秋子梨等九个品种S基因型的鉴定

根据梨S基因高度保守区设计兼并引物,对各秋子梨品种的基因组进行S基因特异性扩增、连接、转化并测序,GenBank中比较后确定各品种的S基因型.9个供试品种的S基因型分别为:秋子梨中的'寒香'为S36Sx,'苹香'为S1S31,'南果梨'为S34S34,'金香水'为S1Si,'延边大香水'为S31S36,'寒红'为S27S34,'小香水'为S29S34,'花盖王'为S31S31S34S34,白梨中的'锦丰'为S19S34.     

京白梨等品种S 基因型鉴定及新基因S28 和S30 的核苷酸序列分析

 根据梨S基因高度保守区C1和C3区, 设计1对引物P1和P2, 对梨品种的基因组DNA进行S基因特异扩增、克隆、测序, 并在GenBank中BLAST比较, 确定S 基因特异性片段, 对京白梨等6个供试自交不亲和品种的S基因型比对结果为: 白梨中的‘库尔勒香梨’为S₂₁ S₂₈ , ‘苹果梨’为S₁₇S₁₉ ; 砂梨中的‘台湾蜜梨’为S₁₁ S₂₂ ; 西洋梨中的‘葫芦梨’为S_a S_b; 秋子梨中的‘京白’为S₁₆ S₃₀ , ‘早梨18’为S₄ S₂₈。其中S₂₈和S₃₀为首次登录的新S 基因, 在GenBank的登录号分别为AY562394 (库尔勒香梨) 和AY876945 (京白) 。     

中国樱桃泰山干樱S-RNase基因的克隆及序列分析

以中国樱桃品种泰山干樱为试材,利用李属植物C2、C5保守区引物,扩增花柱S-RNase基因,获得4个S等位基因,测序结果表明序列大小分别为:1608、950、796、504bp。根据同源比较发现大小为796bp的等位基因与基因库中登录的S1-RNase为同一基因,其它3个S-RNase基因为首次报道,依序列大小分别命名为S2(1608bp,登陆号EF541168)、S4(950bp,登陆号EF541173)和S6(504bp,登陆号EF541172)。序列分析表明S2-RNase在C3区存在终止密码子,导致翻译提早终止;S4-RNase的C5区前有插入片断;S6-RNase在高变区比其它S等位基因少一个氨基酸残基。氨基酸序列同源性比较分析表明,中国樱桃S-RNase与樱花、扁桃的相似性高。在系统进化树中中国樱桃的4个S-RNase基因的氨基酸序列和樱花、扁桃、甜樱桃、酸樱桃等一起归于李亚科。     

白梨新S基因的克隆

 采用PCR - RFLP检测、DNA序列分析和田间杂交试验, 从白梨中分离鉴定了1个新的S-RNase基因。该S-RNase基因PCR扩增产物大小与S-RNase基因PCR产物相似, 为450 bp左右。但PCR -RFLP和DNA序列分析均表明, 它与S₈-RNase基因存在较大差异, 该基因内含子为252 bp, 而S₈-RNase的内含子为234 bp, 并在高变区中具有10个氨基酸出现替换, 有两个氨基酸出现缺失。而该S-RNase基因却与S₁₂-RNase基因具有较高的相似性, 在HV区中只有1处碱基被替换, 周边区中有10处出现碱基替换或缺失。因此, 继梨S18-RNase基因, 将它命名为S₁₉-RNase基因(AY250987) 。与S 基因型已确定的梨品种的杂交坐果率也说明了该基因是一个新的S-RNase基因。     

2个中亚杏S-RNase基因全长的克隆与序列分析

【目的】克隆中亚杏(Prunus armeniaca)品种自交不亲和花柱S-RNase基因全长序列,为分子手段调控杏自交不亲和性状奠定基础。【方法】以新疆栽培杏品种‘索格佳娜丽’和‘赛买提’为试材,利用RT-PCR克隆2个品种的花柱SRNase基因c DNA片段,RACE技术进行c DNA全长克隆,采用BLAST进行序列比对,Protparam软件分析2个基因的编码蛋白特性,MEGA 5.0构建进化树。【结果】从‘索格佳娜丽’中克隆了S_(52)-RNase(KF951503)基因,从‘赛买提’中克隆了一个新的S_(53)-RNase(KF975455)基因DNA和c DNA全长序列。S_(52)-RNase的DNA全长2 200 bp,c DNA全长765 bp,ORF(开放阅读框)长681 bp,编码226个氨基酸;S_(53)-RNase的DNA全长1 664 bp,c DNA全长907 bp,ORF长732 bp,编码242个氨基酸。BLASTP比对显示:这2个基因都具有保守的RNase-T2基因结构,属于RNase-T2家族。预测相对分子质量分别为26.5 ku和27.5 ku,等电点为9.36和9.03,都属于亲水性蛋白。进化分析表明,S_(52)与李(Prunus salicina,S_7)、S_(53)与大岛樱(Prunus speciosa,S_(13))亲缘关系最近,S_(52)和S_(53)处在2个不同的分支上,表现出较高的序列多态性,表明2个基因亲缘关系较远。【结论】获得了2个中亚杏品种自交不亲和花柱S-RNase基因全长序列。     

雪花梨及其亲缘品种S基因型的确定

梨是典型的自交不亲和性果树,自然授粉结实率低,品质差。通过确定梨品种S基因型可寻找简便快速克服自交不亲和性,提高产量,改良品质的方法。根据梨S基因的一级结构特点,利用S基因的保守序列设计特异引物,并对雪花梨及其亲缘品种的基因组DNA进行PCR扩增。将基因组特异扩增电泳只显示一条S基因带雪花梨的特异扩增片段回收并与T载体连接,转化至大肠杆菌中。取其中1个阳性克隆进行测序,并通过生物信息学软件分析确定其核苷酸序列,推导出氨基酸序列,经网上Blast比较,确定该雪花梨S基因片段的S基因型,然后就该S基因进行酶切系统分析,有针对性地挑取另一个阳性克隆测序分析。另外,通过品种间的亲缘关系并经过酶切检测以分析雪花梨亲缘品种的S基因型,并确定各品种的S基因型分别为:雪花S4S16、冀蜜S1S16、雪青S3S16、雪峰S4S16、雪英S3S16、雪芳S4S16。     

牡丹ACC氧化酶基因cDNA克隆及全序列分析

 以牡丹品种‘洛阳红’（Paeonia suffruticosa 'Luoyang Hong'）花瓣为材料,用CTAB法提取总RNA,根据已报道的ACC氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase,ACO）保守氨基酸序列设计简并引物,通过RT-PCR扩增得到1条821 bp的牡丹ACO基因同源片段。利用该已知中间序列,通过快速扩增cDNA末端技术(Race)及序列拼接,最终得到该基因cDNA全长序列,命名为Ps-ACO1,GenBank登录号为DQ337251。分析结果表明,Ps-ACO1 cDNA全长1 221 bp,包含一个939 bp的开放读码框,5'非翻译区长65 bp,3'非翻译区长117 bp,编码产物为含有312个氨基酸残基的蛋白质。氨基酸序列与烟草、苹果、桃等植物的ACO同源性都达80%以上。     

6个梨品种S基因型鉴定及新基因S_(45)-RNase序列分析

梨是典型的配子体自交不亲和果树,生产上需要配置授粉树才能获得理想的产量。鉴定梨品种的S基因型能够为合理配置授粉树提供理论依据。为鉴定S基因型,设计特异性引物对6个中国原产梨品种的基因组DNA进行扩增,片段回收、克隆、测序。使用生物信息学软件对各序列进行分析,确定6个梨品种S基因型分别为:宝珠S22S42,半斤酥S5S21,张掖长把S19S22,贵德长把S19S22,满顶雪S4S15,水冬瓜S15S45。其中S45为新分离鉴定的梨S-RNase基因,GenBank登录号为:EF643634。S45和梨S26的相似性最高,但高变区有5个氨基酸差异。     

梨20个品种S基因型的鉴定及新S-RNases基因克隆

 为了鉴定我国梨品种和一些野生类型个体的S基因型,应用S-RNase特异PCR扩增、克隆和测序,对其S-RNases基因核苷酸序列进行分析,鉴定了20个梨品种和野生类型个体的S基因型。起源于我国的'奥连'(S_pS₃₂)、'吊蛋'(S_dS_e)、'沙疙瘩'（S₃₆S_d）品种和杏叶梨的一个类型（S₂₂S_c）个体中存在西洋梨的S-RNase基因,证明S-RNase基因分化是在东方梨种群和西方梨种群的各个种形成之前。在秋子梨的'麦梨'、'内蒙古山梨'中发现了2个新S-RNases基因,命名为S₄₀-、S₄₁-RNase（DQ903313、DQ988687）。S₄₀-和S₄₁-RNase基因推导的部分氨基酸序列分别与苹果属S₁₁-和S₆-RNase的同源性为100%和94.4%,这表明S-RNase的存在可能在梨属和苹果属形成之前。     

梨自交不亲和基因克隆及其进化分析

【目的】获得梨S-RNase基因全长序列及其进化、遗传多态性情况。【方法】设计特异性引物扩增梨S42-RNase基因组DNA全长序列,利用RT-PCR结合cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得其cDNA全长序列。构建梨属植物S-RNase基因编码区和高变区(hyper variable region,HV)内含子的系统发育树。【结果】梨S42-RNase基因编码226个氨基酸,包含由27个氨基酸组成的信号肽,由11、11、6、8、7个氨基酸组成的5个保守区以及HV区插入的335 bp内含子序列。系统进化树显示,梨S-RNase基因编码区和HV区内含子的拓扑结构既相似又有差异。编码区Normalized dN-dS结果显示,除了HV区外还有几个区域存在大量的非同义替换,表明对阳性选择具有很高的敏感性。【结论】梨S-RNase基因编码区和HV区内含子的进化存在一定的关联性,除HV区外还存在其他区域参与梨雌蕊与花粉间特异识别。梨S-RNase基因编码区进化动力源自其编码特异识别蛋白的功能,是平衡选择的结果。HV区的内含子序列表现出很高的长度多态性,进化受到负选择的压力。     

梨自交不亲和基因cDNA芯片制备及对部分砂梨品种S基因型的鉴定

利用东方梨中已鉴定的52个S等位基因HV区cDNA序列作为靶基因序列设计探针,制备梨S基因cDNA检测芯片,每张芯片上含有240个位点55个cDNA探针,包含所有序列完善的S基因HV区特异的cDNA序列。以被检测品种雌蕊cDNA为模板,采用Cy3荧光修饰引物经S基因特异PCR扩增标记被检测品种的cDNA序列,并与芯片杂交以检测不同品种的S基因型。结果表明：利用cDNA检测芯片与‘丽江黄酸梨’、‘秀玉’、‘弥渡玉梨’、‘白面梨’和‘德胜香’等已知S基因型品种杂交,杂交结果显示与S基因寡核苷酸芯片检测信号一致,与各品种已知S基因型相符合。利用cDNA芯片和进一步完善的S基因寡核苷酸芯片并行检测鉴定了‘文山红梨’等24个未知S基因型的砂梨品种,获得各品种的S基因型。梨S基因cDNA芯片的构建进一步完善了梨S基因检测平台。     

利用基因芯片鉴定梨品种自交不亲和基因型

根据东方梨中已鉴定的46个S基因序列和S基因的结构特点,设计了86条寡核苷酸探针并制备成S基因寡核苷酸检测芯片,采用Cy3荧光修饰引物标记被检测品种的PCR产物并与芯片杂交,以检测不同品种的S基因型。结果表明：利用芯片与华梨2号、秀玉和德胜香等已知S基因型的品种杂交,杂交信号显示与各品种已知基因型相符合。利用芯片鉴定了丽江黄酸梨等27个未知S基因型的梨品种,获得了各品种的S基因型,随机选取部分品种进行DNA测序和序列分析,结果与芯片杂交结果完全一致,证明利用S基因寡核苷酸芯片鉴定梨品种S基因型结果准确可靠。     

梨自交不亲和新基因S35-RNase的克隆与表达分析

  通过RACE技术, 从早酥梨花柱中分离到一个长度为681 bp的自交不亲和基因, DNA序列分析表明, 其开放读码框由227个氨基酸组成, 具有S2RN ase基因特有的保守组氨酸和半胱氨酸残基、高变区和保守区等特征序列, 与己登录的S₄-RNase基因DNA序列同源性最高, 达94% , 登录为一个新基因:S₃₅-RNase, GenBank接收号为DQ224344。通过Northern杂交, 发现该基因只在花柱中特异性表达, 并且在大铃铛期的表达量比花前和花后3 d的表达量都高。     

梨S基因芯片的试制及分子杂交条件的优化

 为研究寡核苷酸芯片在确定梨品种S基因型中的应用价值,根据梨自交不亲和基因的结构特点设计了部分S基因的检测探针,并制成寡核苷酸芯片;采用引物Cy3荧光标记法标记检测样品的PCR产物并进行杂交,以检测不同样品的S基因型。结果表明：通过对不同杂交温度、杂交时间等的探索获得了较好的反应条件并用制备的芯片检测了已知S基因型的梨样品,检测结果与各品种的已知基因型相符。证明寡核苷酸芯片检测梨品种的S基因型是一种切实可行的检测方法,若对芯片进一步完善,则今后在梨的自交不亲和性状的机理研究及梨自交不亲和性状的利用等方面将有着广阔的应用前景。     

‘鸭梨’芽变‘闫庄梨’自交亲和性分子机制初步研究

 通过‘鸭梨’（S₂₁S₃₄）及其芽变‘闫庄梨’自花授粉和相互授粉结实率和种子数调查发现,‘鸭梨’自花授粉结实率为9.1%,果实平均种子数为0,表现自交不亲和性;‘闫庄梨’自花授粉结实率为56.9%,果实平均种子数为8.64,表现自交亲和性;以‘闫庄梨’为母本,‘鸭梨’为父本,授粉结实率为39.3%,果实平均种子数为3.36,也表现亲和性,而以‘鸭梨’为母本,‘闫庄梨’为父本,授粉结实率仅为2.0%,果实平均种子数为0粒,表现不亲和性。因此,初步推断‘闫庄梨’自交亲和性可能是由于花柱突变所致。利用S₂₁和S₃₄等位基因特异性引物对‘闫庄梨’自交后代S-RNase基因型进行鉴定,结果发现S₂₁在所有后代中均有扩增条带,进一步证明‘闫庄梨’花柱S₂₁等位基因及其编码产物可能发生了突变。蛋白质印迹杂交分析结果表明,‘闫庄梨’花柱S-RNase缺失了一条带,而没有缺失的条带蛋白含量也比‘鸭梨’低。由此初步证明‘闫庄梨’的自交亲和性可能是由于花柱S-RNase的突变和表达量低所致。     

扁桃SLF基因和S-RNase基因的克隆及表达分析

 以扁桃‘Pioneer’品种为材料, 利用RT-PCR及RACE技术, 克隆了1个新的SLF ( S LocusF-box ) 基因(PdSLF1) 和两个新的S-RNase基因( PdSm 和PdSn) 的cDNA。PdSLF1全长1 331 bp, 编码376个氨基酸; PdSm 全长826 bp, 编码228个氨基酸; PdSn基因全长878 bp, 编码227个氨基酸。与公共数据库中的序列进行相似性比较, 发现这3个基因所编码的氨基酸序列与其它蔷薇科植物相应基因的氨基酸序列均具有较高的一致性, PdSLF1为70.2% ～84.8% , S-RNase为59% ～83.9%。PdSLF1基因在花药中专一性表达, 而PdSm 和PdSn基因在雌蕊中专一性表达。