转基因棉花MON757转化体特异性PCR检测方法及应用

转基因棉花(Gossypium hirsutum)MON757转化体是孟山都公司研发的转cryIAc基因的抗虫棉,在美国、加拿大、澳大利亚等国被批准种植或允许用作食品饲料原料,但在我国尚未获得批准种植和应用.目前国内外尚没有转基因棉花MON757特异性的纯杂合检测和定量检测方法报道.为了检测我国棉花中MON757转化体的存在情况,本研究以转基因棉花MON757转化体的插入位点基因组序列和外源插入片段/基因组连接区序列为靶标,建立了特异性的MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法和实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测方法.所建立的MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法的检测引物由分别位于MON757外源基因插入位点两侧基因组和外源插入片段上的3条引物组成,能准确地鉴别棉花植株和种子中MON757转化体的纯合、杂合状态.建立的MON757转化体特异性的qRT-PCR检测方法具有良好的可重复性和灵敏度,其检测下限(limit of detection,LOD)为11个拷贝,定量下限(limit of quantitative,LOQ)为44个拷贝.用此方法对2014年湖北省的49份商品棉花种子进行了检测,结果有5份种子样品检测到MON757转化体.采用MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法对这5份种子样品各60个单粒分别进行了检测,同时采用qRT-PCR检测方法对这5份种子样品进行定量测定.结果表明,有1份含量在1.5％左右,4份含量超过了20％,两种方法的测定结果基本一致.本研究建立的MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法和qRT-PCR检测方法在田间棉花植株和种子中MON757转化体纯杂合状态的测定以及混合样品中MON757转化体含量的测定方面都具有重要的应用价值.     

转cry1Ac基因抗虫棉鄂杂棉1号的旁侧序列和品系特异性检测

为更好地了解我国转基因棉花的转化品系,建立快速准确的品系鉴别方法,本研究采用长链PCR、Genome Walking的方法解析转基因抗虫棉(Gossypium hirsutum L.)新转化品系鄂杂棉1号的整合结构和外源DNA整合的基因组旁侧序列.以旁侧序列为靶标,设计引物,对引物的筛选优化、特异性和灵敏度测试结果显示,建立的鄂杂棉1号品系定性PCR检测方法具有特异性,检测灵敏度为40个拷贝,相当于100 ng模板的0.1%.对市场的21个样品棉花样品检测,有3个样品检测出具有与"鄂杂棉1号"相同转化品系来源,表明本研究建立的品系特异性检测方法可应用于我国转基因棉花育种材料的鉴别和筛选.     

转基因大豆SHZD32-1转化体普通PCR和qRT-PCR检测方法的研究

转基因大豆(Glycine max)SHZD32-1是我国自主研发的耐除草剂大豆转基因品系,该材料将耐草甘膦基因G10-EPSPS导入栽培品种中豆32(Glycine Max,Zhongdou 32)使其获得耐除草剂抗性,具有广阔的应用前景。到目前为止,尚没有针对SHZD32-1的检测方法系统研究的报道。本研究以转基因大豆SHZD32-1转化体的插入位点基因组序列和外源插入片段/基因组连接区序列为靶标,通过设计和筛选引物、探针,特异性、灵敏度等测试,建立了特异性SHZD32-1转化体普通PCR和q RT-PCR检测方法。检测方法特异性实验中,普通PCR和q RT-PCR方法均只在含有SHZD32-1的样品中扩增出阳性结果,而其他不含有SHZD32-1的检测样品中均为阴性结果;方法灵敏性检测中,普通PCR检测法检出限为0.1%,q RTPCR法检测下限(limit of detection,LOD)为21个拷贝;方法稳定性实验中,普通PCR和q RT-PCR方法在其相应最低检出限浓度下进行60次重复试验,结果均为阳性。本研究建立的SHZD32-1转化体特异性PCR检测方法特异性好、灵敏度高、稳定性强。转基因作物转化体特异性检测方法的研究是转基因生物分子特征评价的重要内容之一,其为转基因生物安全监管和追溯提供了技术支持。     

实时定量PCR检测转基因水稻科丰6号插入拷贝数和转基因含量

建立转基因成分灵敏、准确的定量标识是实施转基因安全阈值管理的一个基本步骤,其中实时定量PCR技术是检测产品中转基因含量的主要技术方法。本研究利用该技术确定了双价(cry1Ac+CpTi)转基因抗虫水稻(Oryzasativa)科丰6号中有3个拷贝的外源基因插入。通过对外源基因Bt和转化事件特异的边界特异序列为对象的绝对定量和相对定量检测方法的研究,发现以边界特异序列为对象的事件特异性检测和以目的基因Bt为对象的检测都能够满足相对定量检测的要求。在100ng基因组DNA中,Bt基因和特异性检测的相对定量检测限分别为0.1%和0.5%,在绝对定量检测中,特异性检测的检测限为5个拷贝。不同检测方法对4个已知转基因含量的样品检测结果与预期均一致。结果表明,以转基因产品占总产品比例为定义的转基因含量的测定中,多拷贝或单拷贝基因为对象的不同定量方法的检测对转基因产品的相对定量结果没有影响,本研究对转基因产品的定量阈值设定具有一定的借鉴意义。     

转基因玉米pNK603质粒分子的构建与应用

随着转基因植物和相关产品的迅速发展,转基因检测相关标准物质的需求越趋紧迫,本文针对转基因玉米(Zea mays)NK603进行了质粒分子标准物质的构建和适应性研究.通过从转基因玉米NK603阳性材料中定性扩增转化体特异性片段(NK603-108bp)和玉米的内标基因片段(zSSIIb-151 bp),将得到的PCR产物酶切连接后构建到T载体上,经过酶切、PCR扩增和测序三重验证,得到了pNK603质粒分子.选用不同转基因作物的转化体特异性引物和内标准基因引物对构建的pNK603质粒分子的特异性进行检测,PCR结果显示除了特异性目的条带外,并未发现非特异性扩增.同时采用pNK603质粒分子和转基因玉米阳性基因组DNA作定量标准对已知含量的3个水平的转基因基体物质进行转基因含量测定,实时荧光定量PCR结果发现,两种标准所得到测定的数据没有达到统计学差异显著.T检验表明,PCR扩增效率、两种标准所产生的内源或外源基因的标准曲线的斜率和截距没有显著性差异.这些结果表明,pNK603质粒分子可以作为转基因玉米NK603转化体特异性的定性和定量检测用标准物质.     

转基因大豆GTS40-3-2转化事件特异性PCR检测

GTS40-3-2是抗草甘膦转基因大豆,为建立GTS40-3-2大豆转化体特异性PCR检测方法,本研究以GTS40-3-2标准品为实验材料,根据已公布转基因大豆GTS40-3-2基因与大豆基因组连接序列信息,利用Primer5.0软件设计了5对品系特异性引物,对每对引物进行了退火温度、特异性及扩增效率的PCR检测,结果显示,5对特异性引物均能够从GTS40-3-2中扩增出大小约279bp、238bp、470bp、490bp和257bp的预期产物,可用于特异性检测转基因大豆GTS40-3-2转化事件。以转基因大豆GTS40-3-2含量为5%、2%、1%、0.5%和0.1%的标准品进行PCR灵敏度检测,结果表明5对引物的检测灵敏度均能达到0.1%。通过荧光定量PCR对5对特异性引物的Ct值与溶解曲线比较,最后选择出RRS2引物对为转基因大豆GTS40-3-2品系特异性检测的最适引物。本文结果将为我国未来转基因生物产品成分检测提供科学合理的实验参考。     

转基因水稻Bt汕优63的整合结构和品系特异性定量PCR方法

为更好地监测转基因抗虫水稻(Oryza sativa L.)Bt汕优63品系的存在,满足转基因标识管理的要求,同时也为了解决阳性植物基因组DNA不容易获得的问题,本研究采用热不对称交互PCR(TAIL-PCR)、Genome Walking和长链PCR(LD-PCR)方法测定了基因枪转化的转cry1Ab/cry1Ac融合基因水稻品系Bt汕优63的外源插入DNA全序列,构建了含有Bt汕优63 3′旁侧和水稻内标基因gos9序列的标准质粒分子pMDBt63作为标准物质,建立了Bt汕优63实时荧光定量PCR方法.外源插入DNA全长9 818bp,位于水稻基因组10号染色体(AP008214)第5348630位,由8个来源于两个转化质粒的DNA片段组成,其中两个cry1Ab/cry1Ac表达框以正向串连的方式插入.gos9和3′旁侧两个定量标准曲线的相关系数(R2)分别为0.9997和0.9992,扩增效率(E)分别为98.05%和99.46%.每反应100 ng模板DNA的检测限(LOD)为10拷贝,定量限(LOQ)为100拷贝.此外,对已知5%和1%转基因含量的混合样品DNA进行定量检测,结果的平均值分别为4.98%和1.07%.结果表明标准质粒pMDBt63作为标准物质建立的定量方法可用于Bt汕优63的定量检测.     

DNA条形码与实时荧光定量PCR技术在铁皮石斛鉴定中的应用

为建立铁皮石斛准确、高效的鉴定体系,本研究以101份石斛属和蝴蝶兰属植物样品为试验材料,通过对比ITS、psbA-trnH、matK及rbcL基因在石斛属植物中的鉴定能力,筛选出ITS作为本研究最理想的DNA条形码。以ITS序列作为靶基因,设计铁皮石斛特异引物和特异探针,以及石斛属通用引物和探针,利用实时荧光定量PCR(TaqMan)技术,建立铁皮石斛多重实时荧光PCR检测新体系,通过特异性、灵敏度和实际样本验证,发现参试样品中的25份铁皮石斛均可被有效鉴定,与其他鉴定方法相比,该方法具有特异性强、灵敏度高(高出普通PCR 100倍)、重复性好且高效经济的优势。本研究结果对铁皮石斛的资源保护与利用起到了积极作用。     

洋葱腐烂病菌荧光定量PCR检测体系的建立

唐菖蒲伯克霍尔德菌洋葱致病型(Burkholderia gladioli pv.alliicola),是重要的植物病原细菌检疫性有害生物.本研究的目的是建立特异、灵敏、快速的TaqMan探针荧光定量PCR方法用于检测洋葱腐烂病菌(B.gladioli pv.alliicola).利用洋葱腐烂病菌保守基因序列设计和筛选特异性引物和TaqMan探针,优化PCR反应体系和反应条件.荧光定量PCR菌液检测灵敏度达到1.02×102 CFU/mL,DNA检测灵敏度达到1.73×10-4 ng/μL,反应时间仅需1h左右,对14种伯克氏菌属Burkholderia)参比菌种的特异性检测结果显示,洋葱腐烂病菌具有明显的扩增曲线生长,表明建立的荧光定量PCR体系具有非常高的特异性.同时对洋葱(Allium cepa)种子进行了模拟带菌检测,结果表明,建立的洋葱腐烂病菌荧光定量PCR检测体系能够检出模拟样品中的洋葱腐烂病菌,验证了检测体系的实用性.本研究建立的洋葱腐烂病菌荧光定量PCR检测体系能够有效用于洋葱腐烂病菌的鉴定,为进出口口岸和基层检验检疫部门提供了一种简便、快速、准确的洋葱腐烂病菌分子检测手段.     

山茶根结线虫的LAMP-LFD快速检测方法

为了提高检测效率,本研究利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)扩增核酸,用横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)检测产物,建立了一种山茶根结线虫(Meloidogyne camelliae)的LAMP-LFD快速检测新技术.以山茶根结线虫核糖体DNA内转录间隔区(ribosomal DNA-intemal transcribed spacer,rDNA-ITS)为检测靶标,设计3对特异性引物进行生物素标记的实时荧光LAMP反应,优化后的LAMP扩增条件为63℃反应15 min.比较LFD、实时荧光曲线以及琼脂糖凝胶电泳等3种产物检测方法,结果表明,LAMP产物与异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针ITS-HP杂交5 min后即可在LFD上显色,从LAMP反应开始到LFD结果判断仅需25min,比常规PCR技术缩短约2h.LAMP-LFD技术能特异性地检测山茶根结线虫,对其基因组DNA的检测灵敏度为4 pg/μL,低于常规PCR方法100倍;对其单条2龄幼虫(J2)检测灵敏度为1/1 000条线虫.本研究建立的快速、灵敏、特异性LAMP-LFD检测技术可应用于山茶根结线虫的口岸检验.     

转基因水稻EB7001S事件特异性检测方法的建立

随着越来越多的转基因作物及其产品进入人类生活的各个领域,准确、快速、高效的检测转基因作物及其产品成为转基因研究和安全管理的基本要求。为了建立抗两种除草剂转基因水稻(Oryza sativa)EB7001S的事件特异性检测方法,本研究利用高效热不对称PCR(high efficient thermal asymmetric interlaced PCR,hiTAIL-PCR)和长距离PCR法(long-distance PCR,LD-PCR)扩增获得了转基因水稻EB7001S中外源基因插入位点的旁侧序列,其中:右旁侧序列1 515 bp,左旁侧序列1 460 bp,外源基因插入水稻基因组第7号染色体第1 470 725位。以左右旁侧序列为基础,建立了转基因水稻EB7001S的事件特异性定性PCR检测方法,采用该方法可从转基因水稻EB7001S中扩增到458和629 bp的2条特异性目的片段。该方法特异性强、稳定性好、灵敏度高,在模板中掺入EB7001S基因组DNA的量为0.1%时仍能通过普通PCR方法检测出来。以旁侧序列为基础,还建立了能快速、准确鉴定外源基因纯合株系的三引物PCR检测法。这些检测方法的建立,将为转基因水稻EB7001S的利用和检测提供关键技术基础。     

实时荧光定量PCR检测胸膜肺炎放线杆菌方法的建立及应用

研究建立检测胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的实时荧光定量PCR方法,并运用建立的检测方法对临床病料进行应用检测.根据GenBank报道的胸膜肺炎放线杆菌apxⅣA基因3'端391 bp核苷酸保守序列,设计1对特异引物扩增117 bp核苷酸片段,建立检测APP的实时荧光定量PCR方法和标准曲线,并利用该方法对收集肺脏组织和人工感染组织材料进行APP核酸定量检测.结果表明,构建的实时荧光定量PCR检测方法具有良好敏感性、特异性、重复性和临床应用性.该方法的建立为APP的临床高效诊断和APP感染的发生、发展和转归研究提供了一种有效手段.     

转基因抗虫棉花重组DNA在土壤中分布的实时定量PCR分析

根据转基因抗虫棉花35S启动子与Cry1A（c）基因以及35S启动子与nptⅡ基因之间的构建特异性序列分别设计引物和探针,建立荧光定量PCR检测方法,并对采集于3个生长时期（播种后40、50d和60d）的不同根区（根表、根际和非根际）土壤中35S-Cry1A和35S-nptⅡ片段进行定量分析。结果表明,所建立的荧光定量PCR方法最低能够检测到10个拷贝数的外源重组DNA片段,定量标准曲线相关系数均达到0.998以上,具有很好的重复性。实时定量PCR分析表明,同一生长时期不同根区土壤中35S-Cry1A和35S-nptⅡ片段拷贝数变化情况均为根表土〉根际土〉非根际土,即转基因抗虫棉花重组DNA片段主要分布于根表土壤中,其次为根际土壤和非根际土壤。在60d生长期内,土壤中35S-Cry1A和35S-nptⅡ片段的拷贝数随生长时期的推进均呈现上升趋势,其分布范围逐渐扩大。土壤中35S-nptⅡ片段拷贝数均高于同一生长时期相应根区中35S-Cry1A片段的拷贝数。转基因抗虫棉花对环境可能存在潜在影响。     

实时荧光PCR检测转基因大豆外源基因的拷贝数

快捷、准确地检测转基因植物中外源基因的拷贝数,是转基因生物育种的重要研究内容,具有较大的应用前景。本研究以7个抗虫BT(Bacillus thuringiensis)和抗草甘膦EPSPS-G10转基因大豆事件为材料,以SYBR Green I为荧光染料,利用实时荧光定量PCR方法,根据PCR反应获得的Ct值与起始模板数的对数值存在线性反比关系这一原理,建立了相关性系数在0.99以上的模板定量标线。通过目的基因与内参基因——大豆肌动蛋白编码基因ACTIN的起始模板量比较,估算出各株系的目的基因拷贝数。数据显示,株系1、2、3和4的2个基因均为单拷贝,株系6的2个基因均有2个拷贝,株系5和7的2个基因的拷贝数为3。利用Southern印迹方法对材料1~4的拷贝数进行验证,结果表明,两者的检测结果基本一致,证明实时荧光PCR检测法是大豆外源基因拷贝数检测中快速有效的方法。实时荧光PCR高效快速检测基因拷贝数,对于大规模转基因株系的外源基因拷贝数检测应用具有重大意义。     

用复合PCR方法检测6种转基因玉米中外源DNA的特异性

利用本实验室研制的植物DNA提取试剂盒，从玉米（Zea mays）种子中提取符合PCR检测要求的DNA。根据不同转基因玉米中重组DNA的结构，分别设计引物，可对Btl1、Event176、T25、MON810、GA21和NK603等6种转基因玉米进行特异性PCR检测。在此基础上建立了针对6种转基因玉米的特异性DNA片段和玉米内参照基因（zein）的复合PCR检测方法，能同时对7对引物进行扩增，通过产物的长度差异对不同的转基因玉米进行辨别，实现了在同一个PCR反应管中同时对6种不同转基因玉米的特异性检测。     

转基因植物中CaMV35S和tNOS元件的4种定性PCR检测方法的比较

花椰菜花叶病毒35S启动子(promoter of Cauliflower mosaicvirus 35S,CaMV35S)和胭脂碱合成酶基因终止子(terminator of nopaline synthase gene,tNOS)是转基因产品筛选检测中的首选参数,日常检测中发现,个别标准中用于筛选检测这两种元件的引物存在非特异性扩增和灵敏度差的问题。本研究收集了国内外标准中常用的扩增片段分别为195、165、147和123 bp的CaMV35S和扩增片段分别为180、172、165和118 bp的tNOS各4对引物,应用普通PCR和实时荧光(Real-time)PCR方法,对8对引物的特异性、灵敏度及在加工品中的扩增性进行了测试和适用性评价。结果表明,CaMV35S 165和147 bp引物具有很好的特异性,灵敏度高,在不同的加工品中也表现出强的检测能力,筛选检测效果最佳;195bp引物扩增性稍差,且经常出现非特异性扩增;123bp引物较其他引物扩增弱且扩增不稳定。tNOS 172和165bp引物具有很好的特异性,灵敏度高,在不同的加工品中也表现出强的检测能力,筛选检测效果最佳;180bp引物扩增性较差,且易出现非特异扩增;118bp引物较其他引物扩增弱且扩增不稳定。本研究通过普通PCR和实时荧光(Real-time)PCR对不同国标中出现的引物进行适用性评价,为转基因产品的检测监管提供可靠技术依据。     

大鲵致病性嗜水气单胞菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR诊断试剂盒的研制

根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌特异性的气溶素基因序列,设计1对引物,利用普通PCR技术扩增获得hlyA基因片段,并克隆到pMD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR GreenⅠ荧光定量PCR反应条件的优化,建立了快速检测致病性嗜水气单胞菌的SYBR GreenⅠ荧光定量诊断方法,以此为基础研制出试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对非致病性嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、迟缓爱德华菌、柱状黄杆菌均无阳性信号扩增,重复性好,灵敏度可达1.0x101拷贝/uL。结果表明研制的致病性嗜水气单胞菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等特点,适合于大鲵临床样品的检测。     

不同转化方法获得的转基因棉花外源基因拷贝数分析

转基因植物中外源基因拷贝数是影响其自身表达水平与遗传稳定性的重要因素.本研究旨在比较农杆菌介导法、基因枪轰击法和花粉管通道法等3种常用方法转化同一植物表达载体的转基因棉花(Gossypium hirsutum)中外源基因拷贝数的差异.本文主要采用实时定量PCR技术及相应的PfaffI分析法检测转基因棉花单株拷贝数,并与Southern杂交做了相互验证.实时定量PCR研究结果显示,农杆菌介导法、基因枪轰击和花粉管通道注射法获得的T0代转化体中,外源基因拷贝数为1～2的单株占群体总数的百分比分别为26.2%、60%和42.8%.外源基因拷贝数为3～5的单株比例分别为47.5%、40%和57.1%.另外,农杆菌介导获得的转基因群体中有高达27.3%的单株整合有5拷贝以上的外源基因,而基因枪轰击和花粉管通道注射法获得的转基因群体中没有发现5拷贝以上的转基因单株.研究结果表明,基因枪轰击和花粉管通道注射法均能获得较高比例低拷贝(1～3拷贝)的转化体.本研究结果对棉花转基因育种中转化方法的选择有一定的理论指导意义.     

乳制品中水牛乳成分的实时荧光PCR检测技术

水牛奶制品因其良好的营养功效备受国内外消费者的青睐,而在国内外,乳制品掺假行为,却常有发生.我国作为水牛奶酪等乳制品的进口国,迫切需要一种准确的水牛成分的检测方法,来避免这种掺假行为对我国的进出口贸易造成损失.根据水牛Bubalus bubalus)线粒体细胞色素b(Cytb)基因的保守序列,设计一对特异性引物和TaqMan-MGB探针,建立了水牛乳成分的实时荧光PCR检测方法.运用实时荧光PCR方法对5种乳水牛样品和47种常见的非水牛动植物样品进行检测,5种水牛乳样品均产生荧光信号,其余非水牛样品均不产生荧光信号,表明该检测方法具有特异性.该检测方法的重量检测灵敏度为0.01％水牛奶(W/W),DNA浓度检测灵敏度为0.001 ng/μL水牛DNA.对市售的水牛奶制品进行实际样品检测,结果表明,该方法能很好地检出水牛乳成分.本研究表明,该方法具有特异性好、灵敏度高的优点,可作为乳制品中水牛乳成分鉴别检测的有效方法.     

转基因玉米多重PCR-基因芯片联用检测方法的研究

根据七种转基因玉米的重组DNA结构分别对Bt11、Bt176 、Mon810 、Mon863 、TC1507、 GA21 和NK603设计转化体特异性引物,进行多重PCR检测。在此基础上分别设计和筛选了七种转基因玉米转化体特异性oligo探针,制备转基因玉米的寡核苷酸芯片。实验表明,该探针特异性好,同常用的凝胶电泳检测方法相比,芯片杂交的灵敏度（0.01%）,优于凝胶电泳检测（0.1%）,由于采用了多重PCR技术一次可同时检测多个基因,提高了检测的准确率和效率。