日本血吸虫非叉型尾蚴感染动物试验

试验采集云南巍山地区自然条件下的钉螺,压碎钉螺、检获尾蚴,发现为非叉型尾蚴。将非叉型尾蚴400~850条/只经皮肤感染家兔,同时,用云南洱源的叉型尾蚴作对照试验。感染后50～55 d解剖兔子,试验组检获到日本血吸虫,荷虫量为10～15条/只。试验结果表明,云南巍山非叉型尾蚴能感染动物,该试验结果为丰富日本血吸虫的生活史提供了极有价值的补充。     

山东新城疫病毒分离株F基因的遗传进化分析

应用特异性引物从山东某发病鸡场病鸡体内分离到的命名为JN09的新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）中扩增其F基因,预计扩增片段大小为1 700 bp。RT-PCR扩增出的目的片段大小与预计扩增片段大小相符合,测序结果表明扩增片段与新城疫病毒F基因序列相符。对其F基因进行遗传进化分析,并结合山东地区近几年来的分离毒株的相关信息,着重分析该地区近年来新城疫病毒F基因的变异情况。     

胶东地区耐药猪源大肠杆菌I型整合子-基因盒流行状况分析

在胶东地区119株多重耐药大肠杆菌中,共92株菌有I型整合子整合酶基因,检出率达77．31％。92株I型整合子携带大肠杆菌共扩增出7类不同大小的基因盒插入区片段,大小分别为1008bp、1318bp、1586bp、1663bp、1913bp、1945bp、3149bp,其中以大小为1008bp的插入区片段的检出率最高,为31．67％。而检出率最低的为长度为1318bp的基因盒插入区。将基因盒插入区扩增片段的测序结果与Genebank中的相关序列进行比对,得出I型整合子携带的耐药基因盒种类分别为aadA1、aadA2、aadA5、aadA22、aadB、dfrA1、dfrA12、dfrA17、dfrA27、1nuF、cmLA6、aar-3、orff分别编码对相应药物的耐药性。     

山东新城疫病毒分离株F基因的遗传进化分析

应用特异性引物从山东某发病鸡场病鸡体内分离到的命名为JN09的新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)中扩增其F基因,预计扩增片段大小为1 700 bp. RT-PCR扩增出的目的片段大小与预计扩增片段大小相符合,测序结果表明扩增片段与新城疫病毒F基因序列相符.对其F基因进行遗传进化分析,并结合山东地区近几年来的分离毒株的相关信息,着重分析该地区近年来新城疫病毒 F基因的变异情况.     

胶东地区耐药猪源大肠杆菌Ⅰ型整合子-基因盒流行状况分析

在胶东地区119株多重耐药大肠杆菌中,共92株菌有I型整合子整合酶基因,检出率达77.31%。92株I型整合子携带大肠杆菌共扩增出7类不同大小的基因盒插入区片段,大小分别为1008bp、1318bp、1586bp、1663bp、1913bp、1945bp、3149bp,其中以大小为1008bp的插入区片段的检出率最高,为31.67%。而检出率最低的为长度为1318bp的基因盒插入区。将基因盒插入区扩增片段的测序结果与Genebank中的相关序列进行比对,得出Ⅰ型整合子携带的耐药基因盒种类分别为aadA1、aadA2、aadA5、aadA22、aadB、dfrA1、dfrA12、dfrA17、dfrA27、lnuF、cmLA6、aar-3、orfF分别编码对相应药物的耐药性。     

D型产气荚膜梭菌主要毒素基因的PCR检测

为了研究产气荚膜梭菌主要毒素基因,试验采用生物软件以NCBI上登录的产气荚膜梭菌α毒素、ε毒素作为参考,设计扩增D型产气荚膜梭菌α毒素与ε毒素的特异性引物,预期基因片段大小分别为1 110 bp、888 bp,进行PCR扩增。结果表明:设计的引物可以良好地扩增α毒素基因与ε毒素基因,基因片段大小与预期一致。     

A型产气荚膜梭菌四环素耐药基因的PCR检测

为了检测A型产气荚膜梭菌四环素耐药基因,试验采用Oligo 6.0软件设计tet A(P)、tet B(P)四环素耐药基因的特异性引物,片段大小分别为1 263 bp和1 959 bp,提取A型产气荚膜梭菌质粒DNA,配制PCR反应体系,设置PCR反应条件,用PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。结果表明:特异性引物能有效扩增A型产气荚膜梭菌tet A(P)和tet B(P)基因,目的基因大小与预期片段相符。     

昌宁县中华蜜蜂种群遗传结构调查——基于线粒体DNA COX1分子标记

为了探究云南省昌宁县中华蜜蜂的种群遗传结构,以线粒体DNA COX1基因片段为分子标记,利用生物信息学软件对该地区4个采样点共96群中华蜜蜂进行了遗传多样性分析,共获得了89条序列,所得线粒体DNA片段的序列长度为794bp。结果表明(1)序列碱基组成为:A+T74.3%,表现出显著的A+T偏倚性。(2)共发现23个变异位点其中转换变异位点21个,颠换变异位点2个。(3)共定义了16个线粒体单倍型,表现出昌宁地区丰富的遗传多样性和较高的单倍型多样度,显示出昌宁地区中华蜜蜂群体具有相对独立的遗传结构,同时与华南地区中华蜜蜂种群存在有限的基因交流。     

等位基因特异性PCR技术在绵羊基因SNP分型中的建立

为了在绵羊核基因和线粒体基因中建立简便、快速、准确的SNP分型技术,选择骨形态发生蛋白受体1B基因(BMPR1B)(核基因)A746G突变位点和线粒体基因16S rRNA基因(T1112C)、tRNA-His基因(C11606T)突变位点,对BMPR1B A746G采用三引物等位基因特异性PCR,结果每个样品使用2次扩增即可判定基因型,减少了限制性内切酶的使用。T1112C和C11606T采用四引物等位基因特异性PCR进行分型,T1112C位点检测中,所有样品均能扩增出569 bp最长片段的外引物产物,扩增出349 bp片段的样品为TT野生型,扩增出263 bp片段的样品为CC突变型,没有异质性。C11606T位点检测中,所有样品均能扩增出572 bp最长片段的外引物产物,扩增出408 bp的片段为CC野生型,扩增出213 bp的片段为TT野生型,没有异质性。结果表明四引物等位基因特异性PCR技术可以用于线粒体基因组SNP分型。     

尿冰在梅花鹿种群研究中的价值

冬季的野外调查可以收集到动物排在雪地或地面上的尿冰。为评价尿冰在种群生态学研究中的价值,本研究从野外收集15份梅花鹿(Cervus Nippon)尿冰、从动物园收集2份已知性别的梅花鹿尿冰,以实验室保存的2份已知性别的梅花鹿肌肉样品为对照,采用凝胶回收试剂盒提取DNA,通过cyt b和12S rRNA两个线粒体基因片段和AMEL、SRY两个核基因片段的PCR扩增,评价了尿冰DNA的可用性。结果表明:从1 mL融化的尿冰中可提取出650 ng的DNA。线粒体DNA分别成功扩增了0.472~1.2 kb的片段,核基因成功扩增了225~425 bp的片段。利用AMEL、SRY、ZFX 3个基因片段进行性别鉴定时,已知性别样品的鉴定结果均完全正确。野外尿冰样品在AMEL基因片段(大小为282 bp/225 bp)的扩增成功率为88.2%,在MT1/DSRY1—H和ZFX1-L/ZFX1-H进行复合扩增时的成功率为94.1%。上述结果说明,尿冰DNA完全可以满足基于mtDNA和核DNA的遗传学分析,是有价值的DNA来源。     

西农萨能奶山羊INHA基因启动子区多态性与产羔数和产奶量的相关分析

采用PCR-SSCP技术分析了INHA基因的启动子区2个基因座位在西农萨能奶山羊群体中的遗传多态性,结果在P1引物所扩增的目的片段发现遗传多态,有2种等位基因A和B,有3种基因型AA型、AB型、BB型;在P2引物所扩增的目的片段未发现遗传多态.对多态片段的测序分析表明:AA型与BB型相比在DNA序列的第506 bp处插入了一个碱基G,在第446 bp处碱基C→T.AB、BB基因型个体的平均产羔数显著高于AA型个体(P<0.05);AB、BB基因型的个体各胎次产奶量均比AA型高,其中在第2、3胎产奶量和前4胎平均产奶量都达到显著水平(P<0.05),AB基因型的前4胎平均产奶量和AA型差异极显著(P<0.01).结果表明INHA基因对奶山羊产羔数和产奶量都有显著影响,因此认为INHA基因的P1位点可作为奶山羊的有效分子标记.     

线粒体DNA缺失质粒pMDD-Z的构建及鉴定

分别以pEGFP-Mito和pAN4质粒为模板,扩增出MTS-EGFP和EcoRⅠ基因片段,利用快速体外基因重组技术-重组PCR,将两者连接得到MTS-EGFP-EcoRⅠ片段,构建克隆载体pTRE2hyg-EE,经AgeⅠ和NotⅠ双酶切得到MTS-EGFP-EcoRⅠ融合基因产物,连接克隆于真核表达质粒pEGFP-Mito后获得pMDD-Z质粒。琼脂糖凝胶电泳结果显示,MTSEGFP和EcoRⅠ基因片段大小分别是831 bp和860 bp。测序结果显示,插入pTRE2hyg--EE克隆载体中的MTS-EGFPEcoRⅠ片段大小1 672 bp,且基因序列正确,没发生点突变。琼脂糖凝胶电泳结果显示,pMDD-Z质粒的双酶切产物分别为1 587 bp的插入片段和4 024 bp的载体片段。测序结果显示,pMDD-Z质粒中含1 659 bp的开放阅读框,编码553个氨基酸,从N端至C端,分别为线粒体信号导肽、绿色荧光蛋白和限制性内切酶EcoRⅠ,且未发生移码突变。     

不同地域来源鸡新勋恙螨基于线粒体pnad5的遗传多样性分析

为了解鸡新勋恙螨的种群结构,本研究从广东云浮、佛山、鹤山及广西梧州4个地区采集了46份鸡新勋恙螨样品,PCR扩增其线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶第5亚基基因部分序列(pnad5),分析其核苷酸序列的种内差异,并与已报道的恙螨科其他属恙螨的相应序列进行同源性比较和遗传演化分析。结果显示,获得的46条鸡新勋恙螨pnad5基因片段大小均为310 bp,共有9个变异位点,未见碱基插入和缺失;比对分析发现46条pnad5基因序列形成4个单倍型(Hap-1~Hap-4),单倍型指数为0.724,表现出较高的遗传多样性(π=0.01284)和单倍型多样性(Hd=0.724),且以种群间的遗传变异为主(76.36%)。系统发育树显示,本实验中扩增的不同地理种群的鸡新勋恙螨单独聚为一支,同恙螨科内其他属间的nad5基因序列同源性较低。序列分析表明,鸡新勋恙螨种群虽有一定程度的遗传分化,但未形成明显的地理遗传结构,且线粒体pnad5基因适合作为分子标记对鸡新勋恙螨进行遗传变异研究。本研究在国内外首次扩增并分析了鸡新勋恙螨pnad5基因序列,为鸡新勋恙螨的分子鉴定和种群遗传研究提供基础资料。     

基于ITS基因分析蛇源曼氏迭宫绦虫种系发育关系

为了开展曼氏迭宫绦虫(Spirometra mansoni)种系发育分析,本试验基于18S rRNA和5.8S rRNA基因保守区设计引物用于扩增包含18S rRNA、5.8S rRNA及核糖体内部转录间隔1区(ITS-1)的靶片段,对蛇体内分离的绦虫进行基因组DNA提取,然后采用PCR方法扩增目的基因,将所得序列进行测序比对并构建进化树分析。PCR结果显示,扩增片段大小为737 bp,序列经分析发现包括18S rRNA 17 bp,5.8S rRNA 421 bp,ITS-1片段为304 bp。同源性分析显示,其与猬迭宫绦虫同源性最高,高达86%;遗传进化树表明,其与猬迭宫绦虫广州株(FJ886754.1)最为接近,与微小膜壳绦虫(AF461124.1)关系最远。综上所述,本次分离的绦虫为曼氏迭宫绦虫,ITS-1基因可作为良好的分类工具区别不同种的迭宫绦虫。     

斑点叉尾鮰病毒焦磷酸测序检测方法的建立

旨在建立一种基于PCR的焦磷酸测序检测方法,用于斑点叉尾鮰病毒病的快速检测和确诊。针对斑点叉尾鮰病毒(CCV)蛋白激酶(PK)基因的保守区域设计扩增引物与测序引物,经PCR扩增后对PCR产物进行焦磷酸测序,借助测序结果比对确定是否为CCV核酸序列。通过对反应条件与体系的优化,成功建立了CCV PK基因焦磷酸测序检测方法。结果表明:建立的斑点叉尾鮰病毒焦磷酸测序检测方法扩增基因片段长度为144 bp,能够特异性检测出目的病毒,最低核酸检测限为5×10-6ng/μL,重复测序3次均能准确测出45 bp核酸序列。本研究建立的斑点叉尾鮰病毒焦磷酸测序检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,适合高通量检测且耗时短仅需4 h,为CCV的快速检测提供了一种可行方法。     

双羔型辽宁绒山羊FSHR基因SNP分析的研究

分别选择遗传性能稳定的同一年龄的产双羔、单羔辽宁绒山羊母羊,对FSHR基因第10个外显子的1 487 bp至1 717 bp共230个碱基区段进行SNP分析,并以相同年龄的产双羔和单羔的萨能奶山羊为对照.从试验羊血液中提取基因组DNA,利用PCR法扩增FSHR第10个外显子的目的片段,利用PCR-SSCP法对PCR扩增的目的片段进行单核苷酸多态性分析.结果表明辽宁绒山羊FSHR基因第10个外显子突变率较大,并且其突变发生在第1 506个碱基,由C→T.说明FSHR基因的第10个外显子可以作为双羔性状的标记基因.     

云南省临沧市猪戊型肝炎病毒流行株遗传进化分析

猪是人兽共患病病原戊型肝炎病毒（HEV）Ⅲ、IV基因型的重要贮存宿主。为了解云南省临沧市猪HEV的遗传进化情况，从规模猪场、猪散养户以及猪屠宰场，随机采集粪便153份、肝脏36份和胆汁54份，采用巢氏PCR进行HEV ORF2基因片段扩增、克隆、测序和生物信息学分析。结果显示：在243份样品中，检出137 bp目标片段阳性61份，阳性率为25.1%(61/243)；对检出的阳性样品进行ORF2部分序列扩增，得到6份348 bp目标片段。6份348 bp目标片段间的核苷酸同源性为86.0%～95.6%，均为基因IV型；与HEVI—VⅢ型代表株的同源性分别为75.0%～81.7%、72.7%～77.0%、72.7%～79.3%、80.5%～94.1%、75.7%～80.7%、75.0%～81.0%、73.3%～80.3%和71.3%～76.1%，与我国人源代表毒株AJ272108BeijingHuman的同源性为81.3%～87.7%；基因亚型分析显示，6份348 bp目标片段中，除1份是4b亚型外，其他5份都属于4a亚型。结果表明，临沧市猪群中存在人兽共患病病原HEV基因Ⅳ型流行，且有通...     

线粒体cox1序列分析支持北半球欧氏对盲囊线虫是一个新种

欧氏对盲囊线虫(Contracaecum ogmorhini)是一种重要的人畜共患寄生虫病-异尖线虫病的病原之一.来自南北半球三个不同种群的C.ogmorhini有着明显的地理分布差异和宿主特异性.应用PCR-SSCP技术分析了三个不同地理株的C.ogmorhini在线粒体DNA(mtDNA)细胞色素c氧化酶第Ⅰ亚基(cox1)部分序列的差异及种群遗传关系.用同位素(γ33P)对保守引物进行标记,通过PCR从单个欧氏对盲囊线虫DNA中扩增出一条长为441 bp的cox1基因片段,取阳性PCR扩增产物,对三个不同地理株的C.ogmorhini进行SSCP分析,结果显示:三个不同地理株的C.ogmorhini 441 bp的cox1基因片段存在着一定的多态性,其中南半球的不同地理株其SSCP带型差异很小,而北半球和南半球的带型差异则略微明显.将SSCP分析筛选出的代表性样品进行克隆、测序,序列分析表明:南半球的样品序列同源性很高,而北半球种群与南半球种群的序列同源性则相对较低,它们之间存在着3个可作为其遗传标记的基因位点,从而说明北半球的C.ogmorhini相对于南半球的C.ogmorhini来说确实存在着遗传差异,很可能代表着一个新种.     

甘肃高山细毛羊超细毛型品系微卫星BMS1714和INRA61的遗传多样性分析

为了解甘肃高山细毛羊的遗传多样性,为地方绵羊品种的选种、选育及保种工作奠定基础,选取位于绵羊第25号染色体上的微卫星标记BMS1714和INRA61,对其进行遗传多样性研究。结果表明:BMS1714基因座有10个等位基因,PCR扩增片段大小在121～138 bp之间;优势等位基因为138,优势基因型为138/138;多态信息含量(PIC)、有效等位基因数(Ne)、平均杂合度(He)分别为0.714、4.029和0.731。INRA61基因座有11个等位基因,PCR扩增片段大小在279～292 bp之间;优势等位基因为286,优势基因型为286/286;PIC、Ne、He分别为0.776、5.127和0.809。因此,甘肃高山细毛羊超细毛品系微卫星位点BMS1714和INR A61均呈现高度多态,这两个位点可用于甘肃高山细毛羊的遗传多样性分析。     

四川部分地区新生仔猪病毒性腹泻的病原学诊断

根据参考文献合成5对针对猪传染性腹泻病毒(PEDV)M基因、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因、猪轮状病毒(PRV)VP4基因、博卡病毒(PBoV)VP1/VP2基因、猪库布病毒(PKoV)3D基因,可分别特异扩增出大小为467 bp、1 062 bp、750bp、496bp和323 bp的DNA片段的特异性引物,对四川部分地区2011年10月至2012年5月新生仔猪腹泻病例样本进行RT-PCR、PCR检测和透射电镜观察。检测结果显示,SC1、SC2猪场的病例样本均扩增出PKoV 3D基因特异性DNA片段,均未扩增出TGEV、PRV、PBoV的特异性DNA片段,仅SC1猪场有1份样本扩增出PEDV M基因的特异性DNA片段。测序结果表明,扩增出的PKoV 3D基因特异性DNA片段大小为323 bp,与GenBank登录序列同源性均在95%以上;扩增出的PEDV M基因特异性DNA片段大小为467 bp,与GenBank登录序列同源性均在98%以上。透射电镜观察结果显示,两个猪场样本均可见有直径大小为25、30 nm的球形病毒颗粒。结果显示,此次四川部分地区猪场发生的病毒性腹泻病例均存在PKoV感染,说明PKoV与此次疫情有紧密联系。