柑橘黄龙病PCR检测技术研究

以柑橘黄龙病病原亚洲菌系β-操纵子的特异引物fA2/rJ5进行PCR扩增,依据是否有目标DNA片段的产生来检测柑橘黄龙病菌的存在与否。该检测技术,具有快速、简便、灵敏等特点,可用于柑橘黄龙病的早期诊断,对控制该病害的传播具有重要意义。     

柑橘黄龙病常规PCR检测技术研究与初步应用

柑橘黄龙病是世界范围具有毁灭性危害的柑橘细菌性病害,在我国大部分柑橘产区发生,严重制约了我国柑橘产业的发展。本文根据黄龙病病原物亚洲韧皮杆菌核糖体16SrRNA基因设计了1对PCR引物HLBF468/HLBR877,并以此为基础建立了常规PCR反应体系,确定了检测体系的特异性和灵敏度。结果表明该体系的检测灵敏度比先前报道的常规PCR方法有了明显提高。利用建立的PCR体系完成了对广东和广西两省区果园柑橘黄龙病的抽样检测。本研究建立的常规PCR方法可以作为一种简便、准确、灵敏的检测技术应用于柑橘黄龙病的早期诊断。     

柑橘黄龙病田间诊断与检测技术研究进展

目前防控柑橘黄龙病的措施主要包括培育无病毒苗、防治木虱、铲除病树等。而多数防控措施的开展均需灵敏、可靠的早期诊断技术配合。综述了柑橘黄龙病的田间诊断方法以及基于电镜、血清学、高光谱、淀粉显色、常规PCR、巢式PCR、LAMP PCR、定量PCR、数字PCR的检测方法 ,并阐述了各自的优缺点。其中,定量PCR是目前较成熟和具有较高灵敏度的检测技术,可配合其他低成本检测方法对未显症、假阴性等样品进行早期检测;可实现单分子DNA绝对定量分析,数字PCR检测技术在柑橘黄龙病检测中也具有较好的应用前景。     

海南柑橘黄龙病发生分布调查及病原种类鉴定

本研究在海南全省范围进行了柑橘黄龙病的发生分布调查和病原种类鉴定,共采集了14个市县62处柑橘种植点的不同柑橘品种样品1227份。用柑橘黄龙病菌亚洲种和非洲种rpIA-rpIJ基因片段的通用检测引物A2/J5和柑橘黄龙病菌美洲种16S rRNA基因片段的特异检测引物GB1/GB3,对样品进行PCR扩增,发现海南柑橘黄龙病的病原为柑橘黄龙病菌亚洲种,检测样品中阳性率为79.01%,未发现柑橘黄龙病菌非洲种和美洲种。结果发现,柑橘黄龙病已分布在海南的琼中、澄迈、儋州、琼海等8个市县。同时选取海南澄迈、儋州、琼海等4个市县有代表性的甜橙、柚子、柠檬感染黄龙病的样品,扩增样品的rpIA-rpIJ基因A2/J5片段,进行序列比对和系统进化分析。序列比对结果发现,海南各地不同品种中的柑橘黄龙病菌rpIA-rpIJ基因A2/J5片段序列一致性为99.87%,序列十分保守。系统进化分析表明,海南各地不同品种的柑橘黄龙病菌都与黄龙病菌亚洲种聚集为同一进化分枝,与黄龙病菌非洲种和美洲种分属不同的进化分枝。本研究明确了海南柑橘黄龙病的发生分布情况和病原种类,对柑橘黄龙病的防控具有重要的理论意义。     

三种PCR方法检测柑橘黄龙病菌的效果比较

为了比较常规PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR方法在大田检测中对柑橘黄龙病(Huanglongbing, HLB)的检测效果, 首先比较了3种检测方法对柑橘黄龙病菌检测的灵敏度, 结果发现：3种检测方法的灵敏度依次为常规PCR<巢式PCR<实时荧光定量PCR。运用3种检测方法对广东5个柑橘品种上的189个黄龙病疑似病样进行检测, 结果发现：黄龙病检出率依次为常规PCR<巢式PCR<实时荧光定量PCR。研究表明：常规PCR适合以较低成本大规模检测黄龙病; 实时荧光定量PCR具有最大的检测灵敏度; 巢式PCR检测技术同时具有前两者的一些优点, 但操作较复杂, 适合技术熟练的研究者使用。     

基于近红外技术柑橘黄龙病田间快速检测方法研究

柑橘黄龙病在感病植株和健康植株之间传播速度快,因此快速检测柑橘黄龙病对其防治十分关键。本文研究了近红外技术快速检测柑橘黄龙病的方法。采用PLS-LDA建立的模型对未参与建模的样品进行了检测,结果表明,该模型检测的准确率与普通PCR检测的结果符合率达到100%,假阳性率小于1%。该技术具有检测周期短、无污染等优点,可用于田间黄龙病的快速检测。     

海南省柑橘主产区黄龙病和病毒病的发生危害情况调研初报

柑橘是我国南方重要的水果之一,柑橘黄龙病和柑橘病毒病已经对我国柑橘的安全生产造成了严重威胁。为了解柑橘黄龙病和病毒病对海南柑橘产业的危害情况,本研究通过荧光定量PCR(Quantitative PCR)和反转录PCR(RT-PCR)分别对随机采集自海南柑橘主产区澄迈县3个福橙种植园和琼中县4个绿橙种植园共计109个样品进行了柑橘黄龙病和柑橘5种主要病毒病的检测。结果表明:澄迈县福橙标准化种植示范基地和琼中县营根镇绿橙种植园2个新植橘园的柑橘黄龙病发病较轻,检出率仅为8%和11%,而其他5个橘园的柑橘黄龙病检出率均在75%以上,严重的达100%。除此之外,7个橘园均未检测到柑橘褪绿矮缩病毒;澄迈县和琼中县的衰退病毒病检出率分别在52.9%和77.8%以上,黄脉病毒病在83.3%和90%以上。澄迈县还检测到碎叶病毒病的存在,检出率在38.1%以上,除红湖农场外还存在裂皮病毒病,检出率在11.8%以上。琼中县的绿橙种植园3还存在裂皮病毒病,检出率为43.8%。综上所述,柑橘黄龙病和病毒病已经严重威胁到海南省福橙和绿橙主产区的柑橘生产安全。加强对海南柑橘苗木安全生产的同时,亟需采取有效的田间综合防控措施,以促进海南柑橘产业的健康发展。     

柑橘黄龙病症状与“Candidatus Liberibacter asiaticus”PCR检测结果的相关性分析

柑橘黄龙病症状较为复杂,且因寄主品种、生长期、病程等因素而异。利用PCR检测其病原菌"Candidatus Liberibacter spp."是目前柑橘黄龙病诊断的可靠方法之一。分析柑橘黄龙病症状与PCR检测结果的相关性有助于提高黄龙病的田间诊断准确率。本研究结果表明,与PCR检测相比,根据症状诊断柑橘黄龙病具有较高的假阳性率(8.20%)和假阴性率(50%);通过分析1 839个样品的症状与病原PCR检测结果发现,表现为斑驳型黄化、均匀黄化和"绿岛"这3种叶部症状以及"红鼻子果"和畸形果这2种果实症状的PCR病原检出率高;具有斑驳和黄化、黄化和"绿岛"、"绿岛"和花叶等复合症状样品的PCR检测"Ca.L.asiaticus"的阳性率最高;直径小于1 cm的幼果中的"Ca.L.asiaticus"检测稳定性低。这些结果为更准确地通过症状诊断柑橘黄龙病提供了科学依据。     

三种分子检测体系的比较及柑橘果园黄龙病监测

为了评价3种PCR分子检测体系对柑橘黄龙病(citrus huanglongbing,HLB)大田诊断效果,综合比较了常规PCR、巢式PCR和SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR(SG Ⅰ-qPCR)方法对柑橘黄龙病菌检测的灵敏度、特异性和准确度等参数,并用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和巢式PCR监测广西柑橘园疑似HLB样品425个,比较了2种检测体系的阳性检出率。基于CQULA04F/CQULA04R引物对的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR的灵敏度可达10 ag/μL;而巢式PCR灵敏度为100 ag/μL,巢式PCR较常规PCR检测灵敏度高104倍。疑似样品的HLB病原SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和巢式PCR检出率分别为46.6%、40.0%。各检测体系的灵敏性、特异性、符合度依次为SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR>巢式PCR>常规PCR。研究表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR可作为果园大规模HLB早期诊断和监测的首选,而在缺乏定量检测仪器时,巢式PCR也可用于HLB的检测,但需注意避免空气污染导致的假阳性。     

黄龙病菌在柑橘枝条上的分布和多样性分析

 柑橘黄龙病是由“Candidatus Liberibacter asiaticus”(CLas)引起的毁灭性病害,在染病植株的叶片和果实上表现出不同症状。但目前还未见在同一植株或枝条上表现不同症状的叶片或果实中的CLas是否存在多样性的报道。本研究分析来自美国佛罗里达与中国广东两地染病柑橘样品,发现佛罗里达的CLas遗传多样性较低。以3对位于CLas短串联重复位点两端的序列为引物,对广东柑橘黄龙病病株的样品进行PCR扩增和PAGE检测,结果发现:同一植株上的CLas多样性高于同一枝条;同一病枝上显不同症状的叶片和果实中的CLas浓度分布不均匀,但成熟病果中CLas的浓度最高。以同一病枝条为一个组,PCR扩增和PAGE检测53个枝条的样品,发现不同组间CLas多样性不一:3对引物扩增条件下分别有4组(7.55%)、7组(13.21%)和11组(20.75%)样品存在组间多样性,推测同一枝条中含有不同的CLas菌株。以上结果说明了CLas在柑橘枝条上的分布规律,为监测我国CLas的多样性提供了科学依据。     

中国柑橘黄龙病发生情况及防治现状

柑橘黄龙病是世界性的柑橘病害,目前仍严重威胁着我国的柑橘生产.笔者对柑橘黄龙病在我国的分布、发生现状及防治研究进行了总结与概述.     

柑橘黄龙病nested-PCR检测技术在柑橘苗木生产中的应用

柑橘黄龙病(huanglongbing, HLB)是柑橘生产上的一种毁灭性病害。本研究以柑橘叶脉为材料,采用nested-PCR技术对广西部分柑橘苗圃苗木进行了黄龙病检测。结果表明,nested-PCR技术不仅可以检测已经表现症状的苗木样品,还可以检测出带病但不显症的苗木样品。2007年共检测柑橘苗木样品1 950个,2008年共检测样品1 480个,黄龙病苗木检出率分别为10.31％和6.22％。本研究对及早控制带病苗木的传播,繁育柑橘无病毒苗木具有重要的意义。     

江西省大余县柑橘黄龙病菌PCR检测

采用PCR扩增和核苷酸序列测定技术,对分别采自江西省大余县青龙镇郭屋坝果园和丰顺果园的各5份疑似柑橘黄龙病样品进行病原检测。结果表明:2个青龙郭屋坝果园样品中检测到柑橘黄龙病菌,分别命名为DY-LAS01和DY-LAS02,其他8份样品中则未检测到该病菌。此结果表明大余县已有柑橘黄龙病发生,希望引起当地有关部门的高度重视。     

应用多聚酶链式反应(PCR)技术检测和定量分析柑桔黄龙病病原

 应用多聚酶链式反应(PCR)技术对柑桔黄龙病病原进行检测和定量分析。研究结果表明:PCR技术能准确、快速地检测出田间和温室内罹病的柑桔、长春花以及带菌柑桔木虱样本中的柑桔黄龙病病原(BLO),而健康植株和柑桔木虱样本则呈阴性反应。采用的PCR引物(Primers)是根据柑桔黄龙病病原亚洲株系的DNA序列(In-2.6,基因库号码:M9491)设计的。应用竞争性定量多聚酶链式反应(Q-PCR)方法能测定病原在不同样品中的含量。该技术关键在于:病原DNA和浓度系列稀释后的竞争物DNA,在同一试管中进行DNA扩增反应时,共用相同的引物。由于彼此互相竞争反应引物的结果,病原的PCR产物和竞争物的PCR产物在数量上呈反向线性相关。因竞争物的浓度为已知,便可从线性关系中推算出病原的含量。     

柑橘黄龙病菌核酸检测技术研究进展

候选韧皮部杆菌（Candidatus Liberibacter spp.）是一类通过虫媒传播，寄生于韧皮部的革兰氏阴性细菌，引起柑橘上的毁灭性病害——黄龙病（Huanglongbing,HLB）。柑橘感染黄龙病后在3～5年内便会衰亡或丧失结果能力，目前尚无有效防治药剂，果园若不及时在感染初期铲除病树，病害会在柑橘木虱的活动下迅速蔓延至整个果园，乃至摧毁整个地区的柑橘产业，造成不可估量的损失。培育无毒苗木、尽早发现和彻底铲除病树是防控柑橘黄龙病的关键，因此建立快速、精准的检测方法是防控黄龙病的基础。本文主要综述了柑橘黄龙病各种核酸检测方法及其优缺点，以期对建立更加灵敏、准确、高效的检测技术提供参考。     

柑橘黄龙病研究进展

柑橘黄龙病是1种系统性侵染的毁灭性病害.近年来,柑橘黄龙病在我国部分柑橘产区为害加重,巳成为制约柑橘产业健康发展的关键因素之一.为了进一步了解该病的发生、发展规律,制定科学、有效的防治技术方案,为农业生产服务,对该病的发生与为害状况、症状表现、防治技术等方面的研究成果进行了概述.     

柑橘黄龙病病原研究进展

本文对柑橘黄龙病(HLB)的发现、认识过程及病原菌的分类、检测鉴定技术进行了综述。HLB是一种十分严重的柑橘病害,主要通过木虱和嫁接进行传播,在不同的地区和国家具有不同的名字,已统一命名为HLB。对引起HLB的原因探索经历了一个漫长的过程,从水害、缺素、镰刀菌、病毒到类菌原体,最后确定为细菌。该病原属于α-亚纲,韧皮部杆菌属,分为亚洲种、非洲种和美洲种3个种,可以通过PCR技术进行检测鉴定。同时,对韧皮杆菌的人工培养以及与黄龙病相关植原体的最新研究进展进行了阐述。     

亚洲柑橘木虱的生物学研究进展及防治

亚洲柑橘木虱是柑橘黄龙病唯一传播媒介,柑橘黄龙病是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害,以目前科技水平还不能解决柑橘黄龙病的防治问题。通过控制亚洲柑橘木虱发生,降低柑橘黄龙病初传播风险和次生传播机率,是提高柑橘黄龙病防控水平的有效途径之一。本文从亚洲柑橘木虱形态特征、生物学特性、获菌与传菌能力、带菌率与带菌量、成虫在果园的分布规律、对柑橘品种的选择性,以及防控措施等方面进行了系统的概述,旨在为基层农技人员和广大柑橘种植者防控亚洲柑橘木虱与柑橘黄龙病提供参考。     

应用RT-PCR检测温州蜜柑萎缩病毒

温州蜜柑萎缩病是以日本为主的少数亚洲国家柑橘上的重要病毒病害,多数柑橘品种隐症带毒,不易发现,对其早期准确快速检测尤为重要.以毒源植株的叶、枝皮为材料,对提取的总RNA和总核酸进行反转录和PCR扩增,通过SDV特异引物的设计与筛选,反应体系与反应程序的建立与优化,扩增得到一个251 bp的特异片段,测序结果与日本Iwanami报道的SDV序列同源性为99.6%.RT-PCR检测体系的灵敏度为100ng,同时应用该检测体系可以全年检测到毒源植株嫩叶、嫩皮、老叶、老皮中的SDV.     

广东柑橘黄龙病发生情况与防控对策浅析

近年来,广东柑橘黄龙病为害较严重,威胁本省柑橘产业安全。从工作实践出发,对目前广东省柑橘黄龙病的发生情况及其为害蔓延的主要原因进行了分析,提出了加强柑橘黄龙病防控的对策措施。