小RNA生物合成途径主要元件调控稻瘟病菌生长发育和致病性

为探究小RNA生物合成途径主要蛋白在稻瘟病菌Magnaporthe oryzae生长发育、胁迫响应和致病过程中的作用,在野生型菌株Guy11背景下,分别构建其单基因敲除突变体ΔMoago3、ΔModcl2、ΔMordrp2和双基因敲除突变体ΔMoago3ΔModcl2、ΔMoago3ΔMordrp2、ΔModcl2ΔMordrp2,并测定不同突变体的营养生长、产孢过程、对不同胁迫的响应、致病性及侵染菌丝类型。结果显示,仅双基因敲除突变体ΔMoago3ΔModcl2和ΔMoago3ΔMordrp2的菌落直径较野生型菌株Guy11显著减少;突变体ΔModcl2和ΔModcl2ΔMordrp2的产孢量分别显著下降至野生型菌株Guy11和突变体ΔMordrp2的66.67%;十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate,SDS）、NaCl、山梨醇和H2O2胁迫对各突变体的抑制率影响不显著,但在刚果红胁迫下,突变体ΔMoago3、ΔMordrp2和ΔMoago3ΔModcl2的抑制率均显著高于野生型菌株Guy11的抑制率;与野生型菌株Guy11相比,突变体ΔMoago3、ΔModc...     

禾谷镰孢染色质缩合调节因子FgRCC1的功能分析

小麦赤霉病是影响小麦产量与粮食安全的重大真菌病害之一,其主要致病菌为禾谷镰孢(Fusarium graminearum)。染色质缩合调节因子(RCC1)作为一种核蛋白,能促进Ran结合的GDP/GTP转换,在染色质缩合起始、核质转运和有丝分裂过程中起关键作用,但其在丝状真菌中的功能尚未见报道。本研究通过基因敲除的方法,获得了禾谷镰孢中基因FgRCC1的敲除突变体ΔFgRCC1和互补菌株ΔFgRCC1-C。通过表型测定分析,发现敲除突变体ΔFgRCC1的生长速率较野生型菌株PH-1和ΔFgRCC1-C降低约8.5%,且菌丝分枝变多。敲除突变体ΔFgRCC1的分生孢子产量降低约8.8%,并且隔膜数在4和5个的分生孢子比例明显增多。此外,敲除突变体ΔFgRCC1对杀菌剂戊唑醇变得敏感,而对多菌灵、刚果红、SDS、KCl、CaCl₂、MgCl₂的抗性增强。致病性测定发现,ΔFgRCC1在小麦上的致病力下降,并且其体内毒素体形成受阻,DON毒素生物合成显著减少,7种TRIs转录水平显著降低。研究结果表明,染色质缩合调节因子FgRCC1在禾谷镰孢菌丝生长...     

基于原生质体转化的甘蔗梢腐病菌YN41基因敲除体系的构建

基因敲除技术日益成为基因功能研究的重要手段,为了深入研究甘蔗梢腐病菌致病基因的功能,构建了梢腐病菌YN41菌株的基因敲除体系。本研究构建了基于线性DNA的同源重组基因敲除技术,融合PCR构建敲除盒即带有潮霉素基因标记的线性DNA融合片段,配置0.05 g·mL^-1溶壁酶+0.01 g·mL^-1崩溃酶的复合酶液28℃酶解3 h获得了高产量的原生质体,利用聚乙二醇(PEG)介导的原生质体的转化,PCR鉴定技术和酶切鉴定技术对转化子进行鉴定,荧光定量PCR分析和Southern Blot方法进一步对基因缺失突变体进行验证,生物学表型(菌落形态、生长速率、产孢量、生物量和致病力)验证了PK基因敲除体系的成功构建。28℃酶解3 h获得了2×10⁷个·mL^-1原生质体;对编码丙酮酸激酶的PK基因进行了基因敲除验证,获得了纯合敲除突变体;荧光定量PCR检测转录水平无表达;Southern Blot结果显示使用PK基因探针杂交,基因缺失突变体无条带,野生型杂交到目的条带;生物学表型验证了PK基因敲除突变体对比野生型...     

FpStuA参与假禾谷镰孢的产孢和致病性

 假禾谷镰孢是一种土传真菌,其引起的小麦茎基腐病已成为威胁我国小麦生产的重要病害。APSES蛋白是真菌中保守存在的一类转录因子,参与多种细胞生理过程。本研究,我们在假禾谷镰孢中鉴定到StuA同源蛋白FpStuA。qRT-PCR分析发现FpStuA在假禾谷镰孢分生孢子和侵染阶段诱导表达。通过PEG介导的原生质体转化方法获得3个FpStuA基因缺失的突变体。与假禾谷镰孢野生型菌株相比,Δfpstua突变体的生长速度明显减慢,气生菌丝减少;分生孢子的产生比野生型减少70%,且Δfpstua突变体分生孢子变短、分隔减少;Δfpstua突变体对大麦叶片、小麦胚芽鞘和小麦根的致病性均显著降低,脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)合成明显减少。综上结果,转录因子FpStuA对假禾谷镰孢的生长、产孢和致病性都非常重要。     

液泡氨肽酶Y编码基因 PoAPE3在稻瘟病菌中的生物学功能研究

氨肽酶是一类可以选择性剪切氨基酸残基的蛋白酶, 液泡氨肽酶Y能够调控碱性氨基酸残基的剪切以及液泡的活性。本研究通过同源性比对获得酵母液泡氨肽酶Y在稻瘟病菌中的同源基因PoAPE3, 利用基因敲除法获得 PoAPE3基因敲除突变体(ΔPoAPE3), 并构建回补体菌株进行生物学功能分析。表型测定结果表明, PoAPE3基因敲除突变体在产孢量、孢子萌发率、致病性、侵染过程等方面与野生型均无明显差异。突变体在完全培养基(CM)和稻秆培养基(SDC)上生长速率下降, 且在应对胁迫剂H2O2时表现为更耐受, 应对刚果红时表现为更敏感。以上结果表明PoAPE3参与调控稻瘟病菌的营养生长和对外界环境胁迫的应答过程。     

ABC转运蛋白BcAtm1参与灰葡萄孢分生孢子萌发及对寄主植物的侵染

 灰葡萄孢 (Botrytis cinerea)引起的灰霉病可在200多种植物上发生,每年造成全世界高达近千亿美元的损失。Atm1是一种在真核生物中进化保守的线粒体内膜ABC转运蛋白,主要通过向细胞质转运Fe/S簇参与维持细胞的正常生命活动,但Atm1在病原菌致病过程中的作用至今仍不清楚。本研究筛选到一株灰葡萄孢ATM1被T-DNA标记的致病缺陷突变体,并在野生型中对该基因实施了敲除。表型分析发现,突变体ΔBcatm1的分生孢子萌发缓慢且不同步,培养4 h的萌发率只有10%(野生型超过90%),直到12 h,萌发率才接近90%;突变体菌丝生长速度减慢,只能达到野生型水平的67%;菜豆成熟叶片离体接种实验显示,突变体ΔBcatm1基本丧失了致病能力,侵入寄主后只能在接种点附近引发微小的病斑,病斑面积只能达到野生型的10%左右。将完整的BcATM1基因重新导入突变体ΔBcatm1可以完全或部分恢复上述异常表型。本研究结果表明BcATM1是一个关键的致病相关基因,参与了灰葡萄孢分生孢子的萌发、菌丝生长及侵染寄主等过程。     

禾谷镰孢半胱天冬氨酸酶FgCas4的生物学功能

半胱天冬氨酸酶(caspase)在哺乳动物中参与调控细胞凋亡过程,控制着多种疾病的发生发展。本研究利用基因敲除和回补的方法,获得了禾谷镰孢中半胱天冬氨酸酶基因FgCas4的敲除突变体ΔFgCas4和回补体ΔFgCas4-C。通过观察分析发现,基因FgCas4的缺失并不影响禾谷镰孢(Fusarium graminearum)的生长速率、菌落形态、分生孢子产量、致病和产毒。但是,敲除突变体ΔFgCas4的菌丝分支变多且具有3个隔膜的分生孢子比例较野生型和回补体增加了8.7%。对外界环境胁迫因子耐受性测定显示,ΔFgCas4对杀菌剂和金属离子的敏感性显著增加,同时其细胞内脂滴含量增多,对渗透胁迫因子抗性变强。亚细胞定位发现,半胱天冬氨酸酶FgCas4定位于液泡中。此外,基因FgCas4的缺失导致F.graminearum细胞自噬过程明显提前。上述研究结果表明,F.graminearum中半胱天冬氨酸酶FgCas4主要在菌体无性繁殖、对不同环境胁迫的应答以及细胞自噬过程中发挥重要作用。     

亚甲基四氢叶酸还原酶参与调控稻瘟病菌的生长、发育和致病性

 稻瘟病菌(Magnaporth oryzae)引起的稻瘟病是水稻上一种毁灭性病害,每年给全球水稻生产造成10%～30%的产量损失,严重威胁着全球的粮食生产安全。从分子水平探究该病菌的致病机制,对于挖掘潜在的控制稻瘟病的药剂靶标具有重要的理论和实践意义。本研究在稻瘟病菌中鉴定到2个分别与酿酒酵母亚甲基四氢叶酸还原酶Met12和Met13同源的蛋白,命名为MoMet12和MoMet13。MoMet12和MoMet13分别含有690和631个氨基酸,两者的一致性为32%。对这2个蛋白编码基因分别进行敲除突变,发现ΔMomet12和ΔMomet13突变体在CM营养丰富培养基上生长减慢、气生菌丝减少。ΔMomet13在MM基本培养基上不能生长,在SDC和OM营养饥饿培养基上生长显著减慢,气生菌丝稀薄。ΔMomet12在MM、SDC和OM培养基上生长均显著减慢;对突变体进行产孢和致病性测定发现,ΔMomet13突变体在CM和SDC培养基上均丧失了产孢能力,而ΔMomet12在CM培养基上产孢量显著下降,在SDC上产孢能力丧失;ΔMomet13突变体侵染菌丝扩展和致病力显著下降,ΔMomet12突变体致病力与野生型比较无明显变化。加入外源的甲硫氨酸可恢复ΔMomet12和ΔMomet13突变体在不同培养基上的生长和产孢缺陷,且能部分恢复ΔMomet13突变体的致病能力。上述结果表明,MoMet12和MoMet13通过参与甲硫氨酸的生物合成,从而控制稻瘟病菌的生长和无性繁殖。MoMet13同时是一个重要的致病相关因子,参与病菌侵染菌丝的生长和致病过程。     

产酶溶杆菌OH11菌株胞外酶调控相关基因ctp的克隆及功能的初步分析

利用mariner转座子对产酶溶杆菌Lysobacter enzymogenes OH11进行转座诱变,构建菌株OH11的突变体文库.筛选到1株4种胞外酶(蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶)产生均减少的突变株D-11.通过亚克隆,鉴定转座子的插入位点,涉及1个羧基末端蛋白酶(carboxy-terminal protease)编码基因ctp.通过同源重组的方法对该基因进行敲除,对缺失突变体Δctp表型分析发现:(1)Δctp与野生型OH11在营养丰富型(2YT)与营养缺陷型(MMX)培养基中生长速率基本一致;(2)Δctp降低了蛋白酶、纤维素酶和β-1,3-葡聚糖酶的产生,但不影响几丁质酶的产生;(3)Δctp生物膜的产生量明显减少.研究还表明,突变体基本不改变其对油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum、水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani和辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici的拮抗能力.互补菌株均恢复了野生型的相关功能.     

玉蜀黍平脐蠕孢聚酮合酶基因BmPKS18的功能分析

玉蜀黍平脐蠕孢(Bipolaris maydis)引起的玉米小斑病严重影响了玉米的产量与质量。聚酮合酶参与调控多种毒素和黑色素的合成，在植物病原真菌生长发育和致病性方面发挥重要作用。解析聚酮合酶基因在B.maydis中的作用，对玉米小斑病防治具有重要指导意义。本研究通过基因敲除与回补的方法获得了聚酮合酶基因BmPKS18敲除突变体和回补菌株。与野生型和回补菌株相比，突变体ΔBmPKS18产生白化菌落，菌丝生长速率、产孢量和孢子萌发率显著降低，分生孢子无色且长度增加，有性生殖能力存在缺陷，致病力明显减弱。结果表明，BmPKS18基因在玉蜀黍平脐蠕孢营养生长、有性和无性生殖、致病性等方面具有重要调控作用，研究结果为深入解析玉蜀黍平脐蠕孢致病机制提供重要依据。     

香蕉细菌性软腐病菌tus基因对细菌生物被膜形成的影响

为解析硫转运蛋白(tRNA 2-thiouridine synthesizing protein,tus)基因对香蕉细菌性软腐病病原细菌——玉米迪基氏菌Dickeya zeae生物被膜形成的影响，采用同源重组方法构建6株tus基因的缺失突变体及回补菌株，分析代表性突变体的转录组差异，并测定不同突变体的运动能力、细胞壁降解酶分泌水平以及对烟草的致敏性和对寄主的毒力，解析突变体生物被膜表型发生变异的原因。结果显示，玉米迪基氏菌的6株tus基因缺失突变体ΔtusA、ΔtusB、ΔtusC、ΔtusD、ΔtusE和ΔmnmA均表现出生物被膜表型缺陷；ΔtusC突变体转录组比较分析表明，细菌生物被膜形成和运动性相关基因均属于细胞进程中的显著下调表达基因，且前者主要为Ⅵ型分泌系统(type VI secretion system,T6SS)基因，进一步分析发现3个位点的T6SS基因均出现显著下调表达趋势；6株tus基因缺失突变体的运动能力显著减弱，但是细胞壁降解酶分泌水平和对烟草的致敏性并未发生显著变化；接种野生型菌株和基因回补菌株后香蕉的病情指数为42.5～67.5，而接种突变体后香蕉的病情指数...     

苦瓜枯萎病菌Ⅱ型卤酸脱卤酶基因FoHAD-type Ⅱ功能分析

苦瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌苦瓜专化型(Fusarium oxysporum f. sp.momordicae Sun&Huang)侵染引起的一种严重制约苦瓜安全生产的土传病害。明确苦瓜枯萎病菌的致病机理对苦瓜枯萎病的防治具有重要的指导意义,但目前苦瓜枯萎病菌的致病机理尚不明确。前期分析苦瓜枯萎病菌强致病力菌株SD-1和弱致病力菌株SD-V(携带真菌病毒)转录组差异表达基因时,发现Ⅱ型卤酸脱卤酶(FoHAD-typeⅡ)基因在SD-V菌株中表达量显著下调,推测该基因与苦瓜枯萎病菌的致病性相关。本研究根据同源重组的原理,利用分割标记法(Split-Marker PCR)获得了FoHAD-typeⅡ基因的融合片段,分别通过PEG介导的原生质体转化和农杆菌介导的遗传转化获得该基因的敲除突变体和回补突变体,并对敲除和回补突变体的生物学特性和致病力进行了分析。结果表明,敲除突变体的生长速率和产孢量与野生型菌株相比没有显著差异,菌丝尖端形态和孢子形态也无明显差异,但气生菌丝减少,对渗透胁迫耐受性降低,致病力显著下降;回补突变体的生物学性状和致病力与野生型菌株一致。表明FoHAD-typeⅡ基因...     

甘蔗梢腐病病原菌Fusarium sacchari Nep1-like蛋白的筛选鉴定及功能分析

 甘蔗镰孢菌Fusarium sacchari(F. sacchari)引起的甘蔗梢腐病严重影响了甘蔗的产量和质量。解析病原菌的致病机理,对指导甘蔗抗病育种和绿色防控具有重要意义。研究发现NLPs (Nep1-like proteins)类基因在真菌侵染及定殖过程中发挥重要作用。本实验在对梢腐病病原菌基因组测序(尚未公布)基础上,通过BLASTP分析得到甘蔗梢腐病病原菌F. sacchari中4个NLP家族基因Fs_00548、Fs_03159、Fs_06646、Fs_11062。将克隆到的3个基因(Fs_00548、Fs_03159、Fs_11062;Fs_06646未克隆到)构建至PVX载体,利用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达系统,发现只有Fs_00548可以诱导细胞产生与Bax相似的坏死,Fs_03159和Fs_11062则不能。利用酵母信号肽分泌功能验证方法,发现Fs_00548和Fs_03159的信号肽具有分泌活性。并且Fs_00548的信号肽区域对其发挥功能具有重要作用。qRT-PCR结果显示该基因在侵染过程中均有表达,其中72 h表达量最高,是菌丝中该基因表达量的48倍。以上研究结果表明,Fs_00548在病原菌侵染过程中发挥重要作用,研究结果为进一步探究病原菌与甘蔗互作提供参考。     

十字花科黑腐病菌IV型分泌系统的诱导表达与抗逆功能分析

 细菌通过IV型分泌系统(Type IV Secretion System, T4SS)的接合系统、效应物转运系统和释放/吸收系统3个子家族进行DNA、蛋白质及毒素的分泌和转运。十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc)是一种重要的植物病原菌,也是研究植物病原细菌与植物相互作用机理的模式细菌之一。本研究通过检测Xcc 8004野生型菌株和T4SS突变体在不同条件下的生长、诱导情况及对过敏反应的影响发现:T4SS不影响在培养基中的生长,与野生型菌株相比,T4SS突变体在非寄主辣椒ECW-10R上的过敏反应减弱;T4SS相关基因受基本培养基MMX诱导表达,且与Ni²⁺、H₂O₂、Phenol等抗逆相关。推测T4SS相关基因在该病原菌的接触、识别阶段起作用。     

FgLEU1在禾谷镰刀菌亮氨酸生物合成及产毒致病中起关键作用

为挖掘新型药剂的潜在靶标,利用靶向基因敲除和互补技术研究赤霉病病原菌禾谷镰刀菌Fusarium graminearum中必需氨基酸亮氨酸合成酶编码基因FgLEU1的功能,并测定禾谷镰刀菌的生物学表型。结果表明,FgLEU1编码亮氨酸合成途径中的3-异丙基苹果酸脱水酶,其敲除突变体表现亮氨酸营养缺陷。生物学表型测定结果显示,与野生型菌株相比,FgLEU1敲除突变体的产孢量和孢子萌发率显著下降,产孢量仅为野生型菌株的20.96%,培养4 h后孢子萌发率下降了49.45%,且合成脱氧雪腐镰刀烯醇（呕吐毒素）能力丧失,在麦穗上的致病力下降,仅能侵染接种小穗,赤霉病症状不能扩展。外源添加一定量的亮氨酸、FgLeu1催化产物或导入含启动子的全长FgLEU1基因可以恢复敲除突变体表型缺陷。表明FgLEU1基因在禾谷镰刀菌亮氨酸合成、菌丝孢子形成及产毒致病过程中发挥着重要作用,可作为新型安全杀菌剂的潜在研发靶标,用于持续有效控制麦类赤霉病和镰刀菌毒素。     

茎基腐亚洲镰孢菌侵染抗感小麦品种的组织病理学观察

小麦茎基腐是由多种镰孢菌侵染的世界性土传病害,亚洲镰孢菌(Fusarium asiaticum)是我国冬小麦主产区茎基腐镰孢菌的优势种群,对小麦生产造成巨大损失。本研究利用绿色荧光蛋白报告基因标记亚洲镰孢菌,研究其侵染抗感小麦的病理组织学过程,建立了茎基腐病菌与寄主互作的直观性的研究体系,对病害防治及抗病育种具有重要意义。基于PEG-CaCl_2介导原生质体转化法将gfp导入亚洲镰孢菌株CF0915,对转化子进行荧光表达、PCR验证、遗传稳定性、生长特性及致病力分析,选取与野生型表现相近的转化子进行侵染分析。结果表明,绿色荧光蛋白基因(gfp)与潮霉素基因(hyg)PCR扩增表明gfp已整合入真菌基因组中,转化子菌丝与分生孢子表现强烈绿色荧光信号,gfp能够在转化子中稳定遗传,菌落形态、生长速度及致病力与野生型菌株无显著差异;将gfp标记病菌分生孢子接种感病品种1 d后,大量孢子附着于根毛及根表皮细胞开始萌发,接种2 d后观察到抗性品种分生孢子萌发;感病品种接种3 d后,菌丝直接侵入表皮细胞或沿表皮细胞间层定殖生长,扩展至皮层组织,8 d后菌丝从根部迅速扩展至茎基部,至第10 d大量菌丝充塞根皮层细胞,叶鞘维管束也被菌丝侵染,并产生大量大型分生孢子,植株表现褐色病斑,14 d后根部及茎维管束被大量菌丝体填充,而后产生大量厚垣孢子,至25 d大部分感病品种幼苗萎蔫死亡;与感病品种相比,抗性品种在整个侵染过程中表现时间滞后。本研究对引起茎基腐病的亚洲镰孢菌侵染小麦的组织学过程观察,为病菌致病机理的阐释及抗病资源的利用提供了重要理论依据。     

胶孢炭疽菌G蛋白信号调控因子CgRGS3的生物学功能

G蛋白信号调控因子(regulators of G-protein signaling,RGS)是G蛋白的一类负调控因子,在植物病原真菌生长发育及致病过程中起着重要作用。为探究胶孢炭疽病菌1个RGS基因CgRGS3的生物学功能,利用PCR技术扩增CgRGS3基因并进行生物信息学分析,通过同源重组的方法获得该基因的敲除突变体,并在突变体的基础上获得互补株,通过表型分析确定CgRGS3的生物学功能。结果表明:CgRGS3编码1个含有367个氨基酸的蛋白,包含1个RGS功能域和3个跨膜区域,表型分析发现与野生型菌株相比,敲除突变体营养生长缓慢,分生孢子产量附着胞形成率显著降低,对Cu~(2+)、Fe~(2+)、Zn~(2+)离子更加敏感,细胞壁完整性发生改变,黑色素产量降低及致病力减弱等。由此可见,CgRGS3参与调控胶孢炭疽菌的营养生长,分生孢子产生及附着胞的分化、细胞壁完整性、黑色素产生及致病性等。     

禾谷镰刀菌中磷脂酰肌醇转运蛋白功能分析

磷脂酰肌醇转运蛋白(phosphatidylinositol transfer protein,PITP)保守存在于真核生物中,负责膜系统中磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱的转运,参与胞内的脂类信号调控过程。由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的小麦赤霉病严重威胁粮食产量和食品安全,而在禾谷镰刀菌的研究中发现磷脂信号网络中的关键元件参与病原菌致病过程的调控。我们利用基因敲除的方法对禾谷镰刀菌中PITP家族的功能进行分析,在禾谷镰刀菌中鉴定了7个PITP蛋白的编码基因,并成功获得了其单敲除突变体。通过表型分析发现,这7个基因的单敲除突变体在营养生长、无性及有性生殖和致病性方面与野生型菌株并无明显差异。研究结果表明:1)禾谷镰刀菌中的PITP基因并不是看家基因;2)不同PITP基因之间可能存在功能冗余;3)丝状真菌中PITP的生理功能与酵母中的PITP存在显著差异。     

苹果树腐烂病菌异柠檬酸裂解酶基因VmICL的功能分析

由黑腐皮壳菌(Valsa mali Miyabe et Yamada)引起的苹果树腐烂病严重影响了苹果树的健康生长。异柠檬酸裂解酶是真菌乙醛酸循环中的关键酶,异柠檬酸裂解酶基因(ICL)在真菌生长发育及致病过程中发挥重要作用。本研究在苹果树腐烂病菌基因VmICL生物信息学分析的基础上,应用PEG介导原生质体转化法获得了基因VmICL的敲除突变体及回补菌株,解析了VmICL对病菌生长发育、细胞壁完整性、渗透胁迫、碳氮源利用及致病力的影响。研究表明,基因VmICL位于9号染色体,VmICL蛋白在第23-545位氨基酸区域具TIM super family结构域,系统发育分析显示与水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)亲缘关系最近。基因VmICL缺失突变体生长速率减慢,分生孢子器产生数量减少,分生孢子萌发延迟;基因VmICL参与维持细胞壁的完整性,但不参与渗透胁迫;基因VmICL正调控碳源吸收,负调控氮源吸收,正调控致病力。总之,基因VmICL参与调控苹果树腐烂病菌的生长发育、细胞壁完整性的维持、碳氮源利用及致病力的发挥。