苏云金芽胞杆菌cry2Ac4基因在 大肠杆菌中的表达

在大肠杆菌中表达苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）cry2Ac4基因;笔者以含有Bt WB9菌株cry2Ac4基因的质粒pMD2Ac为模板,利用cry2Ac4基因的特异引物对(ET-F/ET-R)扩增获得该基因,进而将cry2Ac4基因与pET-29a原核表达载体连接;成功构建了重组表达载体并转化大肠杆菌JM109,从阳性转化子中提取重组表达质粒pET-29a-cry2Ac4,再转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,经IPTG诱导后,对诱导表达产物进行了SDS-PAGE检测;cry2Ac4基因编码的约70kDa蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。     

3个抗虫耐盐基因载体对烟草的遗传转化及表达分析

病虫害和土壤盐渍化是影响烟草生长发育的重要因素,转基因技术已成为改善这一现状的有效手段。本研究将部分改造的Bt基因Cry1Ac基因、Cry3A基因及NTHK1基因构建在同一载体上,利用农杆菌介导法转化野生烟草植株。经PCR检测,获得10个转基因株系。经荧光定量PCR检测,Cry1Ac基因表达量在104~10~5数量级,1号转录丰度1.58×10~5为最高,而Cry3A基因表达量在10~5~10~6数量级,10号转录丰度1.34×10~6为最高;10个转基因株系双Bt基因均得到表达且存在表达差异,而对照烟草没有Bt基因表达。经ELISA检测,转基因烟草Cry1Ac蛋白平均表达量为150.441 ng/g,变化在0.86~201.74 ng/g;Cry3A蛋白平均表达量为1 192.592 ng/g,变化在23.33~2413.47 ng/g。经过对烟草斜纹夜蛾的虫试,初步证明转基因植株获得了抗虫性。组培苗耐盐试验表明,不同盐浓度条件下,转基因株系的分化状况优于对照。证明抗虫耐盐多基因的一次性转化,可提高烟草的抗虫能力和耐盐性。     

大肠杆菌中的表达

 在大肠杆菌中表达苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）cry2Ac4基因;笔者以含有Bt WB9菌株cry2Ac4基因的质粒pMD2Ac为模板,利用cry2Ac4基因的特异引物对(ET-F/ET-R)扩增获得该基因,进而将cry2Ac4基因与pET-29a原核表达载体连接;成功构建了重组表达载体并转化大肠杆菌JM109,从阳性转化子中提取重组表达质粒pET-29a-cry2Ac4,再转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,经IPTG诱导后,对诱导表达产物进行了SDS-PAGE检测;cry2Ac4基因编码的约70kDa蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。     

苏云金杆菌vip1A/vip2A基因的鉴定及其与cry1基因的联系

利用PCR方法检测vip1A/vip2A基因在野生型Bt菌株中的分布,进行基因片段的克隆和序列分析.结合cry1基因的PCR-RFLP基因型鉴定体系,分析与vip1A/vip2A基因有联系的cry1类基因.结果表明,分离保存的171株野生型Bt菌株中,有20株菌株含有vip1A/vip2A基因,分布率为11.69%.成功克隆了菌株Bt16的vip1A/vip2A基因片段,命名为vip1A/vip2A-16,GenBank 登录号为EU594327.cry1基因的PCR-RFLP鉴定结果表明,该20株菌株均含有cry1Fa基因,说明vip1A/vip2A基因与cry1Fa可能具有某种联系.     

改造Cry1Ac蛋白C端对转基因水稻抗二化螟虫的影响

二化螟虫的泛滥严重影响水稻的产量,cry1Ac基因是目前世界上应用最广泛和最高效的抗虫基因之一,但二化螟虫通过进化会逐渐对其产生抗性。通过改变蛋白结构来构建新的Cry蛋白是解决这一问题的有效途径之一。为分析改造Cry1Ac蛋白C端能否对转基因作物抗虫性产生影响,本研究采用Cry1Ja蛋白的C端替换Cry1Ac蛋白的C端,重组获得CryFLAc蛋白。将cry1Ac基因和编码CryFLAc蛋白的cryFLAc基因分别构建到pTF101.1-ubi植物表达载体上,利用农杆菌介导方法转化到吉林省水稻品种吉粳88中;采用PCR、RT-PCR、免疫检测试纸条检测的方法确定cry1Ac、cryFLAc基因整合和表达情况;通过室内和田间抗虫性测试评价CryFLAc和Cry1Ac蛋白对T1代转基因水稻抗虫性的影响。研究发现:cry1Ac、cryFLAc基因均成功整合到水稻基因组中,并稳定表达;转cryFLAc基因水稻抗二化螟水平达到抗性级别,转cry1Ac基因水稻达到高抗级别;转cry1Ac基因水稻二化螟抗性高于转cryFLAc基因水稻。结果表明:Cry1Ja蛋白的C端替换Cry1Ac蛋白的C端不会提高转基因水稻的抗虫性。上述研究为人工设计合理化改造Cry蛋白提供了新的理论依据。     

Bt毒蛋白转基因植物的潜在问题及其研究对策

1 Bt毒蛋白转基因植物研究概述 Bt毒蛋白转基因植物的研究源于1981年Schnepf等人成功克隆Bt杀虫毒蛋白基因.1986年Obukowics等人采用转座子Tn5介导的方法,将cry1Ab基因引入植物的假单孢杆菌,使植物产生抗虫性,创造了第一代Bt转基因抗虫植物     

Cry1Ab/1Ac基因在转基因玉米中的表达研究

本研究通过人工合成获得了密码子的优化Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab/1Ac,并以草甘膦抗性基因epsps为标记基因,构建了高效表达载体pBAC174,并用基因枪法将表达载体pBAC174导入受体材料幼胚愈伤组织。对轰击后的愈伤组织进行筛选、分化和植株再生,获得40个草甘膦抗性的玉米再生植株。经PCR和Southern杂交检测表明,外源Cry1Ab/1Ac基因已经整合到玉米的基因组中。转基因植株叶片蛋白粗提物用BT-Cry1Ab/1Ac金标免疫检测试纸条检测,结果表明Bt基因在部分转基因植株后代获得了表达。本研究为进一步利用Cry1Ab/1Ac基因进行玉米抗虫育种奠定了基础。     

一株苏云金芽孢杆菌的分离与杀虫基因的鉴定

采用温度筛选从云南省刁苓山土壤中分离得到一株伴孢晶体为长菱形的苏云金芽孢杆菌BSH-1。利用PCR-RFLP鉴定体系和SDS-PAGE对菌株所含cry基因类型和晶体蛋白的构成进行鉴定、分析,结果表明:菌株BSH-1具有的cry基因组合为:cry1Aa,cry1Ac,cry1Db,cry2Ab,cry1Ia,表达的晶体蛋白有130,70和56 kDa 3种,该蛋白对甜菜夜蛾具有较高杀虫活性,LC50为1.43 ng/mg。该菌株的基因组合类型对构建杀虫基因工程菌具有重要参考价值。     

转cry1Aa基因抗虫棉整合结构解析及转化体特异性检测方法的建立

【目的】cry1Aa基因是2011年本实验室在我国棉花商品种子中发现的1种未经批准的转基因成分,本研究旨在通过整合结构解析,建立特异性检测方法,对市售棉种进行初测,明确该外源基因在我国棉种中的存在情况。【方法】通过Genome walking、长链PCR分离获得了转cry1Aa基因棉花转化体(定名为NN6转化体,简称NN6)的外源基因整合结构,同时基于插入位点基因组及外源DNA连接区,建立了NN6转化体特异性的定性聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)方法和实时荧光定量PCR方法。【结果】NN6整合结构主要包括cry1Aa、aad和Npt II基因,插入棉花基因组7号染色体37 169 450位,产生91 bp基因组缺失;所构建的定性PCR检测方法能特异、快速地对棉花单株和种子单粒中NN6转化体的纯/杂合状态进行鉴定,实时荧光定量PCR检测限为44拷贝,能满足国内外对转基因标识的需要;对含有cry1Aa基因的3个市售棉种进行检测,其纯合度分别为1.51%,5.21%和21.09%。【结论】本研究解析了NN6的整合结构,并建立特异性检测方法,为我国转基因棉花新品种选育及转基因安全管理提供技术手段。     

苏云金芽孢杆菌cry1Ea基因的克隆及 生物信息学分析

不同来源的苏云金芽孢杆菌能产生多种多样的晶体(Cry)蛋白。基于这个特性,人们可以通过基因工程的手段向工程菌中转入编码多种Cry毒素的基因来控制虫害。通过DNA重组技术,从Bt HZM2菌株中克隆出了cry1Ea基因,对其进行了生物信息学分析,同源比对结果表明,cry1Ea8基因的核苷酸序列与已知cry1Ea的同源性为99.77%~99.91%,对应的氨基酸序列同源性为99.49%~99.74%。对cry1Ea8基因的分析还揭示出了cry1Ea8及其编码蛋白的一些生物和理化性质。结构域预测表明,Cry1Ea8由3个结构域组成,其中N-末端螺旋状结构域与膜插入与孔隙形成有关,而第二和第三个结构域与受体的结合有关。该研究为转基因抗虫植物和微生物杀虫工程菌的构建提供了新的基因来源。     

苏云金芽胞杆菌CY1菌株的cry基因分析

通过醋酸钠-抗生素筛选法从河北省土壤中筛选得到了苏云金芽孢杆菌新菌株CY1。镜检可观察到伴孢晶体呈小菱形。SDS-PAGE分析结果表明菌株CY1表达的晶体蛋白分子量为130 kDa。利用25对通用引物检测cry1,cry1I,cry7,cry2,cry3,cry4/cry10,cry5,cry6,cry7,cry8,cry9,cry11,cry13/14,cry16/17,cry18,cry19,cry21,cry22,cry24/25,cry26/28,cry27/29,cry30,cry32,cry34/35,cry40基因,仅从CY1菌株中检测出cry7基因,该cry7基因N末端的1 215 bp片段所编码的氨基酸序列与已发表的Cry7Ab1(Acc No.:U04367)序列同源性达99%,仅有2个氨基酸的差异。用3对cry7Ab特异引物检测,进一步证实该菌株携带有cry7Ab基因。     

苏云金芽孢杆菌SHJ-5菌株杀虫晶体蛋白基因分析

苏云金芽孢杆菌SHJ-5菌株是从黑龙江采集的土样中分离获得的新菌株,对其伴孢晶体形状、基因型、蛋白表达以及杀虫活性进行了系统研究.菌株SHJ-5产生的伴孢晶体形状为钝菱形;利用PCR-RFLP技术对该菌株的基因型进行鉴定,结果表明,该菌株含有cry1Aa、cry1Ea、cry1Be、cry1Ah、cry1Ai、cry2...     

Development of photoperiod- and thermo-sensitive male sterility rice expressing transgene Bacillus thuringiensis

Stem borers and leaffolders are the main pests that cause severe damage in rice (Oryza sativa L.) production worldwide. We developed the first photoperiod- and thermo-sensitive male sterility (PTSMS) rice 208S with the cry1Ab/1Ac Bacillus thuringiensis (Bt) gene, through sexual crossing with Huahui 1 (elite line with the cry1Ab/1Ac gene). The novel 208S and its hybrids presented high and stable resistance to stem borers and leaffolders, and the content of Cry1Ab/1Ac protein in chlorophyllous tissues achieved the identical level as donor and showed little accumulation in non-chlorophyllous tissue. No dominant dosage effect in the Bt gene was observed in 208S and its derived hybrids. An analysis of fertility transition traits indicated that 208S was completely sterile under long day length/high temperature, but partially fertile under short day length/low temperature. With fine grain quality and favorable combining ability, 208S had no observed negative effects on fertility and agronomic traits from Bt (cry1Ab/1Ac). Additionally, 208S as a male sterile line showed no fertility decrease caused by Bt transgenic process, as it is the case in Huahui 1. Thus, 208S has great application value in two-line hybrid production for insect resistance, and can also be used as a bridge material in rice Bt transgenic breeding.     

DNA shuffling技术改造Bt基因的水稻转化研究

本试验挑选了以cry1Ab、cry1Ac、cry9C、cry1C和cry2A等5个基因经DNA family-shuffling改造后的不同组的14个杀虫活性有显著提高的重组胁基因，通过农杆菌介导法转入水稻品种中花11中。各基因均获得80棵以上独立转化植株，通过对转化植株的PCR阳性检测，获得了约75％的阳性单株。Southern结果显示转化植株的拷贝数分别是1～12不等，单拷贝率为12％；Northern分析其表达量，结果显示除了很少发生基因沉默外其余单株均表达了胁基因，但是植株间表达量差异较大：随机挑选阳性植株喂食一龄的二化螟进行生测实验，与原始基因相比，14个重组反基因均表现出了较高的毒性。     

Pyramiding of insect- and disease-resistance genes into an elite indica, cytoplasm male sterile restorer line of rice,'Minghui 63'

The wild‐rice‐derived dominant gene Xa21 conferring multi‐race resistance to bacterial blight and a fused Bt gene cry1Ab/cry1Ac conferring resistance to lepidopteran insects were individually introduced into the same genetic background of an elite indica cytoplasm male sterile (CMS) restorer line ‘Minghui 63′. The line showed the desirable insect‐ and disease‐resistant phenotypes. To maximize the effect, the two genes were also pyramided into the same recipient plant of ‘Minghui 63’ by marker‐assisted selection. After being subjected to natural infestation of leaf‐folders and yellow stem borers and inoculation of Xoo strain mixtures, the pyramiding line and its derived hybrids showed high levels of resistance against both insect damage and disease. Furthermore, data from field trials demonstrated that the hybrids made by crossing this pyramiding line with the CMS lines ‘Zhenshan 97A’ and ‘Maxie A’ retained a similar level of yield under conditions without chemical spray, indicating that the pyramiding genes have a yield‐stabilizing effect on the recipient line and its hybrids.     

苏云金芽孢杆菌新菌株GGD-4杀虫晶体蛋白基因分析

利用稀释平板培养法从连云港地区的土壤中分离了一株苏云金芽孢杆菌新菌株GGD-4,通过PCR-RFLP鉴定体系和SDS-PAGE方法分析了此菌株中cry基因类型和表达蛋白。结果表明:该菌株中含有cry1Aa基因型,同时表达130~140kD的蛋白;但EcoRⅠ和PstⅠ酶切结果不同于正常的cry1Aa基因,实验中利用生物信息学方法设计的cry1Aa基因特异引物对扩增后也证明含有cry1Aa基因。室内生测结果显示,该菌株对重要的农业害虫甜菜夜蛾、菜青虫等均有较高的杀虫毒力。     

河北省不同生态区的苏云金芽孢杆菌cry基因多样性研究

摘要：为了明确苏云金芽孢杆菌在不同的生态区的分布特点,从河北省不同生态地区（阜平天生桥、涞源白石山、安新白洋淀、保定郊区大田、安国中草药田）采集土样806份,采用温度-抗生素法分离Bt菌株46株。利用PCR-RFLP对46株菌进行了基因型研究,结果表明从46株Bt菌株鉴定出八种不同的基因型cry1, cry1I, cry2, cry3, cry4, cry8, cry30, cry32,11株未鉴定出基因型。通过SDS-PAGE分析,结果表明这些菌株主要表达130-150KD,70-80 kD,60kD和30kD蛋白。