜悬浮细胞原生质体中的表达

本文用脂质体包裹质粒DNA,研究了不同制备方法,不同磷脂成分对包裹率的影响,以及超声处理对脂质体内质粒DNA稳定性的影响。用改进的脱水再加水法制备质粒脂质体,使包襄率由10—20％提高到60—70％。黄瓜悬浮细胞原生质体与包裹pUC12—CAT质粒的脂质体经PEG诱导融合,培养3天和6天后均测得较强的CAT活性,说明脂质体介导的外源基因己在黄瓜细胞中成功地表达。     

代谢谱技术及其在水稻研究中的应用

代谢谱技术是指某一个代谢途径中超过一个基因被干扰后,对该途径中的某种特定的代谢产物进行定量分析.代谢谱技术已被广泛用于品种分类与真实性鉴定、基因功能、代谢调控与系统生物学研究、转基因农作物的安全性评价等方面,并在农作物成分改良方面具有广阔的应用前景.代谢谱技术最早主要用于拟南芥的研究,在水稻中的应用目前相对较少.本文主...