甘蔗Cu/Zn-SOD的克隆和表达分析

【目的】克隆甘蔗铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）基因,并分析其序列特征、组织特异性表达及在不同逆境胁迫下的表达模式。【方法】以甘蔗桂糖28号为材料,利用RT-PCR技术克隆获得Cu/Zn-SOD,采用生物信息学方法分析所推测的氨基酸序列,通过实时荧光定量PCR研究Cu/Zn-SOD在不同组织及逆境条件下的表达情况。【结果】克隆获得甘蔗Cu/Zn-SOD,NCBI登录号为JQ958328,其开放阅读框为456 bp,编码151个氨基酸,与禾本科植物聚于同一进化分支。实时荧光定量PCR分析表明Cu/Zn-SOD在根、茎、叶中均有表达,为组成型表达,在叶中表达量最高;Cu/Zn-SOD在聚乙二醇（PEG）、NaCl、低温（4℃）和H2O2四种非生物胁迫下均诱导表达,表达模式因调控机制的不同而异。【结论】克隆获得Cu/Zn-SOD,其主要在甘蔗绿色组织中表达,其在铜/锌SOD超氧化物歧化酶的功能区域保守型很高,可能与甘蔗抵御渗透胁迫相关。     

铜对西洋菜生长影响的研究

为了研究西洋菜是否可以应用于有重金属铜污染的富营养化地表水体的治理和生态修复中，以不同浓度的铜处理3d的西洋菜为实验材料，研究了在短期的培养条件下铜对西洋菜生长的影响。主要测定了抗氧化系统的几种酶，包括POD、CAT、SOD的活性以及可溶性蛋白、叶绿体色素含量的变化。研究表明，浓度为0.05mg·L^-1左右的Cu^2＋对西洋菜的生长有一定的促进作用，此时西洋菜利用光能等的能力均有一定的提高;浓度为0.5～5mg·L^-1的Cu^2＋对西洋菜的生长造成一定的环境胁迫，此时西洋菜保护酶活性明显提高;浓度大于5mg·L^-1的Cu^2＋对西洋菜造成严重的过氧化损伤，此时保护酶的调节能力降低。西洋菜对铜的耐受能力不高，只适合应用于铜浓度极低的富营养化水体的治理和生态修复。     

汞对西洋菜的毒害效应研究

为了研究西洋菜是否可以应用于有重金属汞污染的富营养化地表水体的治理和生态修复中,以不同质量浓度的汞处理3 d的西洋菜为试验材料,测定POD、CAT、SOD的活性、MDA含量以及可溶性蛋白含量的变化。结果表明,低质量浓度汞(小于1 mg/L)存在条件下,西洋菜细胞可以通过自身的调节减轻毒害,可以利用西洋菜进行富营养化水体的治理和生态修复;水体中Hg2+质量浓度达到1 mg/L时,西洋菜遭受到严重的氧化伤害,此时西洋菜很难在水体中存活。     

棉花GhSPS1的克隆及表达模式分析

【目的】克隆棉花蔗糖磷酸合成酶基因（sucrose-phosphate synthase,SPS）,并分析该基因在组织和纤维发育不同阶段及不同非生物胁迫下的表达模式。【方法】采用genome-walking及over-lap PCR方法,获得了棉花中一个蔗糖磷酸合成酶基因--GhSPS1,通过半定量PCR法检测GhSPS1在不同非生物胁迫条件下的表达模式,采用实时荧光定量PCR法对GhSPS1及GhSUS3、GhINV、GhCESA4进行组织和纤维发育特异性表达分析。【结果】克隆得到的GhSPS1全长4 545 bp,包含10个内含子、11个外显子,其开放读码框为3 108 bp,编码1 035个氨基酸,且该基因在ABA、低温处理条件下表达量增加,在高温胁迫下,表达量先升高后降低。实时荧光定量PCR结果显示,GhSPS1及GhSUS3在各种组织中都有表达,其中,在0 DAF、3 DAF的胚珠及18 DAF的纤维中表达量最高,而GhINV、GhCESA4则分别在3-15 DAF的纤维、18 DAF的纤维中表达量最高。【结论】克隆得到的GhSPS1属于SPSA基因家族,能参与ABA、低温、高温等非生物胁迫应答,且可能在纤维发育的起始期及次生壁增厚初期发挥作用。     

中国南瓜内参基因18S rRNA的克隆及其引物开发

【目的】克隆获得中国南瓜18SrRNA,并设计合适的荧光定量PCR内参,为开展中国南瓜重要功能基因的表达模式和调控机制研究奠定基础。【方法】以中国南瓜‘密本’品种的基因组DNA为模板,通过PCR方法克隆中国南瓜18SrRNA基因序列,再利用Primer Premier软件设计荧光定量PCR引物,对该内参基因在中国南瓜不同组织、生长阶段及非生物胁迫条件下的表达稳定性进行检测。【结果】首次克隆得到中国南瓜18SrRNA基因序列,其长度为1 857bp,GenBank登录号为KM979454,该基因与西瓜、西葫芦等瓜类蔬菜18SrRNA基因同源性大都在90%以上;以中国南瓜内参基因18SrRNA核苷酸全长序列为基础设计1对荧光定量PCR引物,以中国南瓜果肉总RNA逆转录的cDNA第一链为模板进行PCR扩增,该引物扩增的片段大小为132bp,扩增效率高,特异性强;18SrRNA基因在中国南瓜不同组织、生长发育阶段及非生物胁迫条件下均能稳定表达。【结论】克隆获得中国南瓜18SrRNA基因,该基因适合在中国南瓜基因表达研究中作为内参基因。     

油菜BnICE1的克隆及表达分析

【目的】从超强抗寒油菜品种陇油6号中克隆抗寒转录因子BnICE1,并对其进行序列特征分析,研究BnICE1在低温胁迫下表达水平的变化,探讨BnICE1对油菜耐低温胁迫能力的影响。【方法】利用RACE技术获得油菜BnICE1全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR研究BnICE1低温及不同组织表达量。【结果】cDNA片段全长1 737 bp,包含1 500 bp完整的开放阅读框,该基因编码499个氨基酸残基,分子量53.2 kD,等电点5.0。序列比对表明,该蛋白C端含有一个典型的bHLH结构域,与其它植物的ICE1蛋白具有较高的同源性,因此命名为BnICE1（GenBank登录号为JF268687）。进化树分析表明,BnlCE1同羊草和白菜亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果表明,该基因在油菜茎、叶和下胚轴均有表达,下胚轴中表达量最高,同时该基因的表达受低温胁迫诱导。【结论】从油菜中克隆了抗寒基因BnICE1,实时荧光定量PCR分析表明其在油菜适应低温胁迫的过程中发挥作用。     

毛果杨（Populus trichocarpa）中ZINC-INDUCED FACILITATOR1（ZIF1）同源基因的生物信息学分析

以拟南芥ZIF1基因序列为基础,利用生物信息学软件及网站,找出毛果杨中ZIF1基因同源序列,对其进行生物信息学分析,并与其他物种中ZIF1同源基因序列进行多重比对与进化分析,使用实时荧光定量PCR技术验证毛果杨中ZIF1同源基因在锌胁迫条件下,根和叶中该基因的表达情况。结果预测出4个符合ZIF1基因基本结构特征,且具有与该基因相同保守功能结构域的毛果杨ZIF1同源基因,这4个基因属于稳定蛋白,可能具有信号肽,明显疏水区和典型跨膜区,基因定位在质膜上,实时荧光定量PCR结果表明,锌过量存在时,这4个基因表达上调,且根中最为显著。以上分析为进一步研究林木中ZIF1同源基因奠定了理论和实践基础。     

毛果杨（Populus trichocarpa）中ZINC-INDUCED FACILITATOR1（ZIF1）同源基因的生物信息学分析

以拟南芥ZIF1基因序列为基础,利用生物信息学软件及网站,找出毛果杨中ZIF1基因同源序列,对其进行生物信息学分析,并与其他物种中ZIF1同源基因序列进行多重比对与进化分析,使用实时荧光定量PCR技术验证毛果杨中ZIF1同源基因在锌胁迫条件下,根和叶中该基因的表达情况。结果预测出4个符合ZIF1基因基本结构特征,且具有与该基因相同保守功能结构域的毛果杨ZIF1同源基因,这4个基因属于稳定蛋白,可能具有信号肽,明显疏水区和典型跨膜区,基因定位在质膜上,实时荧光定量PCR结果表明,锌过量存在时,这4个基因表达上调,且根中最为显著。以上分析为进一步研究林木中ZIF1同源基因奠定了理论和实践基础。     

镰刀菌酸胁迫下节瓜实时荧光定量 PCR分析内参基因的选择

针对不同试验材料及条件选择合适的内参基因是正确利用实时荧光定量PCR 分析目的基因表达模式 的前提条件。以4 个常用看家基因（GAPDH尧Actin尧UBQ尧CYP）和2个新内参基因（CACS尧F-box）作为候选内参基因、 运用实时荧光定量PCR 技术、分析它们在节瓜不同组织（根尧茎尧叶）及镰刀菌酸（fusaric acid, FA）胁迫下的表达稳定 性。经RefFinder 在线软件综合分析、结果表明、节瓜经枯萎病毒素FA 胁迫后Actin 和F-box 表达稳定;而在节瓜不 同组织中F-box 基因表达稳定性最高;另外、传统常用看家基因GAPDH 和CYP因在不同试验条件下总体表达水平 都比较差而不适合作为相应条件下的内参基因。研究结果为节瓜抗枯萎病相关基因的表达分析奠定了基础。     

大豆GmPLC2基因的序列分析及表达特性

提取大豆叶片总RNA,利用RT-PCR法克隆GmPLC2基因的全长序列;利用生物信息学软件分析GmPLC2的蛋白三维结构及氨基酸组成、构建系统发育树;同时,利用实时定量PCR方法分析在不同逆境胁迫下GmPLC2基因的表达模式。结果表明:从大豆中克隆得到的GmPLC2基因全长1779bp,编码592个氨基酸。GmPLC2基因与绿豆、红车轴草的PLC基因编码氨基酸相似性为84.29%和79.63%。荧光定量PCR分析发现,盐碱、盐、碱、干旱和ABA胁迫处理后大豆叶片中GmPLC2基因的表达量出现不同程度的升高,碱胁迫6h时GmPLC2基因的表达量为0h的4倍。