PK-15细胞的THBS3基因缺失抑制PRV复制

为探索猪血小板反应蛋白3(thrombospondin 3,THBS3)在PRV复制中的功能，利用CRISPR/Cas9系统构建THBS3基因缺失的PK-15稳定细胞株。首先，根据THBS3基因序列和CRISPR/Cas9靶点设计原则设计并合成2对sgRNA序列，退火后连接到Lenti-CRISPRv2慢病毒表达载体；与慢病毒包装质粒共转染人胚肾细胞(HEK293T)获得重组慢病毒，收集细胞上清并离心去细胞碎片后转导PK-15细胞，进行嘌呤霉素筛选获得THBS3敲除的PK-15细胞株；将重组病毒rPRV-GFP接种至野生型和缺失型细胞评价病毒复制差异。结果显示，表达sgRNA的重组质粒构建成功；将收获的慢病毒转导细胞后通过筛选获得1株无THBS3蛋白表达细胞株(PK-THBS3-KO),通过测序发现外显子3有1个碱基的插入；感染试验显示，THBS3基因缺失后抑制了PRV复制。结果表明，通过CRISPR/Cas9系统成功构建了PK-15的THBS3基因敲除的稳定细胞株，PRV感染试验显示基因缺失后抑制了病毒复制。     

白细胞介素-12对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用

犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白。利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应。为进一步提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平,本研究在小鼠体内尝试了利用白细胞介素12（IL-12）基因表达载体提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平。首先采用RT-PCR方法从小鼠脾淋巴细胞中分别扩增IL-12大亚基（P40）和小亚基（P35）cDNA基因;然后在真核表达载体pcDNA3.1A上通过引入内部核糖体进入位点（IRES）序列,分别将P40基因和P35基因插入到IRES序列的上下游,构建成IL-12（P40和P35双亚基）基因表达载体,pcDNA-P40-IRES-P35。将上述表达载体与本室构建的VP2表达载体通过磷酸钙方法转染HEK 293T细胞进行瞬时表达,以确定构建的表达载体能否介导相应基因在真核细胞中进行分泌表达。然后用VP2载体单免疫和VP2载体和IL-12载体共免疫方法对小鼠进行免疫（用pcDNA3.1A作为对照）。免疫后在特定时间通过ELISA方法检测小鼠血清抗VP2蛋白的抗体水平,并通过淋巴细胞增殖实验检测免疫后35d小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应。结果表明,扩增的小鼠IL-12P40和P35亚基基因与GenBank的参考序列基本一致。Western-blot检测结果表明,重组IL-12和VP2均能够在HEK293T细胞中进行分泌性表达。ELISA检测结果表明利用IL-2载体与VP2载体共免疫小鼠,其血清中抗VP2的抗体水平明显高于VP2载体单免疫组（P〈0.01）,抗体水平在第35天高达1：5120。淋巴细胞增殖试验结果表明,免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数均明显高于对照组（P〈0.01）,VP2载体与IL2载体共免疫组的刺激指数明显高于VP2载体单免疫组（P〈0.05）。由此可见,在小鼠体内,IL-12基因表达载体可明显提高CPV VP2基因疫苗的免疫应答水平。     

稳定表达小鹅瘟病毒VP3基因的293T细胞系构建

为构建稳定表达鹅细小病毒(goose parvovirus, GPV)VP3基因的293T细胞系,利用PCR技术扩增GPV的VP3基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1-GPV-VP3,再将其转染至293T细胞,并利用博来霉素(zeocine)进行药物压力筛选。结果表明,获得的293T细胞系能够高效表达VP3蛋白,这为小鹅瘟病毒VP3蛋白的生物学功能的深入研究以及鹅细小病毒抗体检测方法的建立提供良好的生物材料。     

CRISPR/Cas9系统敲除山羊CDK2基因载体构建及转染效率检测

细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶-2(CDK2)是细胞通过和进入S期所必须的细胞周期调节激酶,与许多癌细胞的生长有关。然而,目前在山羊上关于CDK2基因敲除及相关功能的研究尚未见报道。研究采用CRISPR/cas9系统,首先设计CDK2基因的sgRNA片段,在合成CDK2 sgRNA核苷酸序列后,构建能够同时表达sgRNA和Cas9 D10A的质粒PYSY-CDK2 sgRNA,连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,对转化子进行验证,最后转染HEK293T细胞,检测细胞荧光和细胞增殖。酶切和测序结果证明,CDK2基因敲除载体构建正确;荧光显微镜检测显示,细胞转染效率在75%以上;细胞增殖检测表明,山羊CDK2敲除质粒不会对人源细胞增殖产生影响。说明采用CRISPR/Cas9构建的载体,可为后续获得山羊CDK2基因缺失型细胞系,研究支原体肺炎感染引发的细胞凋亡分子机制提供理论依据。     

犬TfR胞外区密码子的优化、真核表达及与犬细小病毒VP2蛋白结合

为制备大量具有天然活性的犬胞外区可溶性转铁蛋白受体(sTfR),本试验通过密码子优化提高sTfR在真核细胞中的表达水平.利用RT-PCR方法从犬肝脏中扩增sTfR编码基因,依据该基因编码的氨基酸序列,参照人偏爱的密码子,对该基因进行密码子优化并由公司合成.利用peDNA3.1-CD5质粒分别构建野生型和密码子优化的sTfR基因真核表达载体,经磷酸钙介导使其在HEK293T细胞中进行表达,利用Western-blotting鉴定表达产物,通过ELISA检测重组犬sTfR蛋白与犬细小病毒VP2蛋白的结合活性.结果显示本试验扩增的犬sTfR基因与GenBank该基因序列的同源性为100%;通过在HEK 293T细胞中进行瞬时表达,结果显示密码子优化可以明显提高sTfR基因在HEK 293T细胞中的表达水平,提高了75%.同时表达的sTfR蛋白能够与犬细小病毒VP2蛋白进行特异结合,表明表达的重组sTfR蛋白具有天然活性.     

犬细小病毒YZ株VP1基因的克隆和真核表达质粒的构建

犬细小病毒(CPV)在分类上属于细小病毒科细小病毒属,可引起犬出血性腹泻和心肌炎,并使白细胞大量减少,症状和猫泛白细胞减少症相似.CPV主要编码两种结构蛋白:VP1和VP2.VP1与VP2的序列基本相同,只是VP1的氨基端比VP2多一段氨基序列,这段序列中含有T细胞识别表位,能够激发机体产生细胞免疫.研究对犬细小病毒YZ株的VP1基因进行了克隆并构建真核表达质粒,为基因免疫奠定基础.     

牛干扰素诱导跨膜蛋白基因的克隆、序列分析及表达

参照GenBank中牛干扰素诱导跨膜蛋白(bIFITMs)编码序列设计上、下游引物,通过RT-PCR技术扩增目的序列。将扩增产物连接至pMD18-T载体上,测序,使用DNAStar、DNA MAN、MEGA6.0等生物信息学软件对其进行核苷酸、氨基酸序列同源性分析以及关键位点氨基酸比对,并完成进化树的绘制。同时,将测序正确的目的序列进一步亚克隆至真核表达载体pLV-EGFP,转染HEK293T、BHK-21细胞,通过RT-PCR,蛋白免疫印迹(Western blot)验证外源基因在细胞内的表达情况。结果表明,获得bIFITMs编码序列,完成其相关生物信息学分析,同时,成功构建含有bIFITMs编码序列的重组真核表达质粒pLV-bIFITM1、pLV-bIFITM2、pLV-bIFITM3,且在HEK293T、BHK-21细胞中有效表达,为进一步探讨bIFITMs的抗病毒作用以及动物转基因抗病毒育种提供了试验基础。     

稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163的HEK293细胞系的建立

为构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)受体CD163的HEK293细胞系,本研究采用RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞(PAM)总RNA中扩增CD163基因并将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+)中,构建重组质粒pc DNA-CD163。将该重组质粒转染HEK293细胞,并利用G418筛选、纯化,获得了稳定表达CD163受体蛋白的HEK293CD163细胞系。RT-PCR、流式细胞术及western blot检测结果表明,该细胞系在传代至15代后,CD163在HEK293细胞中仍然能够稳定表达。在该细胞系中接种PRRSV后进行间接免疫荧光及噬斑试验检测表明,病毒能够通过CD163感染HEK293CD163细胞并在其中增殖。该细胞系的建立为进一步研究PRRSV的侵入细胞和致病机制提供了病毒在体外增殖的易感细胞系。     

犬细小病毒VHH抗体的文库构建、表达及其鉴定

为构建特异性犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)的纳米抗体库,并获得特异性抗CPV的重链单域抗体(Single variable domain on a heavy chain antibodies, VHH抗体),以分离鉴定的一株CPV-2c毒株(TS02株)作为免疫原免疫羊驼,四免后采集外周血,分离淋巴细胞,利用巢式PCR扩增VHH序列,通过噬菌体展示技术成功构建了纳米抗体的CPV免疫文库,进一步通过ELISA特异性筛选具有高亲和力的抗CPV纳米抗体序列。将筛选出的抗体序列插入pcDNA3.1真核表达载体构建pcDNA3.1-VHH重组质粒,采用PEI转染高密度的HEK293F悬浮细胞,瞬时表达、纯化VHH,进行鉴定。结果表明,四次免疫后羊驼血清效价高达1∶25000,达到了建库要求,构建的纳米抗体的CPV免疫文库,库容达2×10⁶ CFU/mL,文库多样性良好。通过特异性筛选获得了4株具有高亲和力和特异性的抗CPV纳米抗体序列,采用HEK293F细胞瞬时表达并纯化获得4个重组VHH,分别是CPV-VHH-H1、CPV-VHH-D4、CP...     

反转录病毒介导的稳定表达HIV-1Gag蛋白和增强型绿色荧光蛋白细胞系的建立

本研究旨在建立中国流行株人免疫缺陷病毒(HIV-1)衣壳蛋白(Gag)哺乳动物稳定表达细胞系。将HIV-1核心蛋白基因gag和增强型绿色荧光蛋白基因EGFP依次串联插入反转录病毒载体pFB-neo,构建重组反转录病毒载体pFB-gag-EGFP,并与含有辅助病毒gag-pol和env基因的质粒pVPack-GP、pVPack-10A1共转染HEK293T细胞,包装出的反转录病毒感染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白EGFP表达,验证HIV-1核心蛋白Gag表达,G418抗性筛选阳性细胞。结果表明,HIV-1核心蛋白Gag和增强型绿色荧光蛋白可在SP2/0细胞中稳定表达,HIV-1核心蛋白gag基因稳定表达细胞系成功建立,为抗AIDS治疗用基因工程制剂及靶向药物的活性检测提供了理想方法。