热应激对小鼠胚胎细胞HSP70表达和超微结构的影响

本研究旨在确定体外培养的小鼠胚胎细胞合成HSP70的时期,研究热应激对该阶段胚胎细胞超微结构的影响.将合子和体外发育至2-细胞、4-细胞、8～16-细胞及囊胚阶段的胚胎分别进行37、39和41℃的热应激处理,用免疫荧光细胞化学法检测胚胎细胞中HSP70的诱导表达;将体外培养至早期囊胚的小鼠胚胎分别施以39℃2h和41℃2h处理,分别在热应激后0和2h时收集胚胎,制作超薄切片,用电子显微镜观察胚胎细胞的超微结构变化.在各细胞期胚胎中,37℃组胚胎HSP70表达阴性(一);39℃组胚胎,从8～16-细胞开始呈现弱表达(+),囊胚呈阳性表达(++);41℃组的胚胎从4-细胞开始呈现弱阳性表达(+),8～16-细胞胚胎和囊胚呈阳性表达(++).39和41℃热应激处理的小鼠早期囊胚超微结构和对照组均发生明显的变化,但经37℃恢复培养2h后,39℃组胚胎的各细胞器超微结构恢复正常,而41℃组胚胎未能恢复.结果表明,小鼠胚胎从4-细胞期有HSP70的诱导合成,在囊胚期诱导合成最多;热应激使胚胎亚细胞结构出现退行性变化,轻度退行性变化是可逆的.     

预热诱导HSP70表达对高温引致胚胎损伤的保护作用

用37℃2 h条件下体外培养的小鼠囊胚作为对照,将体外培养至囊胚期的小鼠胚胎分别施以38℃2 h、39℃2 h、40℃2 h的预热应激处理,以观察热休克蛋白70(HSP70)表达对高温所致胚胎损伤的影响。用W estern-b lot技术检测小鼠胚胎内HSP70的表达,然后分别将预热胚胎和对照组胚胎置于42℃高温下处理3 h,用台盼兰拒染法检测胚胎存活率,判断HSP70表达对胚胎抵抗高温损伤有无保护作用。结果显示:39℃热应激处理2 h后,HSP70表达量达到最高水平,与对照组差异极显著(P<0.01);38℃热应激处理2 h和40℃热应激处理2 h组HSP70表达与对照组相比均有显著(P<0.05)增加;预热诱导组胚胎存活率明显(P<0.05)高于对照组,其中以39℃2 h组最高。提示HSP70的高表达可以抵抗胚胎对外界不良因素的刺激。     

HSP72在热应激小鼠囊胚中的表达及其作用

将体外培养的小鼠囊胚分别施以38℃温和热应激和40℃强烈热应激处理1、2和3 h,然后在37℃正常培养条件下分别恢复3、2和1 h,用体视显微镜观察囊胚孵出率以及经38℃和40℃诱导热应激后囊胚的孵出率,用Western-blot技术检测小鼠囊胚HSP72的表达。结果,38℃热应激处理2 h时,HSP72表达量达到最高水平,与对照组差异显著;40℃热应激处理3 h时,HSP72表达量达到最高水平,与对照组差异不显著;38℃热诱导2 h囊胚孵出率最高,与40℃强烈热应激处理2 h组差异显著。结果表明,热诱导组囊胚孵出率与38℃热应激组囊胚HSP72的表达量呈正相关。     

热应激处理鼠囊胚Hsp70基因表达的RT-PCR检测

将体外培养的小鼠囊胚分别施以40℃1、2、3 h和38℃1、2、3 h热应激处理,然后在37℃条件下分别恢复3、2、1 h后,提取胚胎细胞总RNA,用RT-PCR方法检测小鼠囊胚Hsp70基因的表达,以明确小鼠囊胚经热应激处理后是否有诱导型Hsp70基因表达。结果表明:各试验组,包括对照组鼠的囊胚都有诱导型Hsp70基因的表达。说明小鼠囊胚对热应激处理敏感,轻微热应激就可使诱导型Hsp70基因表达。     

黄芩苷对热应激条件下LLC-PK1细胞HSP70表达的影响

为了探讨不同浓度黄芩苷对热应激条件下猪肾小管上皮(LLC-PK1)细胞HSP70表达的影响,筛选出黄芩苷诱导热应激条件下细胞HSP70表达的最佳浓度。将培养的LLC-PK1细胞随机分为7个组,Ⅰ组为37℃常温对照组,Ⅱ组为42℃单纯热应激组,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组和Ⅶ组分别为42℃热应激并用不同浓度黄芩苷(0.01~100μg/m L)处理组,运用实时荧光定量PCR和Western Blot检测HSP70 m RNA及蛋白的表达。结果显示,42℃单纯热应激能显著诱导LLCPK1细胞HSP70的表达;一定浓度范围内的黄芩苷(0.1~10μg/m L)处理的LLC-PK1细胞HSP70表达显著高于42℃单纯热应激;黄芩苷(0.01~100μg/m L)能显著上调热应激条件下LLC-PK1细胞HSP70的表达,且1μg/m L的黄芩苷上调效果最显著。     

冷、热应激对猪孤雌胚胎体外发育的影响

为研究持续不同时间的冷、热应激对猪孤雌胚胎体外发育的影响,本研究以猪孤雌胚胎为材料,采用免疫荧光染色、实时荧光定量PCR技术检测不同时间的冷(31℃)、热应激(41℃)处理对猪孤雌胚胎发育后囊胚发育率、细胞数、细胞凋亡率、自噬相关基因及细胞凋亡相关基因mRNA转录水平的影响。结果显示,热应激12h后囊胚发育率显著低于对照组(P0.05),冷应激18h后囊胚发育率显著低于对照组(P0.05),而冷应激组囊胚发育率高于热应激组。热应激12h和冷应激18h后均导致囊胚内细胞数显著低于对照组(P0.05),细胞凋亡率显著高于对照组(P0.05),且冷应激组的细胞凋亡率低于热应激组。冷、热应激组自噬相关蛋白LC3的表达均高于对照组;冷、热应激中自噬相关基因Atg6和Atg8的表达均极显著高于对照组(P0.01),Lamp2基因的表达均显著高于对照组(P0.05),热应激组中的Atg6和Atg8基因的表达高于冷应激组。通过检测细胞凋亡相关基因mRNA的转录水平发现,冷、热应激组中细胞凋亡相关基因Bak、Casp-3、Fas的表达均极显著高于对照组(P0.01),Bcl-xl基因的表达均显著低于对照组(P0.05)。综上,猪孤雌胚胎对冷应激(31℃)的耐受性比对热应激(41℃)强,且热应激可诱导体外培养的猪孤雌胚胎自噬及凋亡相关基因的表达,从而降低孤雌胚胎发育的能力。     

热应激对小鼠囊胚中HSP72表达及对孵出率影响的研究

将体外培养的小鼠囊胚分别施以40℃和38℃热休克处理1h、2h和3h,然后在37℃条件下分别恢复3h、2h和1h后,利用Westernblot技术检测小鼠囊胚HSP72的表达,同时观察囊胚的热敏性,以明确热应激对小鼠囊胚中HSP72表达及对孵出率影响。结果显示,38℃及40℃热应激组均有HSP72的表达,38℃组2h达到最高水平,与对照组相比差异显著(P<0.05),然后表达量随热应激时间延长而降低;40℃组3h达到最高水平,与对照组相比差异不显著(P>0.05)。38℃及40℃热应激组囊胚孵出率均随着热应激时间的延长而降低。结果表明,轻度、短时间热应激既可使小鼠囊胚HSP72表达;热应激能够降低小鼠囊胚的孵出率。     

热应激对小鼠囊胚HSP72表达的影响

将体外培养的小鼠囊胚分别施以40℃和38℃热休克处理1 h,2 h和3 h,然后在37℃条件下分别恢复3 h,2 h和1 h后,利用Western blot技术检测小鼠囊胚HSP72的表达,以明确热应激对小鼠囊胚HSP72表达的影响.结果显示,38℃和4O℃热应激组均有HSP72的表达,38℃组2 h达到最高水平,与对照组相比差异显著(P<0.05),然后表达量随热应激时间延长而降低;40℃组3 h达到最高水平,与对照组相比差异不显著(P>0.05).结果表明,轻度、短时间热应激既可使小鼠囊胚HSP72表达.     

热应激 脂多糖 谷氨酰胺 诱导牛睾丸支持细胞HSP72时效表达

为了探讨温和热应激、脂多糖(LPS)和谷氨酰胺(Gln)诱导牛睾丸支持细胞(b SCs)HSP72的时效表达规律,本试验将传至第3代b SCs分成热应激、LPS和Gln处理组,用CCK-8试剂盒检测细胞活性,用RT-PCR和Western-Blot方法分别检测处理后0、2、4、6、8、12、14h和16 h时细胞内HSP72 mRNA和蛋白表达。结果显示,3种方式均能诱导HSP72表达,且HSP72蛋白分别在热应激、Gln和LPS预处理后2、4h和12 h时表达量最高。结果表明,热应激或Gln均比LPS诱导牛睾丸支持细胞HSP72表达的时间早,提示可考虑用Gln减少由LPS诱导的细胞损伤。     

小鼠卵巢HSP70诱导表达的免疫荧光组织化学研究

试验采用免疫荧光组织化学法,检验了经历不同温度热应激后,在不同恢复期内小鼠卵巢组织HSP70的诱导表达,确立了HSP70诱导表达模式。结果表明：随着热应激温度的升高,卵巢组织HSP70的表达量增加,表达持续期延长,特别是经历了预应激小鼠的HSP70表达更显著。这说明在一定的热应激条件下。小鼠卵巢组织可发生HSP70的诱导表达,其表达量和表达持续期与热应激强度相关,而且热应激可显著促进HSP70的表达。     

短时高温处理对意大利蝗卵子发生期HSP70蛋白表达的影响

本研究采用免疫组织化学分析方法,测定了HSP70蛋白在意大利蝗卵子发生期的表达定位及33~42℃高温处理对其相对表达量的影响。结果表明,1)在卵黄发生前期,卵母细胞和滤泡细胞均表达HSP70蛋白,而在卵黄发生期和卵黄发生后期,HSP70蛋白阳性表达位于滤泡细胞;2)在33~42℃温度范围内,随着温度升高,意大利蝗卵子发生期HSP70蛋白相对表达量呈现先上升后下降的变化趋势;其中36℃处理组HSP70蛋白相对表达量最高,显著高于27℃对照组(P0.05);42℃处理组HSP70蛋白相对表达量最低,但与27℃对照组差异不显著(P0.05)。短时高温处理对意大利蝗卵子发生期HSP70蛋白相对表达量有显著影响,推测HSP70蛋白的表达在意大利蝗抵抗短时高温胁迫过程中具有重要作用。     

夏季奶牛血液中热休克蛋白的表达量

选择40头体质健康的中国荷斯坦奶牛,根据胎次和泌乳天数,按照随机区组试验设计分为Ⅰ组（30kg/d）、Ⅱ组（30～35kg/d）、Ⅲ组（35～40kg/d）和Ⅳ组（40kg/d）。热应激前、热应激前期、热应激中期、热应激后期和热应激后分别于尾静脉采血,用ELISA试剂盒测定热休克蛋白（HSP）27,70,90的表达量。结果显示,Ⅳ组HSP27表达量最高,Ⅱ组表达量最低,Ⅳ组、Ⅲ组和Ⅰ组均显著高于Ⅱ组（P〈0.05）。HSP70表达量各组间没有明显差异,但随产奶量呈线性增加（P〈0.05）。HSP90的表达量,Ⅳ组和Ⅲ组明显高于Ⅱ组（P〈0.05）。HSP27的表达量热应激后差异较大;HSP70的表达量各组整个过程差异较大;HSP90的表达量在热应激前、热应激前期和热应激后差异较大。总之,在热应激过程,高产奶牛血清中热应激蛋白的表达量较高,HSP70表达量随产奶量呈线性增加,而不同热应激蛋白的变化规律差异较大。     

热应激时鸡糖皮质激素受体和热休克蛋白的变化

本研究应用3H-Dex放射配体结合的Scatchard分析和35S-蛋氨酸体外标记法分别测定了环境温度40℃热应激时,鸡外周血淋巴细胞(PBL)的糖皮质激素受体(GR)的最大结合容量(Ro)、平衡解离常数(Kd)及其热休克蛋白的表达。结果显示在热应激处理后0．5～4h鸡PBL、GR、Ro从85．75±10．09fmol／107细胞迅速下降至15．34±2．89fmol／107细胞。仅为正常对照组Ro的17．90％(P＜0．01)。与此同时细胞热休克蛋白(HSP)的合成持续增加,主要有HSP100,HSP90,HSP70和HSP25。而在热应激最初0．5h细胞总的蛋白合成急剧下降,随着应激时间的延长,HSP合成的增多,细胞总的蛋白也逐渐恢复。提示HSP在热应激过程中对细胞结构和机能的重建、维持激素与GR的亲合力,稳定受体蛋白结构,提高机体热耐受力具有重要意义。     

东北野猪成纤维细胞HSP70基因表达对寒冷应激的响应

以东北野猪成纤维细胞为研究对象,利用实时荧光定量PCR技术,分析4、15、25和32℃不同温度冷应激条件下细胞内HSPT0mRNA表达变化规律。结果显示在冷应激的低温处理过程中,HSP70mRNA转录量在各温度均为见显著增加;在冷应激的复温培养过程中,HSP70mRNA转录量在4℃和15℃处理后4h后,复温培养的4～8h显著增加（P〈O．05）;在25℃和32℃处理后4h后,复温培养未能诱导细胞内HSP70mRNA转录量显著增加（P〉0．05）;细胞在4℃和15℃处理2、4、6和8h后,复温培养4h,HSP70mRNA转录量随处理温度的减低和时间的延长而增加,处理4～8h组显著高于对照组（P〈0．05）,在25℃和32℃处理2、4、6和8h后,复温培养未能显著诱导HSP70mRNA的转录（P〉0．05）。结果表明,冷应激诱导东北野猪成纤维细胞内HSP70mRNA转录量的增加,不是发生在低温处理的应激阶段,而是发生在复温后的细胞应激阶段,温和冷应激（25～32℃）未能诱导复温后HSP70mRNA转录量的显著增加,强度冷应激（4～15℃）诱导复温后HSP70mRNA转录量的显著增加,且与冷应激的强度和时间成正比。     

Influence of induced heat stress on HSP70 in buffalo lymphocytes

Heat stress in farm animals, such as cattle and buffalo during summer and post-summer seasons is a problem for livestock producers. The effect of heat stress becomes pronounced when heat stress is accompanied with ambient humidity impairing the immune status, growth, production and reproductive performance of animals. Increase in HSP70 levels from cell cultures in presence of different stressors often does not reflect the physiological adaptability of animals governing thermal regulation. In this study we directly compared the effect of different heat stress conditions with the immune status and HSP70 expression patterns from buffalo lymphocytes both in vivo and in vitro. Murrah buffalo calves were exposed to induced heat stress with two experimental treatments: hot-dry (42 °C with existing relative humidity) or hot humid (35 °C with 70% relative humidity) condition in psychometric chamber, 4 h daily for 12 days and compared with control animals maintained in an experimental shed under natural conditions. There was >200-fold increase in serum-HSP70 levels in both heat stress conditions compared with control. Furthermore, the immune status of the calves failed to activate the level of HSP70 expression in serum lymphocytes. Lymphocytes cultured in vitro at higher temperature exert 2.5-fold increase in HSP70 concentration. This study is the first of its kind to demonstrate more complex expression pattern of buffalo serum-HSP70 level as a thermo adaptive response compared with in vitro treated cells. Results from this study indicate that serum-HSP70 levels could be used as a sensitive biomarker for heat stress management in large farm animals.     

Purification, characterization and expression kinetics of heat shock protein 70 from Bubalus bubalis

The present work on Bubalus bubalis (buffalo) was designed to study heat shock protein 70 (HSP70) induction in lymphocytes, its purification and characterization. HSP70 induction and expression kinetics at different temperatures and time durations were also studied. HSP70 purification was carried out by immunoaffinity chromatography using adenosine di-phosphate (ADP-agarose column) and the characterization of the purified protein was done using western blotting by mouse monoclonal anti-HSP70. The molecular weight of HSP70 of buffalo lymphocytes was found to be approximately of 68 kDa and was less than that of bovine brain HSP70. The purified HSP70 was assessed using indirect inhibition enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). A good amount of HSP70 (1430 ηg HSP70/100 μl) was recovered after purification, out of the total 2040.40 ηg of HSP70/100 μl of cell supernatant. To assess the impact of temperature and time dependent variability in the induction and expression pattern of HSP70, buffalo lymphocytes were subjected to three different temperature treatments, viz.: (I) 38 °C for 48 h and further exposed the same cells at 45 °C for 3 h, (II) 42 °C for 3 h, and (III) 45 °C for 3 h, respectively. The respective cell viability was found to be 68%, 63%, and 51%. The HSP70 levels were 58.30 ± 4.37, 42.59 ± 9.04 and 21.95 ± 6.79 ng/million cells, respectively, at three temperature exposures. The results indicates that higher intensity and duration of temperature exposure cause higher HSP70 induction in buffalo lymphocytes to maintain cellular homeostasis with a threshold of thermal dose for maximum HSP70 expression. However immediate induction of HSP70 in the lymphocytes was dependent on magnitude of thermal exposure (stress level) and time of thermal exposure (stress duration). The present study on HSP70 and its induction will help likely to solve the problems related to the present scenario of thermo-adaptability in buffaloes.     

热休克蛋白70上调表达对热应激猪小肠上皮细胞凋亡的影响

本试验以谷氨酰胺作为热休克蛋白70(HSP70)诱导剂,从细胞凋亡线粒体信号转导途径探讨HSP70对热应激猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)凋亡相关因子的影响。试验以体外培养的猪小肠上皮细胞为模型,分别加入不同浓度(1、2、4、6、8、10 mmol/L)谷氨酰胺的培养基中培养24 h,提取总RNA和总蛋白,用实时荧光定量PCR和Western blot检测HSP70 mRNA和蛋白的相对表达量,筛选出谷氨酰胺诱导HSP70表达的最佳浓度。取对数生长期的细胞分为3组,分别为对照组(Con组,37℃培养12 h)、热应激组(Hs组,42℃培养12 h)、谷氨酰胺组(Gln组,6 mmol/L谷氨酰胺、42℃培养12 h)。采用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡水平,实时荧光定量PCR和Western blot分别检测HSP70、凋亡酶激活因子-1(Apaf-1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-9(Caspase-9)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的mRNA和蛋白的相对表达量。结果表明:谷氨酰胺对HSP70上调表达呈先上升后下降的趋势,6 mmol/L的谷氨酰胺诱导时HSP70 mRNA和蛋白相对表达量最高,显著高于其他浓度(P<0.05),作为后续试验中Gln组的诱导条件。与Con组相比,Hs组细胞凋亡率极显著增加(P<0.01),HSP70、Apaf-1、Caspase-3、Caspase-9 mRNA和蛋白的相对表达量极显著升高(P<0.01),而Bcl-2 mRNA和蛋白的相对表达量极显著降低(P<0.01)。与Hs组相比,Gln组细胞凋亡率极显著降低(P<0.01),但仍极显著高于Con组(P<0.01);Gln组HSP70 mRNA和蛋白的相对表达量极显著升高(P<0.01);Gln组Apaf-1、Caspase-3、Caspase-9 mRNA和蛋白的相对表达量极显著降低(P<0.01),但极显著高于Con组(P<0.01);Gln组Bcl-2 mRNA和蛋白的相对表达量极显著升高(P<0.01),但极显著低于Con组(P<0.01)。由此可见,上调HSP70的表达可有效缓解热应激导致的猪小肠上皮细胞凋亡。     

热应激绍兴鸭不同组织HSP70基因mRNA表达研究

研究蛋鸭热应激条件下不同组织中热休克蛋白70(HSP70)基因mRNA表达规律,为揭示蛋鸭热应激反应机理提供参考。60只绍兴蛋鸭25℃饲养20d,其中30只进行40℃热应激处理1h,采取荧光定量PCR方法分别测定不同组织中HSP70mRNA的表达水平。试验组与对照组相比,肝脏、脾脏和胰腺组织HSP70mRNA表达差异不显著,其他6种组织HSP70基因表达量均有不同程度的增加,试验组心脏、腿肌、垂体、下丘脑、胸肌、肾脏中HSP70基因表达量分别高于对照组3.6倍、2.8倍、2.7倍、2.4倍、2.2倍和1.57倍。     

自噬调节因子Atg5和Beclin1在不同来源小鼠胚胎早期发育过程中的表达分析

旨在探究自噬调节因子Atg5和Beclin1在胚胎早期发育过程中的表达模式及胚胎的不同生产方式对两种因子表达的影响。本研究将6~8周龄雌性小鼠进行超数排卵,分为2组,一组收集小鼠卵母细胞,孤雌激活处理后进行体外培养;另一组超排小鼠与公鼠1：1合笼,第2天收集小鼠受精卵进行体外培养;分别在2细胞期、4~8细胞期、桑葚胚期和囊胚期收集不同阶段小鼠孤雌激活胚胎和自然受精胚胎。提取RNA和蛋白,通过实时荧光定量PCR、Western blot等方法检测自噬关键因子Atg5和Beclin1的表达,通过间接免疫荧光法检测Atg5和Beclin1在小鼠囊胚中的表达定位。结果显示,小鼠自然受精和孤雌激活胚胎在发育各时期均可表达Atg5和Beclin1,表达量在胚胎发育的早期呈现出较高的水平,其中二者的表达在小鼠自然受精胚胎中从2细胞期起逐渐降低,而在孤雌激活胚胎的4~8细胞阶段表达量最高,与同期自然受精胚胎差异极显著（P<0.01）;从4细胞期开始,各时期孤雌激活胚胎中Atg5和Beclin1蛋白表达水平均高于自然受精胚胎,差异极显著（P<0.01）;在囊胚中,滋养层细胞和内细胞团中均可检测到Atg5和Beclin1蛋白的荧光,但内细胞团中的荧光强度高于滋养层细胞,且Beclin1蛋白在孤雌激活胚胎囊胚内细胞团中荧光强度高于自然受精胚胎。自噬关键因子Atg5和Beclin1在不同来源小鼠胚胎早期发育各时期均有不同程度的表达,提示自噬对早期胚胎发育的调控作用与胚胎的生产方式存在一定关联,研究结果为进一步探索细胞自噬参与哺乳动物胚胎发育的生理调控提供理论依据。