梅州地区柑橘黄龙病的常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术研究与应用

本文利用TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测技术对梅州地区疑似柑橘黄龙病样品进行检测,并与常规PCR检测进行对比。结果表明,实时荧光定量PCR用于检测柑橘黄龙病菌结果快速、准确、可靠且无污染。采用2种方法对梯度稀释的阳性样本进行检测发现,实时荧光定量PCR的灵敏度较常规PCR更高,能够检出样品中痕量的病原菌。本研究在梅州地区建立了以实时荧光定量PCR方法进行柑橘黄龙病疑似植株的检测,可以为梅州地区提供更准确、更灵敏、快速的黄龙病检测技术。     

柑橘黄龙病菌及其分子检测研究进展

柑橘黄龙病是世界柑橘生产人毁灭性病害。该文介绍该病的病原认识过程、病害的主要特征及病害的检测方法,包括常规PCR法、巢式PCR法、荧光实时定量PCR法、DNA杂交法、滚环介导的等温扩增(LAMP)法等。     

柑橘黄龙病快速诊断与检测技术研究进展

综述了田间症状诊断、指示植物鉴别、基于淀粉-碘反应的诊断、基于高光谱成像的无损检测、免疫学检测、基于核酸的分子检测等柑橘黄龙病检测技术的优缺点,并指出巢式PCR、定量PCR与LAMP技术等基于核酸的分子检测技术,因其检测灵敏度高,可以对无症样品进行检测,在柑橘黄龙病的早期检测上具有良好的应用前景,同时提出开发一种无需DNA模板制备的柑橘黄龙病LAMP检测技术,将为田间大规模的样品提供快速、准确、高效、低成本、高灵敏度的检测手段,具有重大的应用价值。     

嗜水气单胞菌的检测方法比较

[目的]比较实时荧光定量PCR法、PCR法及细菌培养法检测嗜水气单胞菌的灵敏度与特异性。[方法]在常规PCR法的基础上设计并建立了实时荧光定量PCR法,并采用该法与常规PCR及传统细菌培养法3种方法同时对嗜水气单胞菌进行检测与比较。[结果]实时荧光定量PCR检测的灵敏度可达12.5 cfu/ml,达到了只需13个细菌就可得到阳性结果的灵敏度,具有很高的特异性,且检测速度快,从细菌核酸提取至完成检测仅需3 h左右,比传统细菌培养法和常规PCR法所需时间大大缩短。实时荧光定量PCR检测由于在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染。[结论]实时荧光定量PCR检测是3种方法中最为快速敏感的方法,是一种比较实用的嗜水气单胞菌的检测方法。     

柑桔黄龙病的常规PCR及荧光定量PCR检测

【目的】为柑桔黄龙病的早期诊断和寄主体内病原菌的动态监测提供一种稳定、可靠的检验检疫技术。【方法】利用亚洲韧皮杆菌核糖体蛋白基因rplJ/rplL设计了2对PCR引物CQULA03F/CQULA03R、CQULA04F/CQULA04R和1条TaqMan探针CQULAP1，以此为基础建立了常规PCR和TaqMan探针法、SYBR Green I荧光染料法两种荧光定量PCR（共3种）反应体系；确定了3种体系各自的检测灵敏度、特异性和准确性，据此对3种体系进行了比较；从2004年7月到2005年5月还利用常规PCR和TaqMan探针荧光定量PCR体系完成了对柑桔黄龙病病原菌在寄主体内的周年变化的动态监测。【结果】两种荧光定量PCR方法的灵敏度比常规PCR高出至少2～3个数量级，而TaqMan探针法由于使用了杂交探针，其特异性尤其可靠，另外两种定量PCR较小的产物片段使得它们具有更好的稳定性，加上荧光定量PCR方法本身受污染可能性小、操作简便等固有优势，使得前者更适合于柑桔黄龙病的检测。【结论】本研究建立的2种荧光定量PCR方法可以为柑桔黄龙病的病害早期诊断以及柑桔黄龙病病原菌近缘种的甄别提供准确、灵敏、快速的检验检疫技术。     

柑橘黄龙病病原培养及分子检测技术研究进展

柑橘黄龙病（Huanglongbing）由韧皮部杆菌属细菌（Candidatus Liberobacter sp.）侵染引起,是柑橘生产上的毁灭性病害,当前正在世界柑橘产区迅速蔓延,已成为制约柑橘产业健康发展的关键因素之一。介绍了柑橘黄龙病的症状以及病原的分离培养研究进展,阐述了病原的分子检测技术,包括PCR、双重PCR、实时荧光定量PCR和LAMP快速检测技术,并对病害的防控进行展望。     

利用qPCR技术检测柑橘溃疡病菌的灵敏度分析

以常规PCR为对照,分析了实时荧光定量PCR(q PCR)检测柑橘溃疡病菌DNA和柑橘溃疡病菌菌量的灵敏度,并对接种柑橘溃疡病菌后的冰糖橙样品进行了动态监测。结果显示,q PCR检测柑橘溃疡病菌DNA和柑橘溃疡病菌菌量的灵敏度比常规PCR高1~3个数量级,且常规PCR对柑橘溃疡病菌DNA的检测会受到寄主植物DNA的干扰,q PCR不受寄主植物DNA影响;对接种后冰糖橙样品的分析,q PCR即时就能检测到柑橘溃疡病菌,并能实时观察到柑橘溃疡病菌在寄主叶片的增殖情况,而常规PCR要接种后2 d才能检测到柑橘溃疡病菌。     

香蕉细菌性枯萎病菌荧光 LAMP 检测体系的建立

【目的】基于香蕉细菌性枯萎病病原(Ralstonia solanacearum)2号生理小种的特异保守引物和LAMP技术建立一种实时荧光定性检测方法,解决常规PCR定性检测特异性低、灵敏度低、耗时长等问题,实现在1 h内能进行准确高效的定性检测,为加强该病害防控检测和检疫工作提供技术支持。【方法】确定被测基因靶序列,利用Primer软件设计两对内外引物。由两对引物、具有链置换特性的DNA聚合酶、模板DNA、甜菜碱、Mg_2SO_4、反应缓冲液、荧光染料等组成LAMP反应体系,采用不必在反应完开管盖检测的实时荧光LAMP方法,针对该方法对于样品DNA定性检测的灵敏度、特异性及可重复性进行试验。【结果】设计的引物能顺利扩增目标基因,实时荧光LAMP检测体系对于香蕉细菌性枯萎病病原生理2号小种有良好的灵敏度、特异性,该方法可重复性强,灵敏度比普通PCR高10倍以上。【结论】香蕉细菌性枯萎病菌荧光LAMP检测体系检测特异性强、灵敏度高、耗时短、不易污染,效果较好。     

柑橘黑点病菌(Diaporthe citri)快速分子检测技术

柑橘黑点病是一种严重危害柑橘生产的世界性真菌病害,快速及时地检测出柑橘黑点病病菌(Diaporthe citri)对柑橘黑点病早期诊断和科学防控具有重要的实践意义。本研究基于β-微管蛋白序列,设计柑橘黑点病病菌的特异引物对,基于常规PCR和SYBR Green I实时荧光定量PCR(qRT-PCR)建立了快速分子检测体系,对柑橘黑点病病菌的菌丝和典型带病叶片进行检测验证。结果发现,在常规PCR检测中,该引物可从柑橘黑点病病菌获得244 bp的特异性扩增片段,检测灵敏度达0.78 ng·μL^-1;在实时qRT-PCR中,该引物也只有在柑橘黑点病病菌中获得唯一的产物吸收峰,检测灵敏度达0.35 ng·μL^-1。利用PCR检测体系对发病黑点叶片进行检测,结果显示,常规PCR的阳性检出率为30%,qRT-PCR的阳性检出率为60%,表明qRT-PCR比常规PCR的灵敏度更高。因此,研究设计的柑橘黑点病病菌特异性引物,以及所建立的常规和实时qRT-PCR检测方法具有速度快、特异性强等特点,可以用于柑橘黑点病病菌的分子鉴定,对病害诊断具有参考价值。     

柑橘黄龙病亚洲种RPA快速检测方法的建立

黄龙病是世界柑橘产业的毁灭性病害,引起柑橘黄龙病的病原分为亚洲种、非洲种和美洲种共3个种,目前我国柑橘黄龙病均由亚洲种引起,建立一套快速检测技术对我国柑橘黄龙病的防控具有重要意义.本研究根据柑橘黄龙病亚洲种16S rDNA基因序列设计引物,建立了基于重组酶聚合酶等温扩增(RPA)的检测方法,并评价了该方法的灵敏度和检测准确性.结果表明,本研究所建立的柑橘黄龙病亚洲种RPA快速检测方法特异性强、灵敏度高、操作过程简便,检测灵敏度比常规PCR提高10倍,为基层农技人员开展柑橘黄龙病的快速检测提供了一种新方法.