芜菁花叶病毒的分离鉴定及其多克隆抗体的制备与应用

从呈花叶症状的芥菜病株上分离到毒源,经CP基因克隆、序列分析以及电镜观察鉴定为芜菁花叶病毒(turnip mosaic virus,TuMV).利用提纯的病毒免疫新西兰大白兔,获得TuMV多克隆抗体,其效价为1:40000,多抗仅对TuMV起特异性反应.以1:10000稀释度为TuMV多抗最适工作浓度,建立TuMV间接酶联免疫吸附测定法(ID-ELISA),该方法检测到提纯病毒的绝对量约1.765ng.说明本试验所建立的TuMV ID-ELISA检测方法可有效运用于TuMV的检测.     

大白菜、萝卜芜菁花叶病毒系统进化及CP序列分析

2015—2017年对采自山东、河南、辽宁、黑龙江及陕西等省份的具有TuMV症状的大白菜、萝卜样品进行检测,测序获得了214个TuMV CP序列。系统进化分析显示3个特点:各地大白菜、萝卜TuMV CP序列分离物大致归属于world-B和basal-BR 2个组;TuMV分离物归属既有寄主关联性,又有地域性;同一地点的物种内TuMV分离物表现较好的一致性,但也存在多样性。研究结果为十字花科蔬菜抗TuMV育种提供理论依据。     

外壳蛋白基因片段介导的高抗TuMV研究

为了获得对芜菁花叶病毒（TuMV）高度稳定的抗性,选取TuMV的外壳蛋白（CP）基因近3′端保守区共377 bp的核苷酸序列,构建了抗TuMV的发卡结构RNAi载体,并转化了TuMV的天然宿主拟南芥。转基因植株用北京地区TuMV主要流行的强致病株系BJ-C4人工接种。鉴定的8个转基因株系中有3个株系表现出对TuMV的高度抗性。定量PCR结果显示,高抗转基因株系体内几乎检测不到病毒的积累。     

新疆大白菜病毒病毒原类型鉴定

从昌吉、石河子和博湖等三地区采集32个大白菜病毒病标样,经寄主范围测定、病状反应、抗性测定、虫传特性观测、病毒粒子形态观察和血清学检测,确认新疆大白菜可被芜菁花叶病毒(TuMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和烟草花叶病毒(TMV)感染,其中以TuMV感染为主,CMV和TMV感染较少,也有复合感染(TuMV+TMV+CMV或TuMV+CMV)现象。     

本氏烟DnaJ-like蛋白在芜菁花叶病毒侵染过程中的作用

热休克蛋白40(HSP40)因其蛋白家族含有保守的J结构域又被称为DnaJ蛋白,其同源蛋白被称为DnaJ-like蛋白。研究表明,DnaJ蛋白家族响应了多种病毒的侵染,但发挥作用的方式各不相同。芜菁花叶病毒(TuMV)是一类重要的蔬菜病毒,给蔬菜生产造成严重经济损失。DnaJ-like蛋白是否响应TuMV侵染,是否在TuMV侵染过程中发挥作用目前尚不清楚。本实验在本氏烟中克隆了分属DnaJ蛋白A类亚家族和B类亚家族的16条基因;qRT-PCR分析表明,DnaJ-like蛋白家族基因在TuMV侵染后表达上调。分别沉默2个亚家族的典型基因NbJ1和NbJ5后,TuMV在沉默植株上的病毒积累量显著较少。结果表明,DnaJ-like蛋白可能在TuMV侵染过程中发挥作用,这为深入了解TuMV的致病机制提供了新思路。     

四川主要芥菜病毒种群分析

从涪陵、宜宾、南充、内江采集茎瘤芥、小叶芥、大叶芥和根芥病毒病标样共120份,用6种抗血清经酶联免疫吸附(ELISA)间接法检测。结果表明,TuMV 的74份,占样品数的61.66%。TuMV 与CMV 复合侵染的32份,占26.67%,其它病毒3份占2.50%,无反应的11份占9.17%.表明4种芥菜的病毒病主要是TuMV,其次为TuMV+CMV。     

侵染贵州甘蓝的芜菁花叶病毒 CP 基因序列分析

【目的】明确贵州省甘蓝芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)的发生分布,为科学防控提供指导。【方法】在贵州省安顺市、威宁县和修文县采集甘蓝病毒病样品,采用酶联免疫吸附试验法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和RT-PCR对病样进行TuMV检测,利用相关生物学软件分析TuMV CP基因序列的一致性,并构建系统进化树。【结果】152份甘蓝样品中66份检测出阳性,检出率为43.42%;测序的15个TuMV CP基因核苷酸同源性为88.70%～100%,与已报道TuMV 6个组的分离物构建系统进化树发现,14个分离物属于basal-BR,1个分离物属于world-B组。【结论】TuMV在贵州省甘蓝不同种植区普遍发生,且basal-BR为感染甘蓝的优势毒源。     

湖北省蔬菜病毒病主要毒原种类检测

采用斑点酶联免疫吸附法(Dot-ELISA)和RT-PCR法对采自湖北省7个地区的966份疑似感染病毒的蔬菜样本进行黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)、芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)、蚕豆萎蔫病毒(Broad bean wilt virus,BBWV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)共7种病毒的检测。结果显示检出阳性样本695份,占总样本数的71.9%。其中,十字花科蔬菜上主要毒原为TuMV,检出率高达86.4%,其次为CMV,检出率为26.7%;茄科、葫芦科和豆科蔬菜上主要毒原均为CMV,检出率分别为34.3%、59.2%和56.2%。CMV几乎能侵染所有蔬菜,为湖北省蔬菜病毒病的主要毒原。在检出的6种病毒中,存在TuMV+CMV、TuMV+BBWV、TuMV+CMV+BBWV、CMV+BBWV、CMV+ToMV和CMV+BBWV+TSWV+TMV等6种复合侵染类型,其中TuMV+CMV为十字花科蔬菜上的主要复合侵染类型,复合侵染率为23.8%,其他蔬菜上主要侵染类型为CMV+BBWV,复合侵染率为28.0%。     

芜菁花叶病毒萝卜与甘蓝分离物P3基因的克隆与序列分析

芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)危害范围广,变异快,对其序列进行分析,能对病毒的演变与进化有深入的了解,为抗病育种打下基础.P3蛋白是TuMV高度容易变异的蛋白之一,包含一个对Brassica属和Raphanus属不同宿主侵染能力的决定因子,决定了宿主范围.笔者分别从北京感病的萝卜和甘蓝上分离得到4个TuMV分离物BJ - R01和BJ - 1301、BJ - B02、BJB03.利用RT - PCR克隆了这4个分离物的P3基因,测定了它们的核苷酸序列,并进行了序列分析.结果表明,4个分离物的P3基因均为1 065个碱基,编码355个氨基酸.4个分离物P3基因的同源性较高,核苷酸序列同源性在92.6％ ～99.3％,氨基酸同源性在93.5％ ～99.7％.根据系统进化树分析,4个TuMV分离物均属于world -B组.经对宿主的致病性鉴定,4个TuMV分离物均为BR致病型.4个TuMV分离物对Brassica属植物均表现出强致病性,但对Raphanus属植物致病性显现出明显的差异.     

F_(2∶3)家系法鉴定大白菜TuMV分离群体单株抗性

为筛选与目的基因连锁更加准确的分子标记以及明确分子标记鉴定技术的准确率,同时为后期进行基因精细定位研究提供技术手段,本试验采用F_(2∶3)家系进行F_2单株的TuMV抗性鉴定。结果表明,122个大白菜抗TuMV材料8407和感病材料冠291的F_(2∶3)家系中,抗病的有98个,感病的有24个,经卡方测验,符合3∶1的分离比例,与以往对该群体F_2代TuMV抗性分离比例的研究一致,表明这种鉴定方法可行。本结果可为今后分离群体单株TuMV抗性的准确鉴定提供参考。     

萝卜病毒病潜育期与抗病性的相关性研究

48份萝卜品种(包括自交系和品系)在室内援种TuMV试验结果表明:萝卜对病毒病的抗性与潜育期呈显著正相关。抗病性不同的萝卜潜育期长短有明显差异,最长的达25天,最短的只有11天。室内鉴定与田间鉴定结果一致。因此,潜育期长短也许可作为萝卜抗病毒病的一个指标。此外,萝卜的苗期抗性与成株期一致,室内鉴定结果可用来估价萝卜对病毒病的田间抗性。     

甘蓝3种病害抗源筛选及抗病品种选育研究

选用不同区域带有 Tu MV、黑腐病、CMV3种病害的发病甘蓝植株 ,通过分离提纯获得病原物。利用 3种病原菌苗期室内人工接种鉴定和田间自然诱发鉴定相结合的方法 ,筛选出甘蓝 3种病害抗源材料 H85 0 1和B85 0 2。以抗源为亲本与其他 8份优良抗病自交系杂交 ,进行配合力测配和抗病性鉴定筛选育成经济性状优良 ,并抗 Tu MV、黑腐病和 CMV3种病害的甘蓝品种秦甘 70和秦甘 80。     

甘蓝多抗性抗源筛选及抗病品种选配鉴定分析

通过对甘蓝种质材料815份自交系的主要经济性状和抗病性的初步选择,入选了比较优良的自交系612份。然后利用研究建立的甘蓝室内苗期TuMV、Br、CMV抗性鉴定方法,结合田间自然抗病性鉴定方法,鉴定筛选出H8501、B8502、J8806、B9505等4个抗源。并以抗源为母本,以经济性状优良,配合力高和抗病的另5个自交系为父本杂交18个组合。经对组合抗病性和主要经济性状鉴定分析,结果表现组合均抗病,同时优质性和丰产性均优良的有8个组合,其中4个组合参加品种区域试验并通过了省级和国家品种审定。     

萝卜病毒病与过氧化物酶关系的初探

萝卜接种TuMV病毒后过氧化物酶活性和同功酶电泳研究表明:萝卜对芜菁花叶病毒的抗性与叶片中过氧化物酶活性呈显著正相关。抗病的萝卜材料不管是否接种TuMV,过氧化物酶活性都明显高于感病植株。抗病萝卜最高达215.58酶活单位,感病萝卜最低的只有97.59酶活单位;前者比后者高121.13％。感病萝卜不接种病毒时,叶片中过氧化物酶活性很低。接种病毒后增加较多,但绝对数值还低于抗病萝卜。抗病萝卜叶片中过氧化物酶同功酶带宽于感病萝卜。初步认为过氧化物酶变化是萝卜抗病毒病的内在因素之一。     

不结球白菜抗芜菁花叶病毒基因的遗传分析及SSR标记

为了找到与不结球白菜抗芜菁花叶病毒(TuMV)基因连锁的分子标记,采用群体分离分析法(BSA法)和SSR标记进行了与抗病基因连锁标记的筛选。通过对亲本、F1、BC1和F2群体进行病毒接种,研究了试验材料对TuMV的抗性遗传模型,结果表明:不结球白菜对TuMV的抗性由显性单基因控制。通过SSR引物筛选,得到在双亲间稳定表现多态性的引物54对。用这些引物筛选抗感池,得到1个与芜菁花叶病毒抗病基因连锁的SSR标记Ra3E05,连锁距离为8.7 cM。将该标记测序,得到1条184 bp的序列,根据该序列重新设计引物,将SSR标记转化为序列特异扩展区城(SCAR)标记SCRa2,用F2群体对其验证,带型与原SSR标记表现一致,可用于分子标记辅助育种。     

甘蓝抗TuMV遗传规律的研究

本试验选用4个甘蓝高代自交系20-2-5-2-2-2-1,B_2-1-1,01-1-6-5-7-1-2和31-9-3-2-2作亲本,按 Griffing 双列杂交遗传交配设计方法,配制了 F_1,F_2及回交世代组合,全部试材进行苗期人工接种、抗病性鉴定。对试验结果进行方差分析、Vr/Wr 分析和 X_c~2 测定。试验结果表明,甘蓝对 TuMV 的抗性表现为完全显性,其抗病性受两对独立的显性基因控制,只要具备两对基因中的一个就表现为抗病。由于 F_1组合和 F_2及回交世代抗病性表现,说明正、反交抗病性差异不明显,细胞质遗传效应不显著。     

不结球白菜抗芜菁花叶病毒蛋白BcTuRsO的生物信息学分析

采用生物信息学方法,利用多种在线软件对不结球白菜抗芜菁花叶病毒(TuMV)蛋白BcTuRsO的系统进化、理化性质、亲水性、跨膜区、亚细胞定位、所含模体及蛋白质结构进行预测和分析。系统进化树分析结果表明,该蛋白在不同物种之间具有保守性。理化性质分析结果显示该酶含194个氨基酸,分子量为21 731.3,理论等电点pI值为6.60。TMpred跨膜分析结果显示,它含有1个显著的跨膜螺旋区,这个区域与ProtScale预测的疏水区基本重叠。用Target P server和WOLFPSORTserver程序预测该蛋白为细胞质蛋白。结构域分析结果显示该蛋白含多种磷酸化位点。二级结构以α-螺旋和随机卷曲为主。     

甘蓝对芜菁花叶病毒(TuMV)和黑腐病的抗病性鉴定

本文是全国“七五”攻关课题:“甘蓝优质、多抗、高产新品种选育”的一部分内容,从1986年到1990年期间,我院甘蓝抗病育种课题组对现有的甘蓝育种材料(包括自交系、自交不亲和系、杂种一代和品种)500多份进行抗TuMV和黑腐病的抗病性筛选。所用TuMV的毒原是“甘—83—8”号毒株,黑腐病菌也是本地区的代表菌株。采用攻关组统一制订的方法,筛选出双高抗的优良材料1份,其它有价值的抗病材料70多份,同时也对大量的育种材料作了抗病性方面的鉴定。