鞭毛素蛋白FliCxcv对水稻免疫反应的诱导功能鉴定

 为揭示来源于番茄细菌性斑点病菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Xcv)菌株XV18鞭毛素(FliCxcv)作为一种病原相关分子模式(PAMP)诱导水稻免疫反应的功能,本研究对FliCxcv编码基因flicxcv进行了基因克隆、序列分析、原核表达、蛋白纯化和诱导活性测定。结果表明,通过PCR特异性扩增,从Xcv菌株XV18中克隆了1 200 bp的fliCxcv基因片段,其序列与GenBank中己测序菌株的完全一致。在大肠杆菌中对该基因全长、N端和C端截短序列进行了原核表达,并获得了纯化的FliCxcv全长及其截短蛋白。将纯化蛋白浸润接种到水稻品种日本晴叶片组织,发现FliCxcv全长及其截短蛋白均能诱导水稻叶片细胞死亡、H₂O₂产生以及防卫基因(OsPAL和OsPR1b)表达等免疫反应,但诱导活性存在差异。因此,本研究验证了FliCxcv具有激发水稻细胞免疫反应的PAMP功能,为水稻免疫诱导制剂的研发提供了材料。     

柑橘溃疡病菌抗铜相关基因copA和 copB的克隆及原核表达

 以柑橘溃疡病菌DNA为模板,对抗铜相关基因copA和copB进行了PCR扩增和克隆,获得了大小分别为1 782 bp 和1 095 bp的目标片段。构建了这2个基因的原核表达载体 (pET-copA和pET-copB),并在大肠杆菌 [Escherichia coli BL21(DE3)] 中成功诱导表达。利用原核表达的融合蛋白免疫大耳白兔,制备了抗copA和copB原核表达蛋白的多克隆抗体。用间接ELISA法测定了所制备的多克隆抗体的效价均为1∶6 400。用所制备的抗体分别对copA和copB的原核表达产物进行Western blot分析的结果显示,在相应位置产生了较强的免疫反应条带,表明所制备抗体能特异性地与相应的抗原发生免疫反应。     

八字地老虎β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因cDNA序列的克隆及原核表达研究

［目的］ 克隆八字地老虎β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因的cDNA序列并进行原核表达。［方法］ 以八字地老虎预蛹期幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术克隆基因cDNA序列,将cDNA序列编码区连接到原核表达载体pET21b并转化BL21进行原核表达,并使用His tag纯化试剂盒将目的蛋白进行纯化。［结果］ 得到cDNA全长序列,含有2 488个碱基,包括一个1 785个碱基的开放阅读框,编码一个含594个氨基酸的蛋白,分子量为67.8 ku,等电点5.38,该序列登录GenBank并获得登录号FJ848784。诱导表达蛋白经SDS PAGE电泳得到目的蛋白带,纯化结果也获得了目的蛋白带。［结论］获得了一条新的八字地老虎β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因的cDNA序列并对其在原核表达系统中进行了成功表达和纯化。     

棉铃虫类肌钙蛋白基因的克隆、原核表达纯化及其时空表达谱分析

为探索棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)类肌钙蛋白基因HaCal的生理功能及其所编码蛋白的生物特性,采用PCR方法克隆了HaCal的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,借助在线软件对其进行生物信息学分析,通过原核表达技术诱导表达和纯化其编码的蛋白,并通过实时荧光定量PCR技术分析其在棉铃虫不同发育龄期和组织中的表达量。结果显示,HaCal的ORF序列长度为564 bp,编码187个氨基酸,理论分子量为20.52 kD,理论等电点为7.64。其保守结构域与Calponin家族一致,但不含跨膜区和信号肽,系亲水性蛋白。原核表达结果显示,融合蛋白大小与理论值一致,纯化获得了纯度较高的目的蛋白。HaCal在棉铃虫幼虫不同发育阶段和不同组织中均有表达,在6龄幼虫体内表达量最高,是1龄幼虫的2.34倍;在5龄幼虫中肠中表达量最高,是头部的257.14倍。表明棉铃虫类肌钙蛋白基因HaCal可能与棉铃虫的生长发育过程密切相关。     

高粱GRF基因家族鉴定及SbGRF4原核表达分析

为研究高粱生长调控因子(growth-regulating factor,GRF)在高粱生长过程中的功能,采用生物信息学分析方法对高粱GRF基因家族进行鉴定,并以高粱BTx623品种为材料,利用PCR技术扩增获得SbGRF4基因cDNA全长序列,构建pET-28a-SbGRF4重组质粒,采用原核表达技术分别对表达菌株、诱导温度以及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导浓度进行优化,最后用Western blot技术对原核表达的SbGRF4蛋白进行验证。结果表明,在高粱中共鉴定到10个GRF基因SbGRF1～SbGRF10;亚细胞定位预测结果显示均定位于细胞核中;分布于高粱的6条染色体上,所有家族成员均含有QLQ和WRC保守结构域;系统进化结果显示,高粱GRF蛋白分为Class 2、Class 3、Class 4a、Class 4b四个亚家族;相同亚家族各个成员间外显子和内含子的数量差异较小;同一亚家族的高粱GRF蛋白保守基序具有相似性;克隆到的SbGRF4基因c DNA序列全长为1 221 bp,并成功构建pET-28a-SbGRF4融合表达载体;SbGRF4蛋白的最佳表达菌株为大肠杆菌Escherichia coli JM109(DE3)菌株,最佳诱导温度为25℃,最佳IPTG诱导浓度为0.6mmol/L;Western blot验证结果显示原核表达的蛋白为SbGRF4。表明SbGRF4蛋白可在大肠杆菌原核表达系统中表达。     

表达的hrmA蛋白质具有诱导水稻细胞产生防卫反应的活性

 将丁香假单胞菌hrmA基因构建到原核表达载体pET 29中,得到重组载体pET hrmA。将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,获得了以包含体形式存在的融合蛋白。复性的融合蛋白能诱导水稻悬浮细胞的活性氧迸发,处理20min后达到峰值。Northern杂交结果表明hrmA蛋白能显著地诱导PBZ1基因在水稻悬浮细胞中表达,在所观察的时间内PBZ1基因表达丰度随处理时间延长而增加,用hrmA处理水稻植株,诱导了PAL基因的表达。实验结果表明hrmA融合蛋白具有激活水稻细胞防卫反应的活性。     

草莓镶脉病毒ORF Ⅵ基因的原核表达与抗血清制备

为了分析草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus,SVBV）ORF Ⅵ基因的功能,采用原核表达技术获得该基因表达的重组蛋白并制备其抗血清。利用PCR技术扩增得到SVBV中国分离物的ORF Ⅵ基因,将此基因克隆到原核表达载体pET-SUMO上,获得重组质粒pET-SUMO-ORF Ⅵ。转化大肠杆菌BL21（DE3）后,经IPTG诱导与Ni²⁺-NTA亲和柱纯化,获得分子质量约为90 kD的重组蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清,采用间接ELISA和Western blot方法测定抗血清的效价、反应灵敏度以及ORF Ⅵ基因在本氏烟中的瞬时表达。结果显示,间接ELISA法测定抗血清对重组蛋白的效价达1：256 000,Western blot法能够检测到稀释64 000倍的重组蛋白。利用稀释2 000倍的抗血清,仍能够检测出SVBV中国分离物和美国分离物ORF Ⅵ基因在本氏烟中瞬时表达的蛋白。     

香蕉苞片花叶病毒CP基因的原核表达及抗血清制备

本试验成功构建了香蕉苞片花叶病毒(Banana bract mosaic virus,BBrMV)外壳蛋白(coat pro-tein,CP)基因的原核表达载体,并诱导表达了34 kDa的融合蛋白His.CP。对该原核表达蛋白的可溶性分析表明,该融合蛋白以包涵体形式存在。利用组氨酸标签纯化试剂盒对目的蛋白进行了纯化,获得了高纯度的融合蛋白。以纯化的蛋白为抗原免疫健康家兔,成功制备了抗BBrMV CP基因编码蛋白的兔抗血清。Western-blotting结果表明这种抗血清有很强的特异性。血清效价测定的效价在51 200倍以上,对植物材料的合适检测浓度为1:800～1:3 200。     

黄瓜花叶病毒运动蛋白基因及其缺失突变体在大肠杆菌中的表达和表达产物的纯化

 利用CMV Fny株系RNA3全长cDNA克隆,构建了运动蛋白(MP)基因5'端缺失突变体和3'端缺失突变体的原核表达载体。SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,MP基因及其2种缺失突变体均能在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中高效表达。利用分离包含体的方法,提纯了全长的及C端缺失的MP。光密度扫描分析表明,提纯产物的纯度达96.6%。     

甘蔗赤条病菌巢式PCR检测

甘蔗赤条病是由燕麦食酸菌燕麦亚种(Acidovorax avenae subsp.avenae,Aaa)引起的一种世界性甘蔗细菌病害。为建立Aaa快速、灵敏的检测技术,根据该病菌16S~23S核糖体基因及其转录间隔区ITS分别设计2对特异性引物,建立Aaa巢式PCR检测方法。结果表明,建立的巢式PCR方法对Aaa标准菌株、水稻食酸菌A.oryzae具有特异性,可扩增出454 bp目的条带,对近缘种德氏食酸菌A.delafieldii及其它科属的红色雷夫松氏菌Leifsonia rubra和甘蔗宿根矮化病菌L.xyli subsp.xyli未扩增出任何条带。以感染Aaa的甘蔗叶片总DNA、含ITS靶标片段的质粒DNA标准品及Aaa标准菌液为模板,巢式PCR灵敏度最低检测限分别为10 fg/μL、10拷贝/μL和36 CFU/mL,是常规PCR灵敏度的1 000倍。应用巢式PCR和常规PCR对14份有赤条病症状的田间甘蔗叶片样品进行平行检测,阳性检出率分别为100.0%和28.6%,表明巢式PCR比常规PCR检测方法具有更高的灵敏度。本研究建立的巢式PCR方法适合于田间甘蔗赤条病害的分子检测与鉴定。     

Pathogenesis-related gene expression in rice is correlated with developmentally controlled Xa21-mediated resistance against Xanthomonas oryzae pv. oryzae

Disease resistance mediated by the resistance gene Xa21 is developmentally controlled in rice. We examined the relationship between Pathogenesis Related (PR) defense gene expression and Xa21-mediated developmental disease resistance induced by Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo). OsPR1a, OsPR1b, and OsPR1c genes were cloned and their induction was analyzed, in addition to the OsPR10a gene, at the juvenile and adult stages in response to a wildtype Xoo strain that induces a resistance response (incompatible interaction) and an isogenic mutant Xoo strain that does not (compatible interaction). We found that the adult stage leaves are more competent to express these OsPR1 genes and that the Xa21 locus is required for the highest levels of induction.     

褐飞虱与白背飞虱为害诱导水稻防御反应的比较

为探究2种稻飞虱——褐飞虱Nilaparvata lugens(St?l)和白背飞虱Sogatella furcifera(Horváth)诱导的水稻防御反应差异,于室内测定了水稻在分别受褐飞虱或白背飞虱产卵雌成虫为害时,其茉莉酸、水杨酸、乙烯、H_2O_2以及挥发物含量的变化。结果表明,尽管褐飞虱和白背飞虱产卵雌成虫的为害均可以诱导水稻茉莉酸、水杨酸、乙烯和H_2O_2等防御相关信号分子以及一些水稻挥发物含量的增加,但是二者的诱导作用存在差异。水稻在受白背飞虱产卵雌成虫为害时,茉莉酸的含量在3 h时就显著升高,12 h时含量达到最高;而受褐飞虱产卵雌成虫为害时,6 h时茉莉酸含量才显著升高,72 h时含量达最高;并且在2种稻飞虱为害的3～48 h内,白背飞虱为害诱导的茉莉酸含量始终显著高于褐飞虱为害诱导的。水稻受白背飞虱产卵雌成虫为害24 h后诱导的水杨酸含量、为害48 h后诱导的乙烯含量、为害72 h后诱导的H_2O_2含量及为害24 h后诱导的挥发物释放量分别是褐飞虱产卵雌成虫为害诱导的1.28、1.45、4.10和1.77倍。表明水稻能识别褐飞虱和白背飞虱的为害,从而做出针对害虫种类特异性的防御反应;并且水稻对白背飞虱产卵雌成虫为害所做出的防御反应比对褐飞虱的更强烈。     

沉默转录因子OsERF7提高水稻对褐飞虱和白背飞虱的抗性

为了解植物中特有的转录因子乙烯响应因子(ethylene responsive factor,ERF)在植物诱导抗虫反应中的作用,通过克隆1个水稻ERF转录因子基因OsERF7,并结合分子生物学、反向遗传学及生物测定,探究其在水稻防御褐飞虱Nilaparvata lugens和白背飞虱Sogatella furcifera为害过程中的作用。结果显示,机械损伤处理与褐飞虱产卵雌成虫为害均能在中后期诱导OsERF7的表达。沉默OsERF7能显著降低水稻上褐飞虱及白背飞虱卵的孵化率,并延长褐飞虱卵的发育历期;与野生型水稻相比,褐飞虱和白背飞虱在沉默突变体品系R1和R30上的卵孵化率分别只有野生型水稻上的62.5%～68.3%和68.0%～76.0%,褐飞虱卵的发育历期则延长0.37～0.45 d。沉默OsERF7不影响褐飞虱产卵雌成虫为害诱导的水稻防御相关信号分子—茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)、乙烯(ET)和过氧化氢(H_2O_2)的含量。表明转录因子OsERF7作用于防御相关信号途径的下游,并且负调控水稻对褐飞虱和白背飞虱的抗性。     

Functional analysis of the 3′ end of avrBs3/pthA genes from two Xanthomonas species

The phytopathogens Xanthomonas oryzae pathovar (pv.) oryzae and Xanthomonas axonopodis pv. citri each contain several avrBs3/pthA family genes. Structural features of these genes important for avirulence and/or virulence functions include a central region of multiple direct repeats and three nuclear localization signals (NLSs) and an acidic activation domain (AAD) at the 3′ end. To identify other regions critical to function in the 3′ ends of these genes, we constructed several chimeras using apl1 and apl2 from X. axonopodis pv. citri and avrXa10 and avrXa7 from X. oryzae pv. oryzae and evaluated their functions by inoculation to citrus and rice. The apl1 and avrXa7 genes are major virulence determinants in citrus and rice, respectively, while the contributions of apl2 and avrXa10 to virulence are negligible or not measurable. Constructs that contained a 417 bp HincII-SphI fragment from the 3′ end of apl1 in combination with the repeats from avrXa7, avrXa10, and apl1 caused a canker phenotype on citrus. Interchange of the HincII-SphI fragment between avrXa7 and avrXa10 abolishes avrXa7 avirulence function and reduces its virulence but it does not affect avrXa10 avirulence function in rice. avrXa7 caused a hypersensitive response (HR) in citrus and replacement of it's 3′ end with that of apl1 resulted in loss of canker and induction of HR. Thus, the HincII-SphI fragment of the avrBs3/pthA gene family is important for avirulence and virulence functions in two different plant species, Oryza sativa and Citrus natsudaidai HAYATA.     

苹果树腐烂病菌VmMFS1~VmMFS3基因的功能分析

为绿色持久防控苹果树腐烂病,该研究分析苹果树腐烂病菌Valsa mali的3个主要协同转运蛋白超家族（major facilitator superfamily,MFS）编码基因的氨基酸序列特征,利用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR,RT-qPCR）技术分析这3个基因在苹果树腐烂病菌侵染阶段的表达水平,通过构建这3个基因的缺失突变体和回补菌株分析其在病原菌营养生长、致病力和非生物胁迫应答等方面的功能。结果表明,这3个基因的氨基酸序列均具有MFS保守结构域,将其命名为VmMFS1~VmMFS3; VmMFS1和VmMFS2的进化距离较近,均与VmMFS3的进化距离较远;在苹果树腐烂病菌侵染过程中VmMFS1~VmMFS3基因表达均显著上调;与野生型03-8菌株相比,VmMFS1~VmMFS3基因缺失突变体的菌落形态无明显差异,但生长速度下降; VmMFS1~VmMFS3基因缺失突变体的致病力均显著降低; VmMFS1~VmMFS3基因缺失突变体对H₂O₂胁迫的敏感性无明显变化,但对NaCl胁迫更敏感;基因回补后基因缺失突变体的表型缺陷能恢复到野生型菌株的水平。     

三株球孢白僵菌对草地贪夜蛾的毒力比较

为筛选有效防治草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的微生物制剂,采用室内生物测定法测定从北京市、浙江省和海南省土壤样品中分离获得的3株球孢白僵菌Beauveria bassiana菌株bbbj、bbzj和bbhn对草地贪夜蛾3龄幼虫的毒力,并比较这3株菌株的产孢情况和合成白僵菌素的能力。结果显示,分离自北京市的菌株bbbj对草地贪夜蛾3龄幼虫的毒力最强,LC50为3.37×105个孢子/mL;其次为浙江省的菌株bbzj,毒力略逊于菌株bbbj;海南省的菌株bbhn毒力最弱,其在试验最高浓度108个孢子/mL处理7 d后对草地贪夜蛾3龄幼虫的致死率低于50%。菌株bbbj的产孢量远高于另外2株菌株,并且其菌丝结构上着生大量芽生孢子簇,而且菌株bbbj菌体中的白僵菌素含量最高,培养5 d后,分别为菌株bbzj和bbhn的40.08倍和65.85倍。虽然补充白僵菌素可以提高菌株bbhn的毒力,但是草地贪夜蛾幼虫对白僵菌素敏感度不高。表明球孢白僵菌菌株bbbj对草地贪夜蛾幼虫有较高的毒杀活性,具有作为草地贪夜蛾生防菌株的潜力。     

云南省水稻稻瘟病菌无毒基因AVR-Pia变异及水稻抗性基因Pia的有效性

为进一步了解田间稻瘟病菌Magnaporthe oryzae群体中AVR-Pia基因的分布及变异,利用水稻单基因系IRBLa-C水稻品种对自云南省13个市(州)采集分离得到的471株稻瘟病菌菌株进行抗性基因Pia有效性测定;利用无毒基因AVR-Pia特异性标记对471株稻瘟病菌菌株进行PCR检测和测序,并分析稻瘟病菌群体中无毒基因AVR-Pia的分布及DNA结构变异;利用有效性结果和PCR检测结果对471株菌株进行反应型划分,筛选鉴定菌株;利用鉴定菌株对云南省112份地方稻种进行Pia基因鉴定。结果表明,在471株稻瘟病菌菌株中,对含有Pia基因的水稻单基因系IRBLa-C表现为抗病和感病的菌株数分别为139株和332株,所占比例分别为29.5%和70.5%;在471株稻瘟病菌菌株中,分别有244株和227株菌株含有无毒基因AVR-Pia和不含有无毒基因AVR-Pia,所占比例分别为51.8%和48.2%,无毒基因AVR-Pia主要为完全缺失变异;在471株稻瘟病菌菌株中,A-和V+反应型菌株数分别为56株和161株,共217株,占总菌株数的46.1%,在13个市(州)稻瘟病菌群体中,A-和V+反应型菌株所占比例差异较大,其中在普洱市、红河哈尼族彝族自治州、昭通市、玉溪市4个市(州)的比例较大,分别为77.8%、57.1%、52.1%和50.0%;在112份云南省地方稻种质资源中,有20份地方稻品种含有抗性基因Pia,主要分布在9个市(州)中。表明云南省13个市(州)绝大部分水稻产区水稻Pia基因已丧抗性,含Pia基因的水稻种质在云南省分布较广。     

番茄枯萎病菌和青枯病菌拮抗细菌的评价

为筛选出对番茄枯萎病和青枯病有较好防效的生防菌,采用平板对峙法,以番茄枯萎病菌Fusarium oxysporum和番茄青枯病菌Ralstonia solanacearum为靶标菌,从江苏沭阳、宿迁、溧水及内蒙古海拉尔分离到的2 062株细菌菌株中筛选拮抗菌株,并采用平板对峙法、拮抗菌液灌根法、分子生物学方法进行拮抗物质检测、盆栽试验及种属鉴定。结果表明:从2 062株细菌中共筛选到21株对番茄枯萎病和青枯病具有很强拮抗作用的菌株,均能分泌蛋白酶,具有解磷作用;不能分泌几丁质酶和纤维素酶,仅4株细菌能分泌嗜铁素。拮抗细菌SY290对番茄枯萎病和番茄青枯病防效最高,分别达到74.2%和75.0%,SQ728和LS536次之,但防效均大于60%。结合各菌株形态特征、16S r DNA与gyr-B序列分析结果,菌株SY177、SY290和SQ728鉴定为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens,菌株LS536为枯草芽胞杆菌B.subtilis。