转基因水稻标准质粒分子的构建与分析

针对目前转基因(GM)产品检测标准分子的缺乏,构建适用于转基因水稻的标准质粒分子pMDSPS和pMDTheli,其中包含水稻内源基因SPS通用序列,耐盐基因ThST3和Ubiquitin启动子序列的构建特异性Theli序列。对其特异性及制备标准曲线的可靠性进行鉴定研究,研究结果显示,在进行普通PCR扩增时,采用质粒标准分子为阳性对照,均能特异扩增目的条带。以标准质粒分子构建的标准曲线,SPS基因的定量标准曲线的相关系数平均为0.9993,PCR扩增效率在1.0004~1.034之间;ThST3基因的定量标准曲线的相关系数平均为0.9937,PCR扩增效率在0.9358~0.9486之间。因此,构建的标准分子pMDSPS和pMDTheli既能作为普通PCR的阳性对照,也能用于定量标准曲线的构建,为转基因水稻的定量检测提供简便、价格低廉的标准分子打下基础。     

抗旱水稻种子转基因成分检测技术研究

利用组织研磨仪快速处理水稻种子样品,采用高通量的磁珠纯化系统提取样本DNA,提取的核酸通过紫外吸收检测其纯度,应用普通PCR检测方法和实时荧光PCR方法对水稻内源基因SPS、靶基因ATAF1进行检测。结果表明,普通PCR方法和实时荧光PCR方法均表现快速、准确、特异性高的特点。     

转基因水稻品系‘Bt汕优63’微滴式数字PCR定量检测方法的建立

为进一步提升转基因水稻的定量检测效率,推动转基因定量标识制度的实施,对转基因水稻品系‘Bt汕优63’成分进行微滴式数字PCR法定量检测研究。基于转基因水稻品系‘Bt汕优63’的外源插入片段和水稻蔗糖磷酸盐合成酶基因SPS,选择、设计和合成高效特异性的内外源基因引物探针,用于微滴式数字PCR法扩增‘Bt汕优63’的内源基因和品系特异序列。引物探针优化实验表明,SPS60-F/R/P和‘Bt汕优63’品系基因-F/R/P适用于dd PCR双通道法定量检测‘Bt汕优63’成分。准确度验证试验表明,测得值与标准值相近,偏差分别为0.03、0.15、0.15、0.03。测得值的SD介于0.08~0.48之间,RSD介于4.86%~15.10%之间,小于欧盟要求25%,准确度较好。本研究建立的转基因水稻品系‘Bt汕优63’微滴数字PCR定量检测方法简便高效、准确度高,可用于农产品和食品中转基因水稻‘Bt汕优63’成分的定量检测。     

一种快速提取小麦基因组DNA的改良CTAB方法

旨在寻求一种微量、快速提取小麦DNA的方法。以小麦幼叶为材料,用改良CTAB法、改良SDS法、沸水浴法提取小麦叶片总DNA,通过琼脂糖凝胶电泳法、紫外吸收法和PCR检测DNA完整性和纯度。改良CTAB法提取小麦基因组DNA质量和纯度高、无降解,每人每天可以轻松提取200个DNA样品,对转基因植株的PCR检测显示扩增目标条带清晰一致,无假阳性,试验结果理想。改良SDS法所提DNA纯度和浓度虽略不如改良CTAB法,但仍然符合实验要求。沸水浴法提取量少且杂质多,PCR无有效扩增,结果不理想。改良CTAB法提供了一种简便、快速微量小麦DNA提取方法,适用于PCR和其他分子生物学研究。     

几种内生真菌DNA提取方法的比较

通过三种内生真菌DNA提取方法的比较,即CTAB法、SDS法、改良的CTAB法,结果表明三种方法都能得到目的DNA,而且得率都不错,但改良的CTAB法效果最好,DNA纯度高且质量也好。用改良的CTAB法所提取的DNA作为模板,进行PCR扩增,得到了清晰的单一的扩增普带,完全可用于酶切、测序等后续实验。     

富含多糖的转基因石斛基因组DNA提取方法(英文)

在石斛兰转基因研究中,需通过PCR和Southern杂交等手段检测外源基因是否转入并整合到转化植株基因组.由于转化石斛植株生长缓慢,且含有多糖,因此从转化植株中提取高质量的基因组DNA以尽快对转基因苗进行分子检测存在较大困难.本研究旨在通过改良现有的DNA提取法(CTAB法或SDS法1,克服转化石斛植株基因组DNA提取中碰到的产量低,纯度不高而导致难以进行PCR或酶切等问题.在本研究所用的3种改良法中,方法Ⅱ能从少量的转化石斛苗中提取出高产量和高纯度的基因组DNA.研究结果表明方法Ⅱ提取的基因组DNA完全适用于转基因石斛的外源基因PCR扩增,限制性酶切和Southern杂交分析.     

植物果实特异性启动子E8基因的克隆

采用高盐低pH值法、分步离心法、SDS法、CTAB法、改良CTAB法提取毛粉802番茄幼苗基因组DNA,其中改良CTAB法提取的DNA效果最好,以此DNA为模板,用特异性引物进行PCR扩增,得到了预期大小的片段,将目的片段回收,克隆进pMD18-T Simple Vector载体,经PCR及酶切检测具有与目标片段长度相符的插入片段,构建的重组pMD18-E8载体经测序结果分析显示,番茄果实特异性E8启动子序列具有高度保守性,与GenBank上发表的E81.1启动子同源性为99.1%,说明成功获得了果实特异性E8启动子基因,为实现外源基因在转基因桃果实中特异性表达做准备。     

黄山木兰叶片基因组DNA提取方法的比较研究

以珍贵渐危植物黄山木兰的嫩叶为材料,利用改良CTAB法、SDS法、高盐低p H法和Bio Teke试剂盒法提取基因组DNA,通过超微量紫外分光光度计检测、琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶消化和EST-SSR引物扩增法系统地检测DNA的质量及得率。结果表明,在DNA纯度和得率方面,改良CTAB法提取的DNA结果最佳,Bio Teke试剂盒法提取的DNA纯度较好但得率较低,SDS法和高盐低p H法提取的DNA有明显的蛋白质杂质、多糖及其他次生代谢物和RNA的污染;酶切消化结果中改良CTAB法和Bio Teke试剂盒法表现良好;EST-SSR引物扩增结果中唯有改良CTAB法提取的DNA扩增目的基因条带数目最多且清晰。综合分析,改良CTAB法是最适合黄山木兰叶片基因组DNA提取的方法。     

转基因河套蜜瓜新品系育种过程的方法及其生态适应性

1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACS)是高等植物中乙烯合成的关键酶.以成熟河套蜜瓜果实的RNA为模板,经反转录和PCR扩增合成和克隆了河套蜜瓜ACS基因cDNA片断(627 bp),将ACS基因cDNA反向构建到植物表达载体pGA643,配制成DNA溶液后用花粉管通道法导入外源基因,对转基因河套蜜瓜的叶片用CTAB法提取总DNA,PCR扩增检测,结果表明某些果实的部分种子已整合外源基因.目前,该转基因新品系正在进行生态适应性研究及"环境释放"和"生产性试验"的安全性评价.     

水稻SSR分析快速提取总DNA法

为满足水稻SSR分析需要大规模DNA样品的要求,以水稻幼苗叶片为材料,采用改良的CTAB法提取水稻基因组DNA.经质量和纯度检测结果显示：改进的方法程序简单,药品用量少,省时省力,且提取DNA的OD260/OD280均在1.8～1.9之间,琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增条带清晰、无污染、无降解.表明该方法适用于SSR分析的水稻基因组DNA的提取,所得DNA的质量和纯度完全满足试验要求.     

纳米磁珠联合PCR检测甘蔗杆状病毒方法的建立和初步应用

本研究通过对DNA提取裂解液的成分和用量以及裂解时间等因素进行系统优化,建立了一种高通量的磁珠法提取甘蔗总DNA,再进行PCR检测甘蔗杆状病毒(SCBV)的方法。采用核酸自动提取仪,应用纳米磁珠提取甘蔗总DNA,经PCR检测甘蔗杆状病毒,并与以试剂盒提取DNA为模板的PCR检测结果进行比较。结果显示,经优化的裂解液成分为EDTA·Na20.08 mol/L、NaCl 0.8 mol/L、SDS 2%和Tris-HCl0.10 mol/L,裂解时间为20 min,可用于纳米磁珠提取甘蔗总DNA进行SCBV检测。所建立的方法通量高、成本低、耗时短,可用于SCBV的批量检测。     

植酸酶基因定性PCR检测方法及阳性质粒分子的构建

植酸酶基因在农业生产中具有很高的应用价值,正被广泛用于农作物的基因工程研究。为了满足转植酸酶基因作物安全监管的需要,通过优化PCR检测条件,建立了植酸酶基因特异性定性PCR检测方法。该方法具有良好的扩增特异性和检测灵敏度,可以满足我国植酸酶转基因作物监管需要。此外,我们将6大作物(小麦、水稻、棉花、大豆、玉米和油菜)的内标准基因和植酸酶基因克隆到同一载体上,构建成了阳性质粒分子pBS Endogenous-phytase。该质粒分子适用于这6大作物中植酸酶基因的筛查检测。本研究为转植酸酶基因作物的安全监管提供了阳性材料和检测方法。     

抗病转基因水稻M12及其产品成分的定性、定量PCR检测方法

通过定性PCR扩增了转基因水稻M12转化体特异性片段和水稻内标基因(sps)片段, 将PCR产物酶切连接后构建到T载体, 得到适于转基因水稻M12品系特异性PCR检测的质粒分子pM12, 建立了事件特异性定性、定量PCR检测方法。定性PCR结果表明, 本方法可特异性检测出M12, 检测限可达100拷贝单倍体水稻基因组; 定量PCR结果表明, M12和sps定量PCR标准曲线R ²为0.998和0.997, 扩增效率为95.3%和108.4%, 重复性分析标准偏差范围为0.043~0.276, 定量极限和检测极限可达100和10拷贝。对转基因含量为1.0%的混合样品定量结果的相对偏差在8.0%以内。本研究建立的方法可用于转基因水稻M12及其加工产品成分的检测。     

转基因甜菜H7-1实时荧光PCR检测方法

运用实时荧光PCR方法对转基因甜菜H7-1外源基因FMV 35 S启动子、E93’终止子、CP 4-EPSPS外源基因和品系特异性进行了检测.建立了快速、准确的转基因甜菜H7-1转基因成分的PCR检测方法.本研究采用的FMV 35 S启动子、E93’终止子、CP 4-EPSPS和品系特异性检测引物探针能有效检测转基因甜菜H7-1中转基因成分,具有特异性,且灵敏度达到0.01％.     

转基因玉米转化体特异性寡核苷酸芯片测试方法的研制

根据7种转基因玉米Bt11、Bt176、Mon810、Mon863、TC1507、GA21和NK603的重组DNA结构,利用Primer premier 5.0引物设计软件分别设计转化体特异性引物,优化PCR反应条件,对引物特异性及灵敏度进行验证。结果表明,所设计引物特异性强,灵敏度达0.1%。在植物基因组与外源基因的连接区域,利用Primer premier 5.0和Oligo 6.0软件分别设计和筛选7种转基因玉米40mer oligo转化体特异性探针,制备转基因玉米的寡核苷酸芯片,并对芯片检测的特异性、重复性及检测灵敏度进行检验。证明所设计探针特异性强,灵敏度达0.01%。与PCR检测方法相比,基因芯片检测法灵敏度高、特异性强,可有效检测及鉴定多种转基因玉米,大大提高检测的准确率和效率。     

转基因玉米CM8101特异性定性PCR检测方法

旨在为转基因安全监管提供技术支撑,本研究建立了转基因玉米CM8101定性检测方法。根据CM8101转基因玉米插入序列信息,于3′端侧翼序列处设计PCR引物。通过扩增体系优化、特异性测试、灵敏度测试、稳定性测试等技术参数的测试建立了转基因玉米CM8101定性检测方法。结果表明:本特异性检测方法各项参数符合相关转基因分子检测标准的要求,具有良好的品系特异性,方法检测灵敏度可达0.1%。CM8101是中国自主研发的具有产业化应用前景的转基因玉米新品系,本方法为品系和其衍生产品的鉴定提供技术手段。     

利用微滴式数字PCR技术分析转基因玉米抗除草剂标记基因EPSP拷贝数

基于微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)平台,以转基因玉米为例,建立了转基因作物(Genetically modified crops,GM crops)外源基因拷贝数分析方法,对待测样品进行了快速鉴定,并从T_0转基因玉米株系中鉴定出多个单拷贝单株。对该方法与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)方法在分析结果的准确性方面进行了比较,从试验数据可以看出,2种检测方法的结果比较一致,单拷贝检测结果高度一致;但是ddPCR试验操作更加简便,试验结果可重复性强,试验数据更加准确可靠。研究表明,ddPCR方法是一种更加便捷、快速和准确的外源基因拷贝数分析新方法,基于其在准确性和灵敏度方面的显著优势,将会在转基因作物的外源基因拷贝数分析中得到广泛的应用。     

5种方法提取真菌基因组DNA作为PCR模板效果的比较

本研究旨在比较CTAB法、改良CTAB法、SDS法、氯化苄法和Chelex-100法提取真菌DNA作为PCR模板的效果,以生长速率、菌落形态差异较大的11个煤污病菌属真菌为研究对象,以核糖体RNA(r RNA)基因中的内转录间隔区(ITS)序列和28S r RNA基因部分序列的扩增率为指标,采用SPSS软件对结果进行方差分析。结果表明,CTAB法和改良CTAB法适用真菌范围最广,分别有7个和9个属真菌的扩增率都大于70%且无显著性差异;氯化苄法和Chelex-100法适用范围居中,分别有6个和8个属真菌的扩增率较高且无显著性差异,扩增率分别大于70%和50%;SDS法适用范围最窄,有6个属真菌的扩增率高于50%且无显著性差异。大多数煤污病菌至少有2种及以上的DNA提取方法能够取得较好的效果,但链丝孢属真菌只有用氯化苄法提取DNA效果最好。采用改良CTAB法结合氯化苄法,能够满足所有供试煤污病菌类群真菌提取基因组DNA用作PCR反应模板的需要。