茶树LOX基因家族的鉴定及其在白茶萎凋过程的表达分析

脂肪族类化合物是植物芳香物质的重要组成部分,对白茶香气的形成具有重要作用。利用生物信息学方法,在染色体级别的茶树基因组数据库中,对LOX基因家族进行鉴定,从中获得12个茶树LOX基因家族成员,命名为CsLOX1~CsLOX12。12个茶树LOX基因序列,主要定位于细胞质或叶绿体中,其编码蛋白具有相同的特征结构域及保守基序。系统进化树分析表明LOX基因家族分为9-LOX和13-LOX两个亚家族,CsLOX2、CsLOX3、CsLOX4、CsLOX7为9-LOX亚型,其余为13-LOX亚型;基因结构分析表明CsLOX1含有8个外显子,其余均含有9个外显子;不同组织转录组数据分析结果表明,该家族在茶树嫩叶、成熟叶部位高表达;上游启动子区域分析发现大量与植物生长发育、光响应、激素及胁迫响应密切相关的顺式作用元件。荧光定量PCR检测发现,CsLOX基因家族在干旱、低温及茉莉酸甲酯处理下均有不同程度的表达,在白茶不同萎凋时间处理下,CsLOX1、CsLOX3、CsLOX5、CsLOX7、CsLOX8、CsLOX9、CsLOX11和CsLOX12的表达量被诱导上调,4 h时表达量最高（最高上调27倍）。结果表明,CsLOX基因家族成员参与白茶加工萎凋过程脂肪族香气形成的调控,为探明白茶加工过程香气形成的分子机制奠定基础。     

白茶萎凋过程萜烯类合成相关基因的鉴定和表达分析

萜烯类化合物是植物中重要的次生代谢产物之一,对茶树挥发性香气的组成起着重要作用。从茶树基因组数据库中鉴定获得了141个茶树萜烯类合成相关基因,并对其不同组织表达特异性进行分析,筛选出16个在茶树顶芽和嫩叶中高表达的萜烯类合成代表基因。生物信息学分析结果表明,系统进化关系将茶树与拟南芥和葡萄的萜烯类合成相关基因分成了4个亚家族;茶树萜烯类合成相关基因含有5~14个外显子,在上游启动子区域分析发现了大量与光响应、植物生长发育、激素和胁迫响应密切相关的顺式作用元件。荧光定量检测发现,CsMVK、CsDXS和CsGGPS在白茶萎凋过程中的表达显著上调;CsDXR、CsMCT、CsCMK、CsMCS、CsHDS、CsGPPS和CsGGPPS在萎凋4 h和24 h的表达达到峰值。本研究结果为进一步挖掘茶叶萎凋过程中萜烯类合成相关基因对茶叶香气组分积累提供了理论依据。     

LED黄光对工夫红茶萎凋过程香气相关酶基因表达及活性影响

将政和大白茶鲜叶置于LED黄光下照射萎凋16βh,以室内萎凋为对照,按工夫红茶工艺制成毛茶。对萎凋过程中萎凋叶的β-葡萄糖苷酶基因（CsBG1、CsBG2）、β-樱草糖苷酶基因（CsBP）的相对表达量、β-葡萄糖苷酶的活性,及毛茶挥发性香气组分进行分析,结合感官审评,研究黄光萎凋对工夫红茶品质的影响。结果表明,在LED黄光萎凋下,CsBG1、CsBG2表达量明显提高,萎凋第6βh CsBG2相对表达量最高,显著高于对照组;CsBP在黄光萎凋全过程呈上调表达。LED黄光前期促进萎凋叶香气相关酶基因上调表达,在萎凋后期调控β-葡萄糖苷酶活性提高,最终使得工夫红茶甜花香显现,品质提升。     

茶树CsAAPs亚家族基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR技术,从龙井43中成功克隆了5个茶树AAPs（Amino acid permeases,氨基酸通透酶）基因。氨基酸序列比对结果表明,5个CsAAPs亚家族蛋白的序列同源性较高,为70.27%。根据氨基酸序列同源性构建系统发育树,结果显示5个CsAAPs分属3组。生物信息学分析表明,CsAAPs均含有9~10个跨膜区域和16~18个AAP保守基序。为了研究该亚家族对氮素的响应情况,选用3个茶树品种的扦插苗为试验材料,氮饥饿两周后,分别供应不同浓度的NH₄NO₃,然后利用qRT-PCR对CsAAPs在不同组织、氮素水平及茶树品种中的表达情况进行分析。研究发现CsAAPs在营养组织中均有表达,但是存在一定的组织表达差异,其中CsAAP3在茎中表达量最高,CsAAP8的主要表达部位为根和茎。在给氮素饥饿处理的茶苗从新供氮之后,CsAAP3的基因表达在3个氮素利用效率不同的品种间差异较大;在氮高效品种中茶302茎中表达的CsAAP3和CsAAP8,可以快速地对低氮条件做出响应,在低氮处理3 h后,基因表达水平明显增加。此研究预示着CsAAPs亚家族在茶树体内可能通过复杂的氨基酸转运参与氮代谢调控。     

茶树CsPAL3基因cDNA全长克隆及其表达分析

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）由多基因家族编码,是花青素等多酚物质合成途径的起始酶,对其合成具有调控作用。本研究以紫化茶树武夷奇种C18茶树为材料,采用RACE技术克隆获得CsPAL基因cDNA,命名为CsPAL3（登录号为KY865305）,分析其生物信息学特征,并检测不同叶色茶树品种（系）中的花青素总量及茶树PAL家族成员基因的表达情况。结果表明,获得CsPAL3基因全长cDNA为2β518βbp,包含一个完整的2β130βbp开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）,编码709个氨基酸。序列分析表明,该基因编码的蛋白质为稳定亲水性蛋白,预测分子量为77.40βkD,理论等电点为6.26;Blast分析序列发现CsPAL3与芒果的MiPAL相似性最高,为87%。而在同源进化树分析中与芍药的PiPAL亲缘关系较近。紫化茶树的花青素总量和CsPALa、CsPALc、CsPAL3（CsPALe）基因表达量均高于常规绿叶茶树和白化茶树。这表明茶树CsPALa、CsPALc、CsPAL3（CsPALe）基因上调表达可能促进茶树花青素合成积累,使得茶树叶片呈现紫色。     

茶树CsPHT1;3基因特性及其对硒的响应研究

茶树具有较强的富硒能力，有关磷酸盐转运体参与硒吸收的分子机理研究较少。克隆茶树CsPHT1;3基因，并探究该基因的特性及对硒浓度和价态、pH、时间的响应，以及在不同聚硒茶树品系中的表达情况。基因特性分析表明，CsPHT1;3属于磷酸盐转运蛋白PHT1亚家族成员，定位于质膜且具有PHT1蛋白保守结构域GGDYPLSATIxSE。在不同器官中表达模式分析表明，CsPHT1;3在成熟叶和根中表达量显著高于其他器官。不同浓度和价态硒诱导结果表明，CsPHT1;3在茶树根系中于1 d和7 d显著受低浓度Se⁴⁺诱导表达；除处理后3 d外，茶树根系中CsPHT1;3显著受Se⁶⁺诱导上调表达且基本不受Se⁶⁺浓度影响。不同pH处理茶树结果表明，茶树根系中CsPHT1;3在pH=5时对Se⁴⁺响应于24 h达最高；在pH=3时对Se⁴⁺响应于48 h达最高；而在pH=7时，对Se⁴⁺响应于72 h达最高。硒酸钠处理不同聚硒茶树品系结果表明，CsPHT1;3在不同品系的叶...     

茶树CsSnRK2.1、CsSnRK2.2基因的克隆及在非生物胁迫中的响应

蔗糖非酵解型蛋白激酶（SnRK）是一类广泛存在于植物体内的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶,其中SnRK2家族在植物非生物胁迫响应过程中起着十分重要的作用。为了探究茶树SnRK2家族基因响应逆境的分子机制,本研究克隆了两个茶树SnRK2家族基因,并分别命名为CsSnRK2.1（GenBank登录号：MG026837）和CsSnRK2.2（GenBank登录号：MF662805）,生物信息学分析表明CsSnRK2.1和CsSnRK2.2分别编码358个和337个氨基酸,与拟南芥和玉米SnRK2蛋白激酶的同源性很高,均具有保守的ATP结合位点和Ser/Thr激酶活性结构域。在高盐、干旱和ABA胁迫下,CsSnRK2.1均能被诱导表达,且呈现先升后降趋势,而在低温和高温胁迫下表达量变化不大;CsSnRK2.2能强烈响应高盐胁迫,也能被高温诱导上调表达;表明它们可能与茶树抗逆密切相关。     

茶树PPR基因家族全基因组鉴定及白化相关基因表达分析

三角状五肽（PPR）蛋白作为一类靶向定位于半自主细胞器的序列特异性RNA结合蛋白,在植物的生长发育过程中具有重要的作用。本研究基于茶树基因组数据,利用生物信息学方法对茶树CsPPR基因家族进行系统鉴定,并对其蛋白质理化性质、结构域保守性、亚细胞定位、基因结构、染色体定位与分布等进行了分析。结果表明,在茶树基因组数据中共鉴定到858个CsPPR基因,分属于P和PLS两个亚家族;结构域分析表明各个结构域在茶树中比较保守;亚细胞定位结果显示超过一半的CsPPR蛋白定位于叶绿体;基因结构分析表明茶树CsPPR基因家族中共有31%的CsPPR基因不具有内含子结构,并且家族成员在进化过程中发生过多次基因复制事件。另外,为探究茶树CsPPR基因家族在调控茶树白化相关基因表达过程中的作用,对正常叶色品种舒茶早和安吉黄茶等5个白化茶树品种进行转录组测序,共筛选到24个差异共表达CsPPR基因,并利用实时荧光定量PCR技术对其在不同品种和不同组织中的表达模式进行了分析,结果显示大多数CsPPR基因在新梢、成熟叶和茎中高表达,但在花和根中痕量表达。本研究结果可为茶树CsPPR家族成员的基因克隆和功能研究提供参考。     

茶树对硒吸收累积特性及其硒调控相关基因的表达分析

本文采用沙培试验,从动态角度研究了不同时间和不同浓度下茶树对硒的吸收累积规律,并分析相关基因的表达特点。结果发现,茶树不同部位对硒的累积量存在较大差异,大部分硒保留在根部,在其体内的迁移率较低,硒的累积量和外源硒浓度、培养时间显著相关;当外源硒浓度在0~0.05 mmol·L^-1时,茶树长势良好,但当浓度高于0.10 mmol·L^-1时,茶树表现出中毒症状。荧光定量PCR分析发现,转录因子CsbHLH62及茉莉酸信号途径中的关键基因丙二烯环化氧化酶基因（CsAOC）和脂氧合酶基因（CsLOX6）受到高浓度硒的诱导表达,相关性分析表明,这3个基因的表达量与根系硒含量呈显著正相关。本研究表明,茶树各部位对硒的累积与外源硒浓度和培养时间显著相关,基因CsbHLH62、CsAOC和CsLOX6可能在该过程中发挥着重要作用。     

茶树COBRA基因家族全基因组鉴定及表达分析

COBRA基因编码糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白,是次生壁加厚和纤维素含量的调节因子,对植物生长、纤维素含量等有重要作用.本研究通过对茶树基因组数据进行分析,成功的从中鉴定到COBRA基因,并对该基因家族成员的蛋白理化性质、亚细胞定位、进化关系、保守结构域、染色体定位等进行生物信息学分析,同时分析了茶树COBRA成员在PEG诱导的干旱胁迫、茉莉酸甲酯处理、盐胁迫、冷胁迫处理中的转录组数据,最后对茶树进行茉莉酸甲酯处理,基于荧光定量PCR技术的表达水平验证.结果表明:茶树COBRA基因有16个家族成员,相对分子质量24807.70～74813.12,等电点5.43～9.14,亚细胞定位显示在细胞膜和细胞外;根据系统进化树将茶树COBRA基因家族分为5类;保守结构域和motif分析发现相同亚家族的基因结构,保守结构域都属于COBRA基因家族;基因表达分析显示COBRA基因在不同茶树部位和胁迫的表达量有不同差异,说明茶树COBRA基因广泛参与茶树生长发育和非生物胁迫响应.实时荧光定量PCR显示经茉莉酸甲酯处理后,3个CsCOBRA基因表达量趋势大致与转录组数据一致,本研究将为进一步开展茶树COBRA基因家族的功能验证和抗逆作用机理研究等提供参考.     

茶树茉莉酸合成与转导途径关键基因在乌龙茶加工过程中对萜类物质的影响

对茶树茉莉酸合成与信号转导途径关键基因进行分析，并探究其在乌龙茶加工过程中的表达模式和对萜类物质形成的影响。结果表明，茶树茉莉酸合成与信号转导途径中共11个关键基因家族，包含133个候选基因；顺式作用元件分析显示，该途径关键基因的启动子区域包含大量的顺式作用元件，包括茉莉酸响应、损伤响应和厌氧诱导响应等元件；qRT-PCR分析表明，该途径大多数基因在萎凋过程呈上升趋势，在二摇后达到最高，四摇过程显著下调，杀青前略有回升，且关键基因可响应乌龙茶加工过程中多种胁迫；顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用（HS-SPME-GC-MS）检测出73种萜类物质，主要包括芳樟醇、香叶醇和α-法尼烯等呈花果香型物质；相关性分析表明，CsLOX11、CsLOX12、CsAOS2、CsAOC1、CsACX4、CsACX8、CsMYC2-4、CsMYC2＿15和CsMYC2＿21与β-蒎烯、柠檬烯和月桂烯等呈正相关，CsOPR2、CsTPL6和CsLUG4与反式-橙花叔醇、α-法尼烯和紫罗兰酮等呈正相关，其中CsTPL6与35种萜类化合物呈极显著正相关。明确茶树茉莉酸合成与信号转导途径关键基因参与调控乌龙茶加工过...     

不同光质对红茶萎凋叶叶绿素荧光参数及生化品质的影响

基于光质萎凋在茶叶加工中的优越性,试验采用快速、灵敏的叶绿素荧光参数来反映红茶光质萎凋的内在机制。结果表明,萎凋0～8 h,各处理萎凋叶的NPQ、Y(NPQ)先升后降,Y(Ⅱ)、qP先降后升,表现出较强的逆境耐受能力,使萎凋叶茶多酚、氨基酸、咖啡碱、可溶性糖含量相对稳定;8 h后,各处理萎凋叶的NPQ、Y(Ⅱ)、ETR、qP逐步降低,Y(NO)逐步升高,表示逆境耐受能力逐步减弱,导致叶片的氨基酸含量明显升高;萎凋结束时,对照样的NPQ、Y(NPQ)、Y(NO)、Fv/Fm、Fv/Fo最低分别为1.874、0.508、0.267、0.723、2.626,其逆境耐受能力弱;蓝光处理萎凋叶的NPQ、Y(NPQ)最高分别为2.120、0.567,逆境耐受能力强;红光和黄光处理萎凋叶的逆境耐受能力居中,黄光萎凋叶的氨基酸含量最高,为2.58%;氨基酸含量与Fm、NPQ呈显著负相关,与Fv/Fm呈极显著负相关,与Y(NO)呈极显著正相关;黄光处理的红茶感官品质得分最高,为91分,对照样最低,为85分。     

茶树SRO基因家族的鉴定及表达分析

SROs(Similar to rcd one)是植物特有的基因家族。本研究利用生物信息学方法从茶树基因组中鉴定获得9个茶树SRO基因家族成员,分别命名为CsRCD1-4和CsSRO1-5。9个茶树SRO基因的编码蛋白均具有特征结构域PARP和RST,具有相似的保守基序。系统进化树分析聚分为3组,Ι组包含CsRCD1-4,Ⅱ组包含CsSRO1和CsSRO2,Ⅲ组包含CsSRO3-5。基因结构分析表明每个CsSRO基因含有4至9个外显子。8个茶树组织转录组数据分析表明,CsRCD1、CsRCD3和CsRCD4可能在茶树不同发育阶段具有重要作用;大多数CsSRO基因在根和成熟叶中较高表达。上游启动子区域分析发现大量与植物发育、激素及胁迫响应密切相关的顺式作用元件,进一步对CsSRO基因在干旱和脱落酸处理下的表达模式进行分析发现,9个CsSRO基因均被诱导表达,CsSRO基因可能与茶树抗旱密切相关。     

茶树CsRAV2转录因子基因的克隆与表达特性分析

RAV转录因子是AP2/ERF家族的成员之一,在植物生长发育和逆境调控中起着重要作用。本研究以安吉白茶和迎霜这两个茶树（Camellia sinensis）品种为试验材料,通过PCR和RT-PCR方法分别从两种茶树的DNA和cDNA中克隆得到CsRAV2基因。分析显示,来源于两种茶树中的CsRAV2基因全长均为1 089 bp,没有内含子,分别编码362个氨基酸,含有相对保守的AP2结合域和B3结构域,具有典型的植物RAV类转录因子特征。从氨基酸组成成分、理化性质、亲水性/疏水性、三级结构上分析显示,茶树中CsRAV2转录因子是亲水性蛋白。茶树中CsRAV2转录因子与拟南芥AtRAV具有相似的三级结构。实时定量PCR分析表明,茶树中CsRAV2基因在茶树根中表达量最高,高温、低温、NaCl处理均能诱导该基因表达,不同品种间存在差异。     

茶树CsMDHAR基因的克隆与非生物胁迫响应分析

基于茶树转录组数据,以龙井43茶树cDNA为模板,克隆得到开放阅读框（ORF）长度为1β305βbp,编码434个氨基酸的茶树单脱氢抗坏血酸还原酶基因,命名为CsMDHAR。蛋白序列特征和基因表达模式分析表明,CsMDHAR蛋白含有FAD结合功能域,属于FAD依赖的吡啶核苷酸-硫基氧化还原酶（Pyr-redox-2）家族。该蛋白有两个无序化区域,而且包含有32个磷酸化位点,理论相对分子量为47.21βkDa,pI为5.99,属于亲水性蛋白;CsMDHAR蛋白二级结构以α-螺旋和随机卷曲为主。通过PlantCARE和PLACE对启动子上游调控元件进行分析预测,结果显示,CsMDHAR基因启动子上游1β000βbp中含有多个与光、激素以及植物抗逆有关的顺式作用元件。利用荧光定量PCR方法检测龙井43和迎霜的CsMDHAR、CsAO和CsAPX在4种不同非生物胁迫下的表达水平,结果表明,在低温（4℃）胁迫下,两个茶树品种的CsMDHAR、CsAO和CsAPX的表达均受抑制,且品种间的差异较小;在高温（38℃）和干旱（200βg·L^-1 PEG）胁迫下龙井43中的CsMDHAR表达均上调,分别在8βh和2βh时达到最大值,为对照的1.49倍和1.85倍;盐（200βmmol·L^-1 NaCl）胁迫下,CsAO和CsAPX在两种茶树品种中的表达量变化趋势相似,但变化幅度不同,可能与品种间不同的抗逆性有关。     

茶树硝酸根转运蛋白基因NRT2.5的克隆及表达分析

通过RACE克隆从茶树[Camellia sinensis (L.)]叶片中获得NRT2.5基因cDNA全长序列。所得基因序列全长为2 457 bp,其中开放阅读框为1 362 bp,编码454个氨基酸,推测蛋白分子量为48.7 kD,理论等电点为9.63。生物信息学分析表明,该基因与可可树、拟南芥等的NRT2.5基因具有高度同源性,且其编码的蛋白质具有NRT家族共有的结构特征。实时定量PCR分析表明,NRT2.5基因在茶树不同组织中均有表达,但主要在成熟叶和根中表达;不同氮浓度处理后,茶树NRT2.5基因在低浓度下的表达量高于高浓度下。     

茶树CsCML16基因的克隆及其低温胁迫下的表达分析

类钙调蛋白CMLs（CaM-like proteins）是植物体内一类重要的钙信号转导蛋白,在抗非生物胁迫中发挥重要作用。以龙井43、福鼎大白茶和黄金芽的一年生茶树扦插苗为材料,通过低温处理（10℃和4℃）分析茶树在低温胁迫下的生理变化;通过克隆茶树类钙调蛋白CsCML16,分析其在低温胁迫下不同抗寒性茶树品种中的表达模式。结果表明,低温胁迫下龙井43的抗寒性较强,福鼎大白茶次之,黄金芽品种较弱。以龙井43的cDNA为模板,克隆获得CsCML16基因,序列分析表明该基因CDS全长为480 bp,编码160个氨基酸,具有钙受体蛋白EF-Hand保守结构域,为小分子蛋白,相对分子量17.58 kDa;亚细胞定位结果显示CsCML16定位于细胞核和细胞膜。荧光定量结果表明,低温胁迫诱导CsCML16基因的上调表达,且在不同的茶树品种中表达量有差异。为进一步揭示CsCML16基因的生物学功能提供依据。