冬凌草毛状根体系的建立

用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)ATCC15834、ACCC10060、C58C1菌株对冬凌草无菌幼苗的叶片、茎段进行侵染,而后通过共培养的方法诱导其产生冬凌草毛状根,从而建立有效的冬凌草毛状根培养体系。通过PCR进一步检测T-DNA是否成功导入冬凌草毛状根中。通过用发根农杆菌ATCC15834、ACCC10060、C58C1菌株对冬凌草外植体进行侵染,能够成功诱导产生冬凌草毛状根,从而对冬凌草毛状根培养体系进行建立,在一定程度上为冬凌草毛状根的大规模培养奠定基础。     

地黄毛状根的诱导及条件优化

以发根农杆菌Accc10060菌株侵染地黄外植体,研究不同菌液浓度、不同侵染时间和不同共培养时间对地黄毛状根诱导率的影响。结果表明,发根农杆菌Accc10060菌株可成功诱导出地黄毛状根,PCR检测发现发根农杆菌Ri质粒rol C基因已整合到地黄基因组中并得到表达;单因素试验结果显示,在地黄毛状根的诱导过程中,诱导的最佳菌液浓度为OD600=0.6,最佳侵染时间为10 min,最佳共培养时间为4 d。     

发根农杆菌介导芸芥的遗传转化及其次生代谢物的研究

[目的]研究发根农杆菌介导芸芥的遗传转化条件,并测定次生代谢物的含量。[方法]通过发根农杆菌R1000介导的遗传转化,建立芸芥发状根的诱导和培养体系,采用氯化钯分光光度法和高效液相色谱法对该发根培养物合成硫苷的能力进行初步分析,并分析乙酰丁香酮（As）、浸染液pH值和浸染时间等因素对发状根转化频率的影响。[结果]子叶的转化率明显高于下胚轴;AS最佳浓度为100mg／L,浸染液最佳pH值为5．4,最佳浸染时间为20min。PCR的鉴定结果表明,发根农杆菌R1000的rolB基因已成功地转入并整合到该发根培养物的基因组中。[结论]该方法建立了芸芥发状根培养体系,并初步分析了该发状根中硫苷的含量,为以后的研究奠定了一定的基础。     

罗勒毛状根的诱导及培养

[目的]利用4种发根农杆菌R1,R1601,1025,1000诱导药用植物罗勒产生毛状根,建立毛状根培养体系。[方法]利用共培养法研究不同外植体、菌株、预培养时间、感染时间以及外源激素等对罗勒毛状根诱导率的影响。[结果]利用发根农杆菌1025,预培养2d的叶片为转化材料,感染6～8min,加入0.1mg/LNAA的诱导率最高。经过基本培养基的筛选和毛状根生长动力学的考察,确立罗勒毛状根在1/2MS培养基中的最佳继代时间为21d。[结论]罗勒毛状根离体培养的建立,为进一步进行药用活性成分的工业化生产奠定了基础。     

曼陀罗毛状根的诱导及其悬浮培养合成天麻素初探

利用A4和R1601两种发根农杆菌菌株分别感染曼陀罗的嫩叶及嫩茎诱导产生毛状根。探讨了不同菌株、不同外植体、蔗糖预处理、外植体预培养与染菌时间以及外植体二次染菌等条件对转化频率的影响,并建立毛状根悬浮培养体系及转化外源底物对羟基苯甲醇合成天麻素。结果表明:A4转化频率高于R1601;嫩叶转化频率最高;嫩叶最佳预培养时间为4 d;最佳染菌时间为5 min。HPLC法分析表明,悬浮培养毛状根能转化外源底物对羟基苯甲醇合成天麻素。     

发根农杆菌诱导草莓毛状根的研究

[目的]建立高效的发根农杆菌诱导草莓生根再生体系。[方法]以适合安徽省栽培的草莓优良品种丰香为试材,利用发根农杆菌R1601侵染植物细胞,观察发根农杆菌诱导草莓离体叶片产生毛状根的效果。[结果]发根农杆菌R1601培养成功;Carb有效除菌浓度为500 mg/L;当发根农杆菌R1601的菌液OD600=0.6时,草莓叶片毛状根的诱导率最高,而高于或低于该密度,诱导率均呈下降趋势。[结论]建立了发根农杆菌诱导草莓毛状根再生体系,为草莓利用发根农杆菌进行抗除草剂bar基因转化研究奠定基础。     

发根农杆菌A4菌株诱导三分三毛状根的研究

利用发根农杆菌A4菌株侵染三分三组培苗叶片诱导毛状根,并对其毛状根进行继代增殖培养;采用PCR技术检测毛状根。结果表明：发根农杆菌A4菌株Ri质粒的rolB基因已整合到三分三叶肉细胞的基因组中,进而成功地从叶片诱导出毛状根,诱导率可达77%以上;毛状根除菌后,能在无激素的MS固体培养基上快速生长。三分三遗传转化体系的建立为实现基于毛状根的三分三产托品烷类生物碱的代谢工程奠定基础。     

乌克兰龙葵毛状根诱导条件优化

[目的]利用3种发根农杆菌A4、C58C1、A1476诱导乌克兰龙葵产生毛状根,探究乌克兰龙葵毛状根诱导的最佳条件。[方法]利用植物组织培养技术,研究不同外植体、菌株、侵染时间、预培养天数、菌液浓度和共培养天数等对乌克兰龙葵毛状根诱导率的影响。[结果]叶片为最佳外植体材料;3种菌株均能诱导出毛状根,但A4诱导率最高;最佳菌液浓度为OD600=0.6;最佳侵染时间为5 min;预培养和共培养均为2 d时诱导率最高。[结论]乌克兰龙葵毛状根诱导条件的优化,为其他植物毛状根诱导提供参考,同时为进一步利用植物毛状根生产药用成分提供试验基础。     

苦荞麦毛状根的诱导研究

利用发根农杆菌Ri1601浸染苦荞植物预培养2d的叶片外植体,经不同时间的共培养和除菌培养后获得毛状根。经硅胶薄层色谱板检测表明,发根农杆菌Ri1601和苦荞叶片上未经转化产生的不定根都不含有冠瘿碱;而经发根农杆菌Ri1601遗传转化后所产生的毛状根有冠瘿碱的存在。因此,可确定苦荞叶片上产生的毛状根为发根农杆菌Ri1601转化所得。建立了用发根农杆菌Ri1601诱导苦荞植物叶片产生毛状根的有效方法。     

发根农杆菌对不同烟草品种发状根诱导和培养的影响

为了探讨烟草的发状根培养技术,建立高效的发状根培养系统,为次生代谢物的开发和利用提供新的途径,试验以K326、NC89、鄂烟1号烟草无菌苗为材料,对发根农杆菌C58C1 Ri质粒转化烟草产生发状根进行了研究。结果表明,3个烟草品种中K326转化效率最高,不同部位中子叶叶柄的转化效率最高,最佳的培养基为无激素的MS固体培养基(MS0)。通过根尖活体压片、PCR检测和GUS报告基因检测3种方法,证明发根农杆菌Ri质粒在转化根上得到表达。     

重金属镉超富集植物油菜毛状根转基因诱导

为了诱导重金属镉超富集植物油菜毛状根形成并获得较高的转化率,利用正交试验(L8(27))优化油菜毛状根诱导的最佳条件,正交实验结果表明:利用发根农杆菌ATCC11325对预培养48 h的油菜子叶进行转化,转化时间10 min,加入0.3 mg/L的2,4-D激素时,油菜毛状根的诱导率可达到73%.PCR扩增显示农杆菌Ri质粒中的rolC基因已经插入并整合到油菜核基因组中,成功建立了油菜毛状根体系.     

花生毛状根诱导及其体外培养

[目的]优化花生毛状根诱导条件,为体外培养毛状根生产白藜芦醇以及培养花生根结线虫奠定基础。[方法]研究不同的发根农杆菌及其菌液浓度、外植体类型、侵染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度对花生毛状根诱导的影响。[结果]发根农杆菌ACCC10060的毛状根诱导率高于ATCC11325;幼叶外植体的毛状根诱导率高于子叶;最佳侵染菌液浓度为0.2～0.4;最佳共培养时间为2 d;最佳侵染时间为10～15 min;菌液中添加75μmol/L乙酰丁香酮(AS)可以提高毛状根诱导率。通过毛状根能在无激素的MS培养上自主生长以及毛状根冠瘿碱检测,确定发根农杆菌中Ri质粒中已整合到花生基因组中。毛状根体外培养的研究表明,液体培养效果好于固体培养,最佳液体培养基为无激素的MS培养基。[结论]该研究建立的花生毛状根培养体系,将为花生转基因技术的完善及利用毛状根生产白藜芦醇和无菌的花生根结线虫提供试验基础。     

党参毛状根诱导条件研究

[目的]研究党参毛状根的诱导条件。[方法]利用发根农杆菌A4、C58C1和A1476进行毛状根诱导,探讨发根农杆菌种类、外植体类型、菌液浓度、侵染时间和共培养天数等因素对党参毛状根诱导的影响。[结果]3种发根农杆菌中A4诱导率最高;茎段的诱导率最高;发根农杆菌浓度在OD_(600)为0.4时诱导效果较好;较佳侵染时间为5 min;共培养时间为2 d时诱导率较高;头孢噻肟钠浓度为300 mg/L时除菌效果较好。[结论]该试验为大量生产毛状根以及毛状根的后续研究提供试验基础。     

不同发根农杆菌诱导花生发根研究

利用5种发根农杆菌侵染不同花生外植体,对比其发根诱导率,分析寻找利于花生转化的外植体、花生品种及发根农杆菌。结果表明,农杆菌94022诱导发根率较其它发根农杆菌高;后期继代培养中子叶诱导的发根易于培养,存活率高,生长状态好;在用培养后的子叶为外植体时,花育20较其它品种发根诱导率高。     

曼陀罗毛状根的诱导及其悬浮培养合成天麻素初探*

 利用A₄和R₁₆₀₁两种发根农杆菌菌株分别感染曼陀罗的嫩叶及嫩茎诱导产生毛状根。探讨了不同菌株、不同外植体、蔗糖预处理、外植体预培养与染菌时间以及外植体二次染菌等条件对转化频率的影响,并建立毛状根悬浮培养体系及转化外源底物对羟基苯甲醇合成天麻素。结果表明:A₄转化频率高于R₁₆₀₁;嫩叶转化频率最高;嫩叶最佳预培养时间为4 d;最佳染菌时间为5 min。HPLC法分析表明,悬浮培养毛状根能转化外源底物对羟基苯甲醇合成天麻素。     

黄秋葵再生体系的建立及毛状根的诱导

[目的]建立黄秋葵的再生体系并诱导其毛状根。[方法]以黄秋葵无菌苗的叶片和茎段为外植体,建立黄秋葵的体细胞再生体系,并利用发根农杆菌A4侵染黄秋葵叶片,诱导毛状根。[结果]愈伤组织的最佳诱导培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA时;最佳体细胞胚发生培养基为MS+0.5 mg/L NAA;毛状根最佳诱导条件为叶片预培养48 h,侵染时间6 min。[结论]该研究为成功构建黄秋葵遗传转化体系和研究黄秋葵中的次生代谢产物奠定了基础。     

黄秋葵再生体系的建立及毛状根的诱导

[目的]建立黄秋葵的再生体系并诱导其毛状根.[方法]以黄秋葵无菌苗的叶片和茎段为外植体,建立黄秋葵的体细胞再生体系,并利用发根农杆菌A4侵染黄秋葵叶片,诱导毛状根.[结果]愈伤组织的最佳诱导培养基为MS＋ 1.0 mg/L 6-BA ＋0.5 mg/L NAA时;最佳体细胞胚发生培养基为MS ＋0.5 mg/L NAA;毛状根最佳诱导条件为叶片预培养48h,侵染时间6min.[结论]该研究为成功构建黄秋葵遗传转化体系和研究黄秋葵中的次生代谢产物奠定了基础.     

BIBAC2载体转化水稻的研究

双元细菌人工染色体(BIBAC)载体具有克隆大片段DNA构建文库和农杆菌介导转化植物的双重功能.利用BIBAC载体,在双子叶植物烟草和番茄中已实现了大片段DNA的转移,但在单子叶植物中的应用还未见报道.本研究利用不同水稻基因型、不同农杆菌菌株,对水稻进行了BIBAC2载体的转化研究.水稻成熟胚诱导愈伤组织经过1~2次继代培养,在含乙酰丁香酮的N6培养基上预培养3 d,在含BIBAC2载体的农杆菌中侵染10 min,26℃下共培养3 d.感染后的愈伤组织在含25~50 mg/L潮霉素培养基上经过4~8周的筛选,共得到了66株抗性再生植株.通过对抗性植株中GUS基因的组织化学染色检测,NPTII基因的PCR检测和ELISA检测,HYG基因的PCR检测,确认2株阳性植株来自EHA105菌系侵染的中花15号愈伤组织,1株阳性植株来自EHA105菌系侵染的中花8号愈伤组织,转化率分别为2.9%和0.9%.结果表明,BIBAC2载体已被成功导入了水稻基因组中,转化效果EHA105菌株优于C58C1菌株,中花15号、中花8号优于中花10号和中花11号.结果还表明,利用三亲交配法可以将大于23.5 kb的载体转化到农杆菌中.初步建立了BIBAC2载体转化水稻的技术体系,为利用BIBAC系统向水稻转入大片段DNA和多个外源功能基因奠定了基础.     

人参发根的诱导及其分子检测

[目的]探讨发根农杆菌诱导人参发根分子机理。[方法]用发根农杆菌A4菌株感染3年生人参根外植体,在无激素的MS培养基上诱导人参发根,并对其进行分子检测,考察rolB和rolC基因是否转化并整合到人参基因组中。[结果]成功获得了人参发根,该发根在固体和液体培养基上得到了很好的继代;从人参发根DNA中检测到rolB和rolC基因,与已发表发根农杆菌质粒相应的核苷酸序列的同源性达到99%。[结论]发根农杆菌质粒的rolB和rolC基因已转化并整合到人参基因组中,是人参发根产生的分子机理。     

青蒿植物的遗传转化研究

为了建立利用发根农杆菌诱导青蒿植物Artemisia annuaL.毛状根的培养系统,分别用发根农杆菌Ri1601、ATCC15834感染青蒿无菌苗的子叶、下胚轴、叶片、叶柄等外植体获得毛状根,并比较不同因素对毛状根诱导和生长的影响。发根农杆菌诱导青蒿毛状根的有效方法被建立,借此为青蒿大规模遗传转化提供了理论基础。