猪流行性腹泻病毒通过下调FBXW7拮抗宿主抗病毒天然免疫应答的研究

为研究E3泛素连接酶FBXW7与PEDV感染的相互调节作用,本研究采用PEDV感染Vero E6细胞后检测FBXW7蛋白表达水平,结果显示,PEDV感染能够抑制Vero E6细胞中FBXW7的表达水平。将pCAGGS-HAFBXW7转染Vero E6细胞,通过FBXW7过表达试验评价其对PEDV感染复制的影响,western blot检测分析结果显示,过表达FBXW7显著抑制PEDV N蛋白的表达,表明FBXW7对PEDV复制有抑制作用。进一步利用荧光定量PCR检测PEDV感染条件下过表达FBXW7对干扰素及干扰素刺激基因的影响,结果显示,与pCAGGS-HA对照组对比,pCAGGS-HA-FBXW7转染细胞IFN-β、ISG15、 ISG54和ISG56的转录水平均显著提高(p0.05),表明PEDV感染可通过下调FBXW7的表达拮抗宿主天然免疫应答促进其感染复制。本研究阐明了一种PEDV拮抗宿主天然免疫的新策略。     

PEDV感染过程中TRIM5α介导的自噬对病毒复制的影响

旨在研究三结构域蛋白5α(tripartite motif protein 5α,TRIM5α)能否通过调控细胞自噬来影响猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea viru, PEDV)在非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)中的复制。利用Western blot(WB)检测自噬标志蛋白LC3Ⅱ的表达，明确PEDV感染Vero-E6细胞后不同时间点自噬的发生情况。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测TRIM5α在自噬模型中的表达水平。设计并合成3条TRIM5α的干扰片段并筛选干扰效率最高的干扰片段，将其转染至Vero-E6细胞，PEDV感染后48 h,通过WB检测LC3Ⅱ蛋白的表达水平；RT-qPCR检测PEDV的N、ORF3基因的表达水平，同时检测PEDV滴度变化，以明确TRIM5α对自噬和PEDV复制的影响。结果表明：PEDV成功感染Vero-E6细胞并诱导细胞自噬。WB结果显示感染24、36和48 h时，试验组的LC3Ⅱ的表达量呈上升趋势，在48 h时表达量最高，且差异极显著(P<0.01),自噬被激活；RT-qPCR结果显示，TRIM5α的表...     

猪流行性腹泻病毒Nsp12与宿主RNF7蛋白相互作用的研究

猪流行性腹泻病毒(PEDV)编码的Nsp12蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性,在PEDV复制过程中发挥重要作用。为了研究与Nsp12蛋白相互作用的宿主细胞蛋白对PEDV复制的影响,本研究利用酵母双杂交技术将诱饵质粒pGBKT7-Nsp12与猪小肠绒毛上皮细胞(IECs)cDNA酵母表达文库进行杂交筛选,获得的阳性克隆经过测序鉴定证实为环指蛋白7(RNF7),将pGBKT7-Nsp12与p GADT7-RNF7进行酵母回复验证,结果显示二者共转化后能分解SD/-4/X/A中的X-α-Gal形成蓝色菌落,表明Nsp12与RNF7蛋白在酵母中存在相互作用。同时,构建p CAGGS-Nsp12-HA和p CAGGS-Flag-RNF7真核表达载体,利用针对不同标签的抗体进行正向和反向免疫共沉淀鉴定,进一步证实PEDV Nsp12蛋白与RNF7蛋白之间存在直接相互作用;激光共聚焦显微镜观察发现Nsp12蛋白和RNF7蛋白在细胞质中存在共定位现象。为了分析宿主细胞中RNF7蛋白异常表达对PEDV增殖的影响,将构建的RNF7真核表达质粒pcDNA3.1-RNF7转染LLC-PK1细胞后,再用PEDV感染过表达RNF7的LLC-PK1细胞,通过western blot检测LLC-PK1细胞中PEDV N蛋白表达量,荧光定量PCR检测PEDV N基因转录水平,采用TCID50方法检测病毒滴度,结果显示,过表达RNF7后LLCPK1细胞内PEDV N蛋白表达量和N基因拷贝数均下降,其子代病毒滴度也明显低于正常对照组,表明过表达RNF7蛋白可以抑制PEDV的增殖。而利用si RNA-178敲低宿主细胞内源性RNF7蛋白的表达,再以MOI 0.01的PEDV感染后,对感染后不同时间的细胞样品进行western blot检测和病毒滴度检测,结果显示在PEDV感染后24 h,细胞内PEDV N蛋白表达量明显增加,PEDV的滴度在感染后18 h和24 h时分别是对照组的1.10倍和1.17倍。本研究结果首次证实了宿主细胞中RNF7蛋白表达对PEDV的复制发挥负调控作用,为深入探究PEDV复制调控的分子机制奠定了基础。     

长链非编码RNA在PEDV感染Vero-E6细胞中对自噬的调控作用

【目的】 试验旨在研究长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea viru，PEDV)感染非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)过程中对自噬的调控作用，以期为抗PEDV新型药物靶点的开发提供新思路。【方法】 根据GenBank上公布的人lncRNA-HOTAIR基因序列(登录号:NR_047517.1)，利用LongMan在线工具筛选lncRNA-HOTAIR的猴源同源序列(lncRNA-M)，并利用RNAfold、LncLocator在线预测工具预测其二级结构和核质分布。建立PEDV感染的Vero-E6细胞模型，在0、6、12、24、36和48 h收集细胞，利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测微管相关蛋白1-轻链3(LC3)蛋白的表达，以明确病毒感染细胞后不同时间点自噬的发生情况。通过实时荧光定量PCR检测lncRNA-M在PEDV感染Vero-E6细胞模型中0、6、12、24、36和48 h的表达水平。设计并合成3条lncRNA-M的干扰片段:siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3，分别转染Vero-E6细胞，待细胞汇合度达到90%时接毒，感染48 h后利用实时荧光定量PCR检测lncRNA-M的表达情况，筛选出干扰效率最高的干扰片段。将干扰效率最高的干扰片段转染至Vero-E6细胞并接种PEDV后，通过Western blotting检测感染后24和48 h LC3蛋白的表达水平，以验证自噬的发生情况。【结果】 成功筛选出lncRNA-HOTAIR猴源同源序列为lncRNA 0.1，并根据RNAfold预测结果生成lncRNA 0.1的RNA最小自由能二级结构;LncLocator预测结果表明，lncRNA 0.1在细胞核和细胞质中的分布分别为41.88%和37.78%。PEDV感染Vero-E6细胞48 h后，细胞皱缩、聚集成团，细胞膜融合形成合胞体;1.0%琼脂糖凝胶电泳结果显示，在1 326 bp处出现目的条带，说明PEDV感染Vero-E6细胞模型成功建立。在PEDV感染的Vero-E6细胞模型中，Western blotting结果显示，6、12、24、36和48 h LC3Ⅱ的表达量呈上升趋势，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值在48 h最高且极显著高于0 h (P<0.01);实时荧光定量PCR结果显示，LC3的mRNA表达量在48 h最高，且极显著高于0 h(P<0.01)，自噬被激活;lncRNA 0.1的表达均呈上升趋势，在48 h表达量最高，48 h lncRNA 0.1的表达量极显著高于0 h (P<0.01);siRNA-2的干扰效果最好，干扰效率为80%。干扰lncRNA 0.1后，Western blotting结果显示，24和48 h干扰组的LC3蛋白表达量均低于对照组，自噬受到抑制。【结论】 PEDV感染Vero-E6细胞能够诱导自噬发生，lncRNA 0.1在感染过程中起到了促进自噬的作用。     

猪流行性腹泻病毒诱导Vero E6细胞凋亡的动态研究

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)诱导体外细胞产生病变及细胞凋亡的动态变化,本研究应用western blot、间接免疫荧光、细胞活性计数(CCK-8)等方法检测PEDV感染Vero E6细胞后不同时间点细胞内病毒含量、细胞活性、凋亡小体的形成,以及相关凋亡因子的变化。结果表明,感染后24 h细胞内病毒含量开始明显升高,48 h时达到峰值。同时在病毒感染24 h后出现明显的细胞病变,感染48 h后出现典型的凋亡特征,细胞聚堆,细胞核内染色质固缩,形成凋亡小体。CCK-8分析检测结果显示,与对照组相比感染病毒细胞活性明显降低。另外,western blot结果表明促凋亡因子蛋白水解酶Caspase-3在病毒感染过程中被活化。该研究结果进一步证实了PEDV感染可以诱导细胞凋亡,其中Caspase-3的激活在病毒诱导细胞凋亡的过程中发挥重要作用。     

猪流行性腹泻病毒NSP1蛋白在细胞器中定位特性

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)非结构蛋白1(NSP1)在Vero E6细胞中的分布和亚细胞定位情况,本研究采用RT-PCR方法扩增NSP1基因,并将其克隆至真核表达载体pAcGFP-C1中构建重组质粒pAcGFPNSP1。将pAcGFP-NSP1转染至Vero E6细胞中进行瞬时表达,并收集转染后48 h的细胞进行western blot检测。通过激光共聚焦显微镜观察NSP1在细胞中的定位情况。结果表明,NSP1在Vero E6细胞中表达,其主要定位于细胞质中,与细胞中的线粒体、内质网、高尔基体均呈现高度共定位。本研究在Vero E6细胞中表达了PEDV NSP1蛋白,并首次对其亚细胞定位进行了解析,为进一步了解病毒的复制及其致病机制的研究提供了依据。     

甘露糖-6-磷酸/胰岛素样生长因子Ⅱ受体介导PEDV感染作用的初步验证

为进一步研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染细胞的机制,本研究利用病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)和质谱(MS)技术筛选细胞内与PEDV相互作用的蛋白,初步鉴定细胞内源性蛋白甘露糖-6-磷酸/胰岛素样生长因子II受体(M6P/IGF2R)为候选蛋白。结果证实M6P/IGF2R蛋白与PEDV S2蛋白相互作用且在细胞内存在共定位现象,过表达M6P/IGF2R能够促进PEDV增殖,干扰M6P/IGF2R能够抑制PEDV增殖。PEDV S2蛋白通过与宿主细胞M6P/IGF2R蛋白互作促进PEDV侵入细胞,该结论为进一步开展PEDV与宿主细胞蛋白相互作用机制研究提供了重要理论依据。     

猪流行性腹泻病毒感染Vero-E6细胞诱导凋亡机制的研究

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)诱导体外细胞凋亡的机理,本研究利用荧光定量PCR方法结合流式细胞术检测PEDV感染Vero-E6细胞后凋亡分子的变化情况.荧光定量PCR结果表明,抑制细胞凋亡因子Bcl-2在PEDV感染后基因转录水平迅速升高,在24 h达到峰值后被抑制;而促凋亡因子的蛋白水解酶caspase8和caspase3在PEDV感染后基因转录水平也随之提高,在48 h达到峰值.流式细胞术结果表明PEDV感染细胞48 h后促凋亡分子中的蛋白水解酶Caspases被活化.该研究结果揭示了PEDV感染细胞能够拮抗细胞存活信号通路,引起细胞凋亡,其中凋亡调节因子Bcl-2、caspase3和caspase8在细胞凋亡发生过程中起关键作用.     

猪流行性腹泻病毒中和抗体PC10-IgG重组腺病毒的构建及其抗病毒效果的研究

为研制用于治疗仔猪PED的制剂,本研究将PEDV中和抗体PC10-IgG基因序列整合至人5型腺病毒(Ad5)骨架质粒中,构建的重组质粒经转染构建重组腺病毒Ad5-PC10-IgG。通过ELISA检测Ad5-PC10-IgG感染HEK293细胞的上清,以及采用SDS-PAGE、western blot检测上清中纯化的IgG,结果显示Ad5-PC10-IgG感染HEK293细胞能够分泌表达PC10-IgG,且该抗体效价较高。又将分泌表达的PC10-IgG进行了PEDV病毒结合试验[间接免疫荧光试验(IFA)]和病毒抑制试验(荧光定量PCR和IFA)。结果显示Ad5-PC10-IgG分泌表达的PC10-IgG不仅对PEDV具有良好的结合活性还能显著抑制PEDV感染Vero E6细胞。将Ad5-PC10-IgG感染猪小肠类器官模型肠小体,通过ELISA检测其感染后上清以及IFA检测感染的肠小体,结果表明Ad5-PC10-IgG可以感染肠小体并分泌表达PC10-IgG。将Ad5-PC10-IgG接种小鼠,ELISA方法检测采集的小鼠血清与肛拭子,并采用前述方法检测小鼠血清中的PC10-IgG对PEDV的结合活性及病毒抑制效果。结果显示,在接种后的第1 d、3 d、5 d的小鼠血清中均有较高含量的PC10-IgG,但在其肛拭子中没有检测到PC10-IgG,且该PC10-IgG对PEDV具有很好的结合活性和抑制其复制的效果。以上结果表明Ad5-PC10-IgG能够在体外与小鼠体内分泌表达有活性的中和抗体PC10-IgG。本研究为后续Ad5-PC10-IgG接种猪的试验以及研发PED治疗性抗体制剂奠定基础。     

猪STING多克隆抗体的制备及应用研究

干扰素基因刺激因子(STING)是天然免疫信号通路环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cGAS)-STING中重要的衔接蛋白,它能够识别细胞内第二信使环磷酸鸟苷-腺苷(c GAMP),激活I型干扰素(IFN-I)的表达。为了制备猪STING(pSTING)多克隆抗体(ppSTING)并对其初步应用,本研究利用PCR方法扩增pSTING基因构建重组表达质粒pGEX-6p1-pSTING,转化大肠杆菌BL21(DE3)并经IPTG诱导后经SDS-PAGE和western blot方法鉴定GSTpSTING蛋白(rpSTING)的表达;利用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析方法纯化rpSTING并免疫新西兰大白兔制备ppSTING,经Protein G亲和层析介质纯化后分别采用SDS-PAGE鉴定纯化的ppSTING。结果显示rpSTING以可溶形式表达,分子质量约为52.5 ku。SDS-PAGE结果显示,制备的ppSTING包含重、轻链且纯度较好。将ppSTING分别应用于western blot、间接免疫荧光试验(IFA)检测外源表达及CRL-2843细胞中内源表达的pSTING;将其应用于Co-IP试验检测ppSTING与外源表达pSTING的相互作用;将其应用于激光共聚焦试验检测cGAMP刺激后的PK-15细胞中内源表达的pSTING与AP-1在该细胞中的共定位;将其应用于western blot检测ASFV感染后PAMs中的pSTING蛋白。Western blot和IFA结果显示,制备的ppSTING能特异性地识别HEK293T细胞中过表达及CRL-2843细胞中内源表达的pSTING蛋白;Co-IP结果显示,ppSTING与pSTING蛋白存在相互作用;激光共聚焦试验结果显示,ppSTING可用于检测PK-15中内源表达的pSTING蛋白且在cGAMP刺激后的PK-15细胞中的pSTING能够与AP-1定位于高尔基体。Western blot结果显示,ppSTING能够与未感染ASFV的PAMs中内源表达的pSTING蛋白反应,且在ASFV感染PAMs 24 h后pSTING蛋白的表达量增加。上述结果表明,本研究制备了ppSTING并且证实其可以用于宿主天然免疫方面的应用研究。本研究为探究pSTING蛋白的生物学功能以及cGAS-STING信号通路奠定了基础。     

细胞糖酵解对猪流行性腹泻病毒复制的影响

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染细胞后,细胞糖酵解的变化及其对PEDV复制的影响,本试验通过实时荧光定量PCR和Western blot检测PEDV感染猪小肠上皮细胞IPEC-J2后36 h糖酵解相关酶己糖激酶2(HK2)的表达水平,然后通过添加糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)来进一步验证细胞糖酵解对PEDV复制的影响,最后检测了正常浓度葡萄糖(5.5 mmol/L)和高浓度葡萄糖(11.1 mmol/L和22.2 mmol/L)培养条件下PEDV复制情况来探究葡萄糖浓度对PEDV复制的影响。结果表明,PEDV感染显著增加糖酵解限速酶HK2的表达,PEDV感染可增强IPEC-J2细胞的糖酵解,细胞糖酵解水平增强有利于PEDV的复制。在一定范围内提高葡萄糖浓度可促进PEDV复制。研究结果为初步阐明PEDV感染机制以及冠状病毒病的综合防控提供了理论依据。     

马传染性贫血病毒诱导马胎皮细胞发生自噬的研究

为研究马传染性贫血病毒(EIAV)感染对马胎皮细胞(FED)自噬的影响,本研究将EIAV感染FED以及过表达GFP-LC3的FED细胞,进行自噬现象的检测。结果显示,通过电镜观察到EIAV感染组细胞出现典型的双层膜结构的自噬小体,western blot检测到EIAV感染组细胞的LC3-II的表达量显著升高,通过激光共聚焦显微镜观察到EIAV感染的过表达GFP-LC3的FED细胞有明显的绿色荧光聚集。上述结果表明EIAV感染FED细胞后可以显著诱导FED细胞发生自噬。该研究结果为进一步研究自噬对EIAV复制和感染的调控奠定基础。     

Dermcidin促进猪流行性腹泻病毒复制的研究

猪流行性腹泻病(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种高度传染性的猪胃肠道疾病，可导致哺乳仔猪产生急性水样腹泻，造成严重的经济损失。为调查抗菌肽Dermcidin(DCD)对PEDV复制的影响，本研究利用Western blot、荧光定量PCR(RT-qPCR)以及测定病毒半数组织细胞感染量TCID₅₀等方法，通过检测在DCD的作用下PEDV在细胞中的基因转录、蛋白表达和病毒滴度的水平，并利用Western blot检测信号通路中蛋白表达水平，探究其作用的分子机制。研究表明，DCD能够参与PEDV感染；DCD过表达促进了PEDV在Vero细胞和LLC-PK1细胞中的复制，而敲低DCD抑制了PEDV复制；DCD通过诱导PTEN表达来抑制Akt-mTOR-p70S6K通路相关蛋白位点的磷酸化，从而介导自噬促进PEDV复制。研究DCD对PEDV复制的作用机制，对今后PEDV防治工作有重要参考意义。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白诱导内质网应激的研究

内质网应激(ERS)在病毒感染中发挥着重要作用,S蛋白是猪流行性腹泻病毒(PEDV)最大的结构蛋白,在病毒感染过程中最有可能诱导ERS。为探究PEDV S蛋白是否诱导ERS和激活非折叠蛋白反应,本研究构建了PEDV S蛋白全长的重组真核表达载体pcDNA-S,将其通过脂质体转染Vero-E6细胞检测ERS标志蛋白和相关信号通路的变化情况。结果表明,S蛋白诱导了ERS标志蛋白Grp78的表达增加并且二者之间具有共定位,进一步研究显示其主要激活非折叠蛋白反应的PERK通路,药物Salubrinal特异性增强PERK通路后抑制了病毒的复制。本研究揭示PEDV S蛋白在病毒感染诱导的ERS中具有重要作用,将有助于深入了解PEDV致病的分子机制。     

荧光定量RT-PCR对猪流行性腹泻病毒在仔猪体内分布规律的研究

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)在感染仔猪各主要器官中的增殖和分布情况,本研究根据PEDV N基因和宿主细胞GAPDH基因建立荧光定量RT-PCR法,并以该方法检测各个发病期的哺乳仔猪各器官内PEDV的病毒载量。结果表明,仔猪感染PEDV后,在49 h~72 h出现典型的猪流行性腹泻症状,肠、肠系膜淋巴结、肺等器官出现严重病变。利用本研究建立的检测方法在仔猪体内肠、肠系膜淋巴结、肺、脾、肾、心、肝这些器官中均可以检测到PEDV;其中肠、肠系膜淋巴结、肺中病毒载量最高,而且感染时间早、持续时间长。研究表明,PEDV的感染呈持续性、多脏器性,并对肠和肺有组织嗜性;结合本实验室前期的病理研究,推测其在消化器官、呼吸器官中增殖能够导致功能细胞的损伤,在免疫器官的增殖能够造成免疫抑制和混合感染。本研究为PEDV的感染特性、定植规律和致病机理的研究及分子生物学检测方法的建立奠定了基础。     

稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163的HEK293细胞系的建立

为构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)受体CD163的HEK293细胞系,本研究采用RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞(PAM)总RNA中扩增CD163基因并将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+)中,构建重组质粒pc DNA-CD163。将该重组质粒转染HEK293细胞,并利用G418筛选、纯化,获得了稳定表达CD163受体蛋白的HEK293CD163细胞系。RT-PCR、流式细胞术及western blot检测结果表明,该细胞系在传代至15代后,CD163在HEK293细胞中仍然能够稳定表达。在该细胞系中接种PRRSV后进行间接免疫荧光及噬斑试验检测表明,病毒能够通过CD163感染HEK293CD163细胞并在其中增殖。该细胞系的建立为进一步研究PRRSV的侵入细胞和致病机制提供了病毒在体外增殖的易感细胞系。     

两性霉素B对猪流行性腹泻病毒入胞的抑制作用研究

通过测定两性霉素B(amphotericin B,AmpB)的细胞毒性、半数抑制浓度以及利用Western blot、间接免疫荧光、空斑形成、内吞等试验方法探究AmpB对猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染的抑制作用及其分子机制。结果显示：20μmol/L浓度范围内,AmpB对Vero-E6和Marc145细胞毒性极低;在Vero-E6细胞,AmpB对PEDV HLJBY和CV777毒株的半数抑制浓度(IC₅₀)分别为0.5和0.3μmol/L,在Marc145细胞,AmpB对HLJBY和CV777的IC₅₀均为0.3μmol/L;AmpB处理几乎能阻断病毒感染细胞;AmpB主要抑制PEDV入胞和细胞巨胞饮作用。本研究为研制抑制PEDV或广谱抑制冠状病毒药物提供了新线索。     

猪肠道组织RIG-I的表达及其在猪传染性胃肠炎病毒致病机制中作用的初步研究

为探究天然免疫分子维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-I)在猪肠道组织中的表达情况，评价其在猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)致病机制中的作用。本研究经原核表达重组RIG-I蛋白(rRIG-1)并采用SDS-PAGE切胶纯化该蛋白，将其免疫大白兔制备兔RIG-I多克隆抗体，采用间接ELISA检测抗体效价。结果显示获得了效价可达1∶64 000的兔RIG-I多克隆抗体。利用该抗体经western blot检测SPF猪各肠道组织中RIG-I的表达。结果显示，制备的多克隆抗体可与猪各肠道中的RIG-I反应，且RIG-I在SPF猪空肠中的表达量最高。利用该抗体经western blot检测TGEV感染的ST细胞及猪空肠中RIG-I的表达水平。结果显示，TGEV感染后ST细胞中RIG-I的表达水平极显著高于空白对照细胞(P<0.01)；与正常SPF猪空肠相比，TGEV感染的SPF猪空肠组织中RIG-I蛋白的表达水平明显提高。表明TGEV感染后能够刺激细胞内源性及感染猪肠道组织中RIG-I蛋白的表达水平。将本研究构建的重组质粒p CAGGS-RIG-I-flag和RIG-I干扰RNA (siRIG-I)分...     

猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导细胞自噬并增强病毒复制的研究

为研究猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)感染细胞是否诱导自噬及自噬对病毒复制的影响,本研究将SADS-CoV (MOI 0.1)接种Vero E6细胞培养36 h后,经透射电子显微镜观察可见,SADS-CoV感染的细胞中出现了包裹胞浆的自噬体样双层膜结构,证实SADS-CoV可以诱导Vero E6细胞发生自噬。构建pEGFP-LC3的真核表达质粒并经双酶切及测序鉴定正确后转染Vero E6细胞,24 h后以SADS-CoV感染,24 h后经激光共聚焦显微镜观察可见,与阴性对照组细胞相比,感染SADS-CoV的细胞出现绿色荧光的点状聚集。进一步将SADS-CoV(MOI 0.1)感染Vero E6细胞不同时间后通过western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和p62表达水平的变化,结果显示,与阴性对照组相比,SADS-CoV感染组LC3-Ⅱ的表达水平升高,LC3-Ⅱ/GAPDH比值呈上升趋势,而p62蛋白表达水平则显著降低(P<0.05),表明SADS-CoV感染能够诱导Vero E6细胞产生完整的自噬应答。为了探究自噬对病毒复制的影响,本研究分别采用自噬抑制剂3-...     

猪流行性腹泻病毒N蛋白与Vero E6核仁蛋白Fibrillarin的亚细胞定位分析

为鉴定猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N)与Vero E6细胞核仁fibrillarin蛋白的亚细胞定位的特征.本实验参照GenBank中人细胞fibrillarin基因(M59849.1)序列,设计并合成特异性引物,利用RT-PCR方法扩增了Vero E6细胞的fibrillarin基因,并将其克隆于真核表达载体pDsRed2-N1中,构建重组质粒pDsRed-Fib.将pDsRed-Fib与本实验室构建的含有PEDV N基因的重组质粒pAcGFP-N,共转染Vero E6细胞.Western blot结果表明fibrillarin及N融合蛋白在转染的Vero E6细胞中均获得表达;利用共聚焦显微镜观察显示在共转染Vero E6细胞中PEDV N蛋白与Vero E6细胞核仁中的fibrillarin发生共定位.该结果为进一步研究PEDV和核仁蛋白相互作用奠定基础.