转基因抗虫棉中cry1Aa基因表达盒的序列测定和检测

从转基因抗虫棉南农6号F1中克隆了一种新的Bt基因表达盒-cry1Aa基因表达盒,与已经测定的我国转基因棉花中的cry1Ac基因和cry1Ab/Ac基因的表达盒序列比较发现,它们在Bt基因与7S UTR的连接区域存在较大差异.根据这个差异区域的序列,设计特异性引物对cry1Aa-F/cry1Aa-R,建立了cry1Aa...     

苏云金杆菌cry7Ab8基因的克隆表达及其杀虫活性

克隆对鞘翅目害虫有毒力的Bt新菌株GWS7的cry7Ab8基因,并对该基因进行表达和杀虫活性的研究.利用全长PCR方法克隆cry7Ab8基因,将cry7Ab8基因插入到表达载体pET28b,获得重组质粒pETcry7Ab8,转化E.coli BL21(DE3),诱导后表达130 kDa的蛋白.将cry7Ab8基因连接到...     

一株苏云金芽孢杆菌的分离与杀虫基因的鉴定

采用温度筛选从云南省刁苓山土壤中分离得到一株伴孢晶体为长菱形的苏云金芽孢杆菌BSH-1。利用PCR-RFLP鉴定体系和SDS-PAGE对菌株所含cry基因类型和晶体蛋白的构成进行鉴定、分析,结果表明:菌株BSH-1具有的cry基因组合为:cry1Aa,cry1Ac,cry1Db,cry2Ab,cry1Ia,表达的晶体蛋白有130,70和56 kDa 3种,该蛋白对甜菜夜蛾具有较高杀虫活性,LC50为1.43 ng/mg。该菌株的基因组合类型对构建杀虫基因工程菌具有重要参考价值。     

苏云金杆菌vip1A/vip2A基因的鉴定及其与cry1基因的联系

利用PCR方法检测vip1A/vip2A基因在野生型Bt菌株中的分布,进行基因片段的克隆和序列分析.结合cry1基因的PCR-RFLP基因型鉴定体系,分析与vip1A/vip2A基因有联系的cry1类基因.结果表明,分离保存的171株野生型Bt菌株中,有20株菌株含有vip1A/vip2A基因,分布率为11.69%.成功克隆了菌株Bt16的vip1A/vip2A基因片段,命名为vip1A/vip2A-16,GenBank 登录号为EU594327.cry1基因的PCR-RFLP鉴定结果表明,该20株菌株均含有cry1Fa基因,说明vip1A/vip2A基因与cry1Fa可能具有某种联系.     

Bt杀虫蛋白基因cry8Ea2的克隆、表达和活性

根据已知Bt cry8类基因的全长序列设计一对特异性引物JJX5和JJX3,以Bt菌株B-DLL的质粒DNA为模板扩增出3.5 kb大小的片段;将该片段插入大肠杆菌表达载体pET-21b中,并完成了该片段的全序列测定.该基因编码区为3 495 bp,编码的蛋白质由1 164个氨基酸残基组成,相对分子质量为131.8 kDa,等电点为pH 4.71,为弱酸性蛋白.该基因(GenBank:EU047597)编码的氨基酸序列与Cry8Ea1的氨基酸序列同源性高达99.31%,被国际Bt基因命名委员会正式命名为cry8Ea2.经1PTG诱导后该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够正常表达130 kDa的蛋白.表达产物对暗黑鳃金龟.琉璃弧丽金龟和柳蓝叶甲具有活性,在浓度为8.98ug/s时对暗黑鳃金龟、琉璃弧丽金龟一龄幼虫14 d的校正死亡率分别为46.67%和55.56%;在浓度为89.8 ug/mL时对柳蓝叶甲三龄幼虫96 h的校正死亡率为33.33%.     

两株杀鞘翅目害虫Bt菌株的生物活性及杀虫蛋白基因鉴定

发掘对鞘翅目害虫具有活性的苏云金芽孢杆菌(Bt)菌株和杀虫蛋白基因在生物防治中日益受到人们的重视。利用杀鞘翅目Bt基因通用引物进行PCR检测与生物测定相结合的方法,从山东省各地土壤中分离的66株Bt中筛选获得了两株对鞘翅目昆虫具有杀虫活性的菌株B-DLL和B-JJX,并采用SDS-PAGE和PCR-RFLP方法对其杀虫晶体蛋白和杀虫基因类型进行了鉴定。结果表明,菌株B-DLL和B-JJX对华北大黑鳃金龟1龄幼虫14 d的校正死亡率分别为86.7%和60.0%,对暗黑鳃金龟1龄幼虫14 d的校正死亡率分别为83.3%和76.7%,对柳蓝叶甲3龄幼虫5 d的校正死亡率分别为33.3%和46.7%。菌株B-DLL的伴孢晶体呈圆形,B-JJX的晶体为近方形,两株Bt的伴孢晶体主要为130 kDa的蛋白,两株Bt均含有新的cry8类基因,而不含cry1、cry2、cry3、cry4/10和cry7等基因。     

杀虫蛋白基因cry8Fa2的克隆及在Bt无晶体突变株中的表达

以本实验室分离的Bt菌株B-DLL质粒DNA为模板,利用cry8类基因特异性引物JJX5和JJX3扩增出3.5kb的片段,将该片段插入克隆载体pMD 18-T中,筛选获得一个含新基因的克隆pMD-cry8new.序列测定表明,该基因编码区为3 525 bp,编码的蛋白质由1 174个氨基酸残基组成,理论分子量为133....     

苏云金芽胞杆菌cry2Ac4基因在 大肠杆菌中的表达

在大肠杆菌中表达苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）cry2Ac4基因;笔者以含有Bt WB9菌株cry2Ac4基因的质粒pMD2Ac为模板,利用cry2Ac4基因的特异引物对(ET-F/ET-R)扩增获得该基因,进而将cry2Ac4基因与pET-29a原核表达载体连接;成功构建了重组表达载体并转化大肠杆菌JM109,从阳性转化子中提取重组表达质粒pET-29a-cry2Ac4,再转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,经IPTG诱导后,对诱导表达产物进行了SDS-PAGE检测;cry2Ac4基因编码的约70kDa蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。     

苏云金芽孢杆菌新菌株GGD-4杀虫晶体蛋白基因分析

利用稀释平板培养法从连云港地区的土壤中分离了一株苏云金芽孢杆菌新菌株GGD-4,通过PCR-RFLP鉴定体系和SDS-PAGE方法分析了此菌株中cry基因类型和表达蛋白。结果表明:该菌株中含有cry1Aa基因型,同时表达130~140kD的蛋白;但EcoRⅠ和PstⅠ酶切结果不同于正常的cry1Aa基因,实验中利用生物信息学方法设计的cry1Aa基因特异引物对扩增后也证明含有cry1Aa基因。室内生测结果显示,该菌株对重要的农业害虫甜菜夜蛾、菜青虫等均有较高的杀虫毒力。     

苏云金芽孢杆菌cry1Ea基因的克隆及 生物信息学分析

不同来源的苏云金芽孢杆菌能产生多种多样的晶体(Cry)蛋白。基于这个特性,人们可以通过基因工程的手段向工程菌中转入编码多种Cry毒素的基因来控制虫害。通过DNA重组技术,从Bt HZM2菌株中克隆出了cry1Ea基因,对其进行了生物信息学分析,同源比对结果表明,cry1Ea8基因的核苷酸序列与已知cry1Ea的同源性为99.77%~99.91%,对应的氨基酸序列同源性为99.49%~99.74%。对cry1Ea8基因的分析还揭示出了cry1Ea8及其编码蛋白的一些生物和理化性质。结构域预测表明,Cry1Ea8由3个结构域组成,其中N-末端螺旋状结构域与膜插入与孔隙形成有关,而第二和第三个结构域与受体的结合有关。该研究为转基因抗虫植物和微生物杀虫工程菌的构建提供了新的基因来源。     

苏云金芽孢杆菌SHJ-5菌株杀虫晶体蛋白基因分析

苏云金芽孢杆菌SHJ-5菌株是从黑龙江采集的土样中分离获得的新菌株,对其伴孢晶体形状、基因型、蛋白表达以及杀虫活性进行了系统研究.菌株SHJ-5产生的伴孢晶体形状为钝菱形;利用PCR-RFLP技术对该菌株的基因型进行鉴定,结果表明,该菌株含有cry1Aa、cry1Ea、cry1Be、cry1Ah、cry1Ai、cry2...     

苏云金芽孢杆菌cry1基因的克隆、植物表达载体的构建及转化大豆

此研究利用醋酸钠-抗生素加热法从土壤中分离获得1株产晶体的苏云金芽孢杆菌菌株（Bacillus thuringiensis）。通过已知cry1基因设计引物,以分离得到的菌株DNA为模板进行PCR扩增,将克隆到的目的片段进行测序。测序结果表明：该序列与cry1基因同源性达到90%~99%。将该基因连接到植物双元表达载体pBI121中,构建了该基因的植物表达载体,并将阳性重组质粒转化根癌农杆菌EHA105,利用农杆菌侵染子叶节的方法进行大豆的转化。通过初步的PCR验证,成功获得了转基因植株,建立了大豆的转化体系。     

DNA shuffling技术改造Bt基因的水稻转化研究

本试验挑选了以cry1Ab、cry1Ac、cry9C、cry1C和cry2A等5个基因经DNA family-shuffling改造后的不同组的14个杀虫活性有显著提高的重组胁基因，通过农杆菌介导法转入水稻品种中花11中。各基因均获得80棵以上独立转化植株，通过对转化植株的PCR阳性检测，获得了约75％的阳性单株。Southern结果显示转化植株的拷贝数分别是1～12不等，单拷贝率为12％；Northern分析其表达量，结果显示除了很少发生基因沉默外其余单株均表达了胁基因，但是植株间表达量差异较大：随机挑选阳性植株喂食一龄的二化螟进行生测实验，与原始基因相比，14个重组反基因均表现出了较高的毒性。     

Development of photoperiod- and thermo-sensitive male sterility rice expressing transgene Bacillus thuringiensis

Stem borers and leaffolders are the main pests that cause severe damage in rice (Oryza sativa L.) production worldwide. We developed the first photoperiod- and thermo-sensitive male sterility (PTSMS) rice 208S with the cry1Ab/1Ac Bacillus thuringiensis (Bt) gene, through sexual crossing with Huahui 1 (elite line with the cry1Ab/1Ac gene). The novel 208S and its hybrids presented high and stable resistance to stem borers and leaffolders, and the content of Cry1Ab/1Ac protein in chlorophyllous tissues achieved the identical level as donor and showed little accumulation in non-chlorophyllous tissue. No dominant dosage effect in the Bt gene was observed in 208S and its derived hybrids. An analysis of fertility transition traits indicated that 208S was completely sterile under long day length/high temperature, but partially fertile under short day length/low temperature. With fine grain quality and favorable combining ability, 208S had no observed negative effects on fertility and agronomic traits from Bt (cry1Ab/1Ac). Additionally, 208S as a male sterile line showed no fertility decrease caused by Bt transgenic process, as it is the case in Huahui 1. Thus, 208S has great application value in two-line hybrid production for insect resistance, and can also be used as a bridge material in rice Bt transgenic breeding.     

猪瘟病毒Shimen株p80基因的克隆及其真核表达质粒的构建

根据已发表的猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)Alfort株和Brescia株的全基因组序列,设计2对引物P1/P2和B1/B2,在B1和B2的5'端分别加上XhoI和ApaI位点,以CSFVShimen株细胞毒为材料一步法提取总RNA,并以此为模板采用反转录PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR),成功地扩增到约2.0kb的片段,将此PCR产物回收后与pMD18-T连接、转化,获得重组质粒,经PCR扩增,限制性酶切(BamhI/HindШ)和序列部分测定鉴定为阳性重组质粒P80-T。将P80-T分别经XhoI和ApaI酶切消化、回收后,与经XhoI/ApaI酶解的真核表达载体PEGPF-C1连接、转化,获得重组质粒,经PCR,XhoI和ApaI限制性酶切和序列测定鉴定为真核表达质粒P80-P,目的基因的插入位置、方向和读码框完全正确。为下一步在哺乳动物细胞中表达猪瘟病毒p80蛋白奠定了基础。     

布鲁氏菌omp25基因真核表达载体的构建与分析

摘 要: 【目的】 构建表达流产布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25的酿酒酵母表达菌并进行验证。 【方法】 对流产布鲁氏菌疫苗株S19外膜蛋白基因omp25设计特异引物进行PCR扩增,连接到pGM-T载体上,获得pGM-T-omp25,进行PCR扩增、酶切、测序鉴定。将质粒pGM-T-omp25与pGBKT7载体进行EcoRⅠ/SalⅠ双酶切,回收DNA片段,并进行连接,构建pGBKT7-omp25后,转化酿酒酵母菌Y187,并进行PCR鉴定、自激活实验和毒性检测。 【结果】 克隆了流产布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25,PCR、酶切、测序表明成功构建了pGBKT7-omp25真核表达载体,获得的转化子酵母Y187菌株无自激活活性,无毒性。 【结论】 成功构建了表达流产布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25的酿酒酵母表达菌,为揭示流产布鲁氏菌感染与母畜流产间的分子机制奠定基础。关键词：流产布鲁氏菌;基因omp25;酿酒酵母Y187;真核表达