从棉花ESTs数据库中筛选微卫星标记的初步研究

利用生物信息学方法在含有94709条棉花EST序列的数据库中进行微卫星标记筛选,共发现微卫星序列4396个,占整个EST数据库的4.64%。其中双碱基重复序列1282个、三碱基序列2411个,分别占在EST数据库中发现微卫星序列总数的29.27%和54.8%。根据筛选到的微卫星序列设计并合成引物25对,其中24对引物有扩增产物,17对产物条带比较清晰,对这些条带比较清晰的产物作了一系列的分析。     

用磁珠富集法分离亚麻基因组微卫星分子标记

应用Dynal磁珠-生物素标记的微卫星探针(CT)₁₅与亚麻基因组DNA酶切片段杂交,捕获300~1 500 bp含有微卫星序列的DNA片段,连接到pMD18-T载体中,构建富集微卫星序列的小片段插入文库。利用接头引物和根据微卫星核心序列设计的引物VRV(CT)₁₅使用PCR方法直接对文库筛选,从422个转化子中获得了104个阳性克隆,对其进行测序分析,获得了97个微卫星序列,微卫星序列的富集效率达到22.99%,PCR扩增筛选效率93.27%。对97个微卫星序列进行比对分析,其中51个重复序列的两端序列高度相似,据其设计的特异引物对阳性克隆进行2次筛选,能淘汰相似度高的同类序列,提高筛选亚麻微卫星标记的效率。     

大白菜抗芜菁花叶病毒(TuMV)EST-SSR信息分析与引物筛选

为了研究大白菜抗芜菁花叶病毒(TuMV),对大白菜及芸薹属中与抗性有关的EST序列进行了搜索和SSR筛选,并根据SSR两端的序列设计引物,以1对大白菜TuMV抗、感材料的基因组DNA为模板,对上述引物进行了筛选。结果表明,在132条大白菜EST和895条芸薹属抗性EST序列中,共筛选出166个符合条件的SSR(16.2%)。其中包含6种核苷酸重复基元,占主导地位的分别是二核苷酸重复(33.7%)和三核苷酸重复(50.0%),其余重复类型所占比例较小。根据上述SSR两翼的序列,共设计引物196对。引物筛选结果表明,能够进行成功扩增的有156对,占79.6%,其中35对引物在2份材料中具有多态性。因此,利用芸薹属中抗性有关的EST序列设计SSR引物,可用于大白菜TuMV抗性有关基因的标记。     

构建黍稷分子遗传图谱SSR引物的筛选

采用SSR-PCR扩增技术,将实验室利用高通量测序与磁珠富集法结合开发得到的1 210对黍稷SSR引物进行筛选,筛选出在会宁大黄糜、陇糜8号、太原55号和会宁野糜子4个黍稷品种之间表现出条带清晰、多态性明显、重复性较好的引物;并通过提取DNA以及PCR过程中退火温度的简单优化来建立比较适宜的黍稷SSR分子标记反应体系。结果表明,在DNA提取过程中将ddH2O的量减少到100μL,增加65℃的水浴时间并增加4%β-巯基乙醇和DNA浓度等可以获得较高质量的DNA。利用优化好的反应体系从1 210对SSR引物中筛选出116对多态性较好的引物,占总数的9.59%,其中,群体一的2个亲本所特有的引物有36对,群体二的2个亲本中特有的引物有97对,2个群体共有的多态性引物有19对;对引物碱基结构分析发现,选用的1 210对引物中有1 173个双碱基重复SSR和36个三碱基重复SSR;筛选到的多态性引物中双碱基重复SSR有102个。三碱基重复SSR有14个。筛选出的多态性SSR标记能用于黍稷的遗传多样性和群体遗传结构研究。     

构建黍授分子遗传图谱ssR引物的筛选

采用SSR-PCR扩增技术,将实验室利用高通量测序与磁珠富集法结合开发得到的1210对黍援SSR引物进行筛选,筛选出在会宁大黄糜、陇糜8号、太原55号和会宁野糜子4个泰援品种之间表现出条带清晰、多态性明显、重复性较好的引物;并通过提取DNA以及PCR过程中退火温度的简单优化来建立比较适宜的泰援SSR分子标记反应体系。结果表明,在DNA提取过程中将ddH20的量减少到100μL,增加65℃的水浴时间并增加4%β-筑基乙醇和DNA浓度等可以获得较高质量的DNA。利用优化好的反应体系从1210对SSR引物中筛选出116对多态性较好的引物,占总数的9.59%,其中,群体一的2个亲本所特有的引物有36对,群体二的2个亲本中特有的引物有97对,2个群体共有的多态性引物有19对;对引物碱基结构分析发现,选用的1210对引物中有1173个双碱基重复SSR和36个三碱基重复SSR;筛选到的多态性引物中双碱基重复SSR有102个。三碱基重复SSR有14个。筛选出的多态性SSR标记能用于泰援的遗传多样性和群体遗传结构研究。     

基于松树EST序列的马尾松SSR引物开发

本文用生物信息学方法对松树359 521条EST进行处理,得到无冗余EST序列56 776条,其中有2 315个SSR分布于2 057条EST中,出现频率是4.08%,平均距离是22.06 kb.检测到二、三碱基重复SSR总数为1 631个,四碱基至六碱基重复SSR共117个.在所得二碱基以上重复SSR中,多态潜能高的有488个,占27.92%;多态潜能次高的有1 260个,占72.08%.选择整体长度不小于24个碱基的SSR位点用于开发马尾松SSR引物,设计出135对备选引物,最终有51对引物在马尾松中得到扩增,有效扩增率为37.78%;其中39对有多态性,多态率为28.89%.在51对可扩增引物所对应的SSR类型中,P型占74.51%,I型占3.92%,C型占21.57%.     

基于白木香转录组的SSR序列特征分析

为探究白木香的简单重复序列特征,开发SSR分子标记用于白木香种质资源的遗传分化和分子鉴定,本研究鉴定了白木香转录组unigene序列的SSR位点,对其SSR的分布及序列特征进行统计分析,进而设计SSR引物,并验证其SSR引物的多态性。结果表明,在128 712条unigene中共鉴定到9 362个SSR位点,分布频率为7.27%。SSR序列中双碱基重复序列最多,占总SSR的54.90%;白木香双碱基重复序列以AG/CT、AC/GT为主,占34.22%。SSR位点重复次数主要集中在5～11次,占总SSR位点数的96.56%,其中三碱基重复5次的SSR位点数最多,共有1 925个。设计并合成50对引物,其中35对引物可扩增出预期大小条带,扩增效率达到70%。以24个不同白木香个体对35对引物进行扩增,采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SSR引物多态性,表明SSR引物具有多态性。研究表明,白木香转录组SSR重复基元类型丰富,分布密度高,多态性高,可用于白木香资源的遗传多样性评价、遗传分化、种质鉴定和分子育种等后续研究。     

从小麦EST序列中开发新的SSR引物

小麦EST数量的迅速增加为开发新的SSR标记提供了宝贵的数据资源,本实验从国际小麦族EST协作网（ITEC）上公布的10 380条EST序列中检索到444条含有SSR的序列,检出率为4.1%。其中含二核苷酸重复单元和三核苷酸重复单元的SSR-ESTs分别为34条（7.7%）和347条（78.0%）。利用这些SSR-ESTs序列共设计135对cSSR引物,其中82对在小     

猕猴桃EST序列的SSR信息分析

从NCBI公共数据库中最新公布的猕猴桃表达序列标签（Expressed Sequence Tag,EST）中随机抽取56,400条序列,应用SSRHunter软件查找微卫星（Microsatellite,SSR）重复序列。研究结果表明,从猕猴桃EST序列中获得了7939条SSR,其中包括二核苷酸重复5131条（64.63%）,三核苷酸重复1237条（15.58%）,四核苷酸重复284条（3.58%）,五核苷酸重复397条（5.00%）, 六核苷酸重复890条（11.21%）。大约每2.48kb 长度的单一基因序列中即存在1个SSR, 即平均7个单一基因中存在1个SSR。二核苷酸重复序列是最丰富的重复单元,其次为三核苷酸重复和六核苷酸重复。在所获得的SSR重复单元中,AG/CT为优势重复,共分布4654条（90.70%）。通过筛查猕猴桃EST序列中的SSR,可为猕猴桃基于EST-SSR的分子生物学研究奠定理论基础。     

鸟巢蕨EST-SSR标记的开发与应用

为加速分子标记在鸟巢蕨研究中的应用,利用鸟巢蕨EST序列开展了EST-SSR标记的开发和应用研究。利用MISA软件对鸟巢蕨EST序列进行SSR位点查找,分析EST-SSR的总体特征,并利用Primer 3.0软件设计40对引物,选用10份蕨类材料检测引物的多态性。从42 907条鸟巢蕨EST序列中检测到6 067个SSR位点,其出现频率为1/6.62 kb,包括106种重复基元。在鸟巢蕨EST-SSR中,二核苷酸重复(2 873个,47.35%)是最主要的类型,其次是三核苷酸(1 107个,18.25%)和单核苷酸(972个,16.02%)。出现最多的重复基元是AG/TC(1 371个,22.60%),其次是CA/GT(1 066个,17.57%)和A/T(628个,10.35%)。设计合成了40对EST-SSR引物对10份蕨类材料进行PCR扩增,26对引物能扩增出明显条带,其中17对引物扩增出了65条多态性条带,平均每对引物多态性带为3.82条。遗传分析表明,10份蕨类材料之间的遗传相似系数为0.338~0.815,可将供试蕨类材料分为2个类群。从鸟巢蕨EST序列中开发SSR标记是有效和可行的,开发的EST-SSR引物可用于蕨类植物遗传分析研究。     

鹅掌楸EST-SSR引物开发及通用性分析

通过对6520条鹅掌楸EST序列进行检索,在364条ESTs中发现394个SSRs,鹅掌楸EST-SSRs平均密度为每8.5kb含有1个SSR;在检索出的SSRs中,二核苷酸重复单元的SSRs类型最多,占总数的61.9%。利用SSR-ESTs序列共设计176对EST-SSR引物,其中132对在鹅掌楸上有扩增产物,66对扩增出多态,多态性引物占所设计引物的36.9%。这批EST-SSR引物在物种之间具有较高的通用性。研究表明在鹅掌楸中表现多态的66对EST-SSR引物,85%在中国马褂木中有扩增,54%在白玉兰中有扩增。     

枳壳EST-SSR标记的开发

GenBank上已公布的枳壳EST序列为开发新的SSR标记提供了宝贵的数据资源。本研究利用在线SSR鉴定软件SSRIT分析来自枳壳EST数据库的11029条Unigene序列。分析结果共发现327条EST序列含有348个SSR位点,占总数的2.96%。其中,三核苷酸重复的SSR类型最多,共有161个,占检索总数的46.26%。Primer 3.0设计合成58对EST-SSR引物,其中36对能扩增出产物,6对引物产生多态性分离,分别占所设计引物总数的62.07%和10.34%。本文研究成果为今后枳壳遗传多样性分析、遗传图谱构建及比较基因组等研究方面奠定了基础。     

棉花非冗余性EST-SSR新标记的开发及其评价

利用Clustal X等软件对公共数据库现有的393 753条棉花EST序列分析,得到349 815条非冗余EST序列,借助自主开发的SSRmine软件共发掘SSR位点11 372个,分布于10 507条EST中,EST-SSR的频率是3%,平均相隔21 kb出现一个SSR。在2~6 bp的重复基元中,三核苷酸和六核苷酸分别占34.1%、40.6%,二、三、四、五和六核苷酸基序分别以AG/CT、AAG/CTT、AAAT/ATTT、AAAAG/CTTTT和AAAAAG/CTTTTT的类型最多。利用去冗余的且在亚洲棉、陆地棉、海岛棉中没有被开发过的410条EST序列设计开发了200对非冗余性SSR引物,利用自主开发的SSRD软件通过SSR引物序列下载、预处理、Blastn、提取相似性分值≥81%的引物编号、提取引物冗余对、冗余引物写成一行等6个步骤去除来源于自身部分同源序列以及与CMD释放的不同棉种相似性SSR引物,得到了非相似性引物,定名为CRIXXX (CRI即Cotton Research Institute)。并分别选用棉花12个种的代表性材料对其中100对进行引物功效评价,包括多态信息含量(polymorphism information content, PIC)及引物通用性研究。结果显示,从自主开发的100对SSR引物筛选出56对均能在12份材料间扩增出稳定明显的条带, 其中多态性引物35对,多态率占35%。引物的PIC变幅为0.097~0.888,平均为0.482;1对海岛棉EST-SSR引物在12份材料间的通用性为100%,25对亚洲棉引物通用性为81%,74对陆地棉引物通用性为80.1%。     

Identification and characterization of EST-SSRs in finger millet (<Emphasis Type="Italic">Eleusine coracana</Emphasis> (L.) Gaertn.)

In recent years, microsatellites have become the most used markers for studying population genetic diversity. The increased availability of the DNA sequences has given the possibility to develop EST-derived SSR markers. A total of 1,927 ESTs of Eleusine coracana available in the NCBI database were mined for SSRs. Di-nucleotides are the most occurring motifs accounting for more than 50% of the repeats, of which GA was the most abundant motif and tetra-nucleotides are the least occurring motifs. Of the 132 markers identified, 30 primer pairs based were synthesized. SSR markers were used for variety discrimination and genetic assessment in 15 finger millet accessions; 20 primers showed polymorphism and 13 primers were identified as having a PIC value above 0.5. On the basis of the distribution of these polymorphic alleles, the 15 accessions were classified into two groups. This study has demonstrated the potential of EST-derived SSR primer pairs in finger millet. These primers will serve as valuable source for further breeding programs.     

茶树花转录组微卫星分布特征

利用Perl语言,对茶树花转录组序列进行大通量SSR位点的发掘,发现含SSR的序列10 290条,共12 582个SSR,平均2.41 kb出现一个SSR。在茶树花的转录组中共发现340种碱基重复模式,所占比例最高的是(AG/CT)n(44.99%)。在49 586条注释成功的茶树花Unigene中,共发现10 490个SSR位点,其中位于编码区的1917个,其出现频率仅为0.102 SSR/1000 bp,而非编码区为3.072 SSR/1000 bp。在基因编码区中出现频率最高的是三碱基微卫星(1140,59.5%),其次是六碱基微卫星(524,27.3%)。茶树花转录组所含微卫星以重复长度小于20 bp的序列最多,大于20 bp的仅为25.2%。茶树花转录组中,含微卫星基因的平均表达水平显著低于不含微卫星基因,其中含复杂微卫星基因的平均基因表达水平最低。     

濒危珍稀植物半枫荷转录组中SSR位点分析

分析半枫荷转录组中的SSR位点信息,并设计简单重复序列(SSR)引物,以期为半枫荷EST-SSR分子标记提供有力工具。利用MISA工具筛选了半枫荷转录组测序获得的77629条Unigenes,对其SSR位点信息进行了分析;在此基础上利用Primer 3.0设计SSR引物,并随机选择50对SSR引物对4株不同来源的半枫荷进行多态性扩增分析。在半枫荷的转录组中,共找到15041个SSRs,分布于10669条Unigenes,SSR位点发生频率为13.74%,含多个位点的序列数为3114,占SSRs位点总数的29.19%,以复合形式出现的位点数2044个,占SSRs位点总数的19.16%,SSRs的平均距离是3.2 kb。SSRs位点中二碱基重复是主要类型,占总SSRs的42.17%;其次是单碱基重复基序(38.25%)SSRs。所包含的重复基元中,单碱基重复基元A/T(5572),二碱基重复基元AG/CT(4845)是优势重复基元类型,分别占总SSRs的37.05%、32.21%。利用Primer 3共设计出28590对SSR引物。随机选择50对引物进行PCR扩增,其中44对(88.0%)扩增出清晰、可重复的条带,15对(34.1%)扩增条带表现出多态性。半枫荷转录组SSR位点出现频率高,类型丰富;大量的SSR为其遗传多样性分析、分子标记辅助育种和遗传图谱构建提供了丰富的候选分子标记。     

Simple sequence repeats as useful resources to study transcribed genes of cotton

Microsatellites or Simple Sequence Repeats(SSRs) are informative molecular genetic markers in many crop species. SSRs are PCR-based, highly polymorphic, abundant, widely distributed throughout the genome and inherited in a co-dominant manner in most cases. Here we describe the presence of SSRs in cDNAs of cotton. Thirty one SSR primer pairs of 220 (∼14%) tested led to PCR amplification of discrete fragments using cotton leaf cDNA as template. Sequence analysis showed 25% of 24randomly selected cDNA clones amplified with different SSR primer pairs contained repeat motifs. We further showed that sequences from the SSR-containing cDNAs were conserved across G. barbadense and G. hirsutum, revealing the importance of the SSR markers for comparative mapping of transcribed genes. Data mining for plant SSR-ESTs from the publicly available databases identified SSRs motifs in many plant species,including cotton, in a range of 1.1 to4.8% of the submitted ESTs for a given species. This revised version was published online in August 2006 with corrections to the Cover Date.     

苦荞全基因组SSR位点特征分析与分子标记开发

目前苦荞SSR多态性标记数量较少,根据已发表的苦荞基因组测序数据,利用MISA软件对1~6核苷酸重复的SSR位点进行了查找和序列特征分析,批量设计引物并对引物进行了有效性和多态性检测。结果表明,苦荞基因组中共检测到1 640个SSR位点,其中三核苷酸重复型SSR最多,占比63.29%,五核苷酸重复型最少,仅占0.12%。AT/TA、AAG/CTT、ACC/GGT和ATC/GAT为出现频率较高的重复基序。苦荞基因组SSR序列长度变化范围为12~476bp,平均长度23.14bp,长度12~19bp的占比71.71%,长度≥20bp的占比28.29%。根据不同类型SSR位点设计并合成引物479对,选择200对引物对5份苦荞资源和3份甜荞资源进行多态性检测,有56对扩增出多态性条带,17对在苦荞种质中产生多态性条带,48对在甜荞种质中产生多态性条带,9对同时在两种种质中产生多态性条带。利用苦荞全基因组序列可实现SSR标记的批量开发,可鉴定出适用于苦荞和甜荞遗传多样性分析、遗传图谱构建和品种鉴定等研究的SSR引物。