基于EST数据库的葡萄APETALA2基因cDNA克隆及其表达分析

APETALA2(AP2)是拟南芥生长发育特别是花器官发育过程中重要的调控基因。利用生物信息学方法以拟南芥APETALA2基因cDNA序列作为模板,对葡萄EST数据库进行同源检索筛选,电子克隆出葡萄AP2基因(Vv-AP2)cDNA序列。以香悦葡萄花cDNA为模板,根据电子克隆的葡萄AP2基因cDNA序列设计特异引物,分别利用RACE技术和特异PCR技术获得该基因3’末端和5’末端,序列拼接后获得葡萄的APETALA2基因的cDNA全长。该cDNA的全长为2 208 bp,命名为Vv-AP2。Vv-AP2核苷酸序列有一个1 536 bp完整的开放读码框(ORF),其5’与3’末端非翻译区分别为268 bp和376 bp。其中,3’末端含有28 bp的Ploy+(A)。该基因在GenBank基因数据库的注册号为FJ809943。氨基酸推导结果表明该cDNA共编码了511个氨基酸,具备完全保守的核定位信号序列(KKSR)以及2个高度保守的重复序列即AP2结构域。分别采用半定量RT-PCR和SYBR Green I实时定量RT-PCR初步分析了Vv-AP2在葡萄叶、茎、花序、花等不同器官中的表达水平。其中,Vv-AP2在花序和花中的表达量明显高于叶和茎。     

基于EST 数据库的葡萄成花途径的预测及分析

 以拟南芥成花途径相关基因序列为探针,对葡萄EST 数据库进行同源检索筛选,获得相应 的同源EST 序列,并以葡萄不同发育时期的不同器官cDNA 为模板,通过半定量RT-PCR 反应研究了葡 萄成花途径相关基因的存在与表达情况,对葡萄成花途径的进行了分析与判断。研究发现,葡萄成花途 径中的基因在不同器官中的不同时期的时空表达存在强弱的差异。     

低温胁迫下佛手和枳乙烯应答因子6（ERF6）表达变化的比较分析

 以柑橘属寒敏感植物佛手‘青皮’品种叶片cDNA为模板,通过RT-PCR与RACE扩增,获得一个1 160 bp的乙烯应答因子（ethylene response factor,ERF）基因的cDNA序列,其基因编码区共999 bp,含有一个保守的AP2/EREBP结构域,与拟南芥AtERF6为同源基因,命名为CmsERF6（GenBank登录号为HQ698835）。4 ℃低温处理佛手和枳（柑橘属近缘种耐寒植物）植株,测定其寒胁迫生理指标（电解质渗出率、丙二醛含量）。使用实时荧光定量PCR,对佛手和枳叶中的ERF6表达含量进行测定分析,结果表明：低温对佛手与枳的ERF6表达均具有诱导作用,且表达量的变化趋势存在明显的差异。尤其在枳中,ERF6的表达较对照组上升约4 000倍,且电解质外渗率的变化与ERF6基因表达量变化具有一致性,说明ERF6基因参与低温胁迫应答。     

日本晚樱花器官特征基因ClAP1的克隆与表达分析

用同源克隆的方法和3′ RACE技术,从日本晚樱（Prunus lannesiana）中克隆得到了1个AP1同源基因ClAP1的cDNA全长。其cDNA全长1 005 bp,包括1个编码238个氨基酸共717 bp的开放阅读框。序列比对和分子系统发生分析表明,ClAP1是拟南芥的AP1同源基因,其蛋白质的C末端具有一个保守的euAP1模体。半定量RT-PCR分析表明,ClAP1在3个日本晚樱品种‘大岛’、‘一叶’和‘普贤像’的萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊中均有表达,在叶中不表达,属参与花发育的转录因子,但其表达模式与拟南芥的AP1有一定差别。     

香蕉抗逆相关基因MaERF的克隆与表达分析

 根据已获得的AP2/ERF基因片段,通过RACE方法获得一个香蕉ERF基因完整编码区序列,命名为MaERF。该基因cDNA全长1 611 bp,其中开放阅读框1 128 bp,编码376个氨基酸,包含一个保守的AP2/ERF结构域,基因组序列全长2 881 bp,含有一个内含子,剪切位点符合“GT-AG”规则;系统进化树表明该基因属于植物ERF转录因子家族的B2亚群。半定量RT-PCR分析表明,该基因在香蕉各个器官中均有表达,其中在根和叶中的表达量较低,而在果实和花中的表达较高;实时荧光定量Real-time PCR检测表明,受尖孢镰刀菌侵染及低温胁迫后,香蕉中该基因表达明显上调,推测其在香蕉胁迫反应中可能发挥重要作用。     

三七RNase-like 基因的克隆及表达分析

 采用同源序列克隆法,结合RACE 技术,从三七[Panax notoginseng（Burk.）F.H]根茎总RNA 中克隆次生代谢相关差异表达RNase-like 贮藏蛋白的编码序列,并进一步以DNA 为模板扩增全长基因, 获得一条开放阅读框为717 bp 的cDNA 序列,命名为PMP（GenBank,KC751542),相应基因全长1 074 bp。序列及其进化分析表明,该基因包含3 个外显子和2 个内含子,编码238 个氨基酸,相应蛋白质的 分子量为27.47 kD,含有核苷酸结合的保守区域,属于RNase-T2 超家族成员。三七PMP 蛋白与人参 RNase-like 贮藏蛋白高度同源,序列相似性达95%。实时荧光定量PCR 研究表明,三七PMP 基因在其根、 茎、叶、花等器官中均有表达,且3 年生根中表达量最高,暗示该基因可能参与三七皂苷次生代谢调控 及其品质形成。     

牡丹ACC氧化酶基因cDNA克隆及全序列分析

 以牡丹品种‘洛阳红’（Paeonia suffruticosa 'Luoyang Hong'）花瓣为材料,用CTAB法提取总RNA,根据已报道的ACC氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase,ACO）保守氨基酸序列设计简并引物,通过RT-PCR扩增得到1条821 bp的牡丹ACO基因同源片段。利用该已知中间序列,通过快速扩增cDNA末端技术(Race)及序列拼接,最终得到该基因cDNA全长序列,命名为Ps-ACO1,GenBank登录号为DQ337251。分析结果表明,Ps-ACO1 cDNA全长1 221 bp,包含一个939 bp的开放读码框,5'非翻译区长65 bp,3'非翻译区长117 bp,编码产物为含有312个氨基酸残基的蛋白质。氨基酸序列与烟草、苹果、桃等植物的ACO同源性都达80%以上。     

番木瓜肌动蛋白CpActin基因的克隆及其在果肉中的表达

以番木瓜果肉为试材,提取总RNA,反转录为双链cDNA。采用cDNA末端快速扩增方法(RACE),获得了番木瓜果肉Actin基因的全长cDNA序列,将其命名为CpActin,Genbank登录号为FJ696416。CpActin全长cDNA为1533bp,含有一个1134bp的开放阅读框,编码377个氨基酸,与毛白杨、葡萄、水稻、拟南芥的Actin同源性分别为98.94%、98.67%、96.29%、94.69%。利用邻接法构建了部分高等植物、哺乳动物和真菌的Actin系统进化树,结果表明番木瓜与葡萄的Actin进化距离最小。采用半定量RT-PCR技术分析CpActin基因在不同成熟度番木瓜果实中的表达情况,发现该基因的表达水平没有明显差异,表明CpActin基因可以作为内参,进行番木瓜其他果实基因差异表达的研究。     

马铃薯GLDH基因的克隆及序列分析

 以马铃薯品种‘Favorita’叶片中的cDNA为模板,采用RT-PCR、巢式PCR、3′RACE和5′RACE技术,获得了L–半乳糖酸–1,4–内酯脱氢酶（EC 1131213,GLDH）基因cDNA 2 563 bp的全长序列,命名为StGLDH（GenBank：FJ755844）。序列分析表明,该基因编码区长1 773 bp,编码590个氨基酸,与其他植物GLDH氨基酸序列具有很高的同源性,尤其与番茄、辣椒、烟草GLDH 氨基酸序列具有90.6% ~ 95.9%的同源性。荧光定量分析表明,该基因在马铃薯不同器官中均有表达,在幼叶和功能叶中表达量最高,在茎中表达量最低;除匍匐茎外,其它器官中抗坏血酸（ascorbic acid,AsA）含量与StGLDH的表达高度一致。     

藤稔’葡萄VvGAI基因的克隆、亚细胞定位及时空表达分析

 以‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera × V. labrusca‘Fujiminori’）的茎、叶、花和果为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆获得1个推测为葡萄赤霉素响应因子VvGAI基因的cDNA序列,全长2 295 bp,其编码590个氨基酸。该基因在GenBank基因数据库的登录号为HQ834311。序列分析表明：VvGAI与杨树、拟南芥、水稻的同源基因的氨基酸序列相似性分别为68.56%、62.79%和54.16%。半定量与定量PCR结果都表明,VvGAI在葡萄茎尖、叶、花和果等营养与生殖器官中均有表达,但在茎尖中的表达最高,是一个与快速生长和分裂关系密切的基因。50 mg · L^-1赤霉素处理后,各阶段果实中VvGAI表达量趋势与对照基本一致,但水平低于对照,其中幼果中表达量最高。洋葱表皮细胞的瞬时表达显示,VvGAI蛋白定位于细胞核。     

柑橘酸性转化酶基因片段的克隆

分析植物液泡和细胞壁转化酶基因的保守区序列，分别设计一对PCR引物，以柑橘基因组DNA为模板，采用PCR方法分别扩增出长约740 bp和530 bp的DNA片段，分别克隆入pBS－T 和pMD18－T载体，进行测序，结果表明，获得柑橘酸性转化酶基因家族的两个成员，成员A和B基因片段分别长742 bp和524 bp。其序列已在GenBank中登记（登记号分别为AF014925和AF314197）。在GenBank中进行同源性检索，结果表明，成员A编码的氨基酸与植物液泡酸性转化酶的氨基酸同源性较高，与拟南芥的最高，达76％，而成员B编码的氨基酸与植物细胞壁酸性转化酶的氨基酸同源性较高，与豌豆的最高，达71％。两成员核苷酸和氨基酸序列同源性分别为55％ 和50％，推测酸性转化酶基因成员A 和B编码的蛋白分别定位于液泡和细胞壁。     

百子莲开花相关基因ApFT的克隆及表达分析

采用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）方法得到了百子莲（Agapanthus praecox ssp. orientalis）FT基因cDNA全长序列,命名为ApFT,GenBank登录号为KC951108。序列分析表明,百子莲ApFT基因cDNA全长815 bp,其中开放阅读框534 bp,编码177个氨基酸,5′非编码区（5′UTR）和3′非编码区（3′UTR）分别为89 bp和192 bp。ApFT编码的蛋白有一个单一而非常保守的PEBP（Phosphatidylethanolamine-binding protein,PEBP磷酸乙醇胺结合蛋白）结构域,与玉米（MFT2）、拟南芥（AtFT）和温州蜜柑（CuMFT1）等植物的FT蛋白有较高的相似性,同源性均在50%以上。系统进化树分析表明,百子莲ApFT与玉米（MFT2）聚类关系最近。实时荧光定量qRT-PCR结果显示,整个花芽分化过程中ApFT在叶片中表达量高,茎尖中表达量低。随着花芽分化的进程,在叶片中ApFT表达量逐渐降低,而茎尖中ApFT的表达量在诱导期均高于营养期和花芽分化期,推测该基因可能在调节百子莲花芽分化过程中发挥重要作用。     

柑桔LEAFY同源基因片段分离及特性研究

 根据不同植物LEAFY ( LFY) 同源基因3’端序列高度保守性, 设计合成简并引物, 采用PCR 技术首次从柑桔基因组DNA 中分离出一条长883 bp 的柑桔LFY 同源基因( csLFY) 片段。序列分析表明, 所扩增的883 bp DNA 片段中包含一个长476 bp 的内含子, 拼接位点与其他植物的LFY 同源基因一致。由外显子推导的氨基酸序列与其它植物LFY 同源基因的相应区域氨基酸序列同源性为77 %～97 % , 其中与烟草NFL 和矮牵牛ALF 的同源性最高, 达到97 %。RT—PCR 研究表明, csLFY 在柑桔成年结果枝上的花芽和营养芽以及童期幼苗的营养芽中均有表达, 但童期营养芽中的表达强度明显低于花芽。     

白菜GLDH 基因cDNA的克隆及序列分析

 以白菜品种‘苏州青’ cDNA 为模板, 采用RT-PCR、巢式PCR、3’RACE和5’RACE技术, 获得了L - 半乳糖酸- 1, 4 - 内酯脱氢酶(EC 1.3.2.3, GLDH) 基因cDNA 2 034 bp全长序列。序列分析表明, GLDH基因cDNA序列编码601个氨基酸。其氨基酸序列与花椰菜GLDH基因具有98%的同源性, 与拟南芥GLDH基因具有90%的同源性。该基因在GenBank中登录号为AY899298。     

葡萄赤霉素受体基因VvGID1A 的分离、亚细胞定位及表达分析

 以‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera × V. labrusca‘Fujiminori’）的花序、茎尖、叶片以及果实为 试材,应用RT-PCR 结合RACE 技术克隆得到GID1A 同源基因全长cDNA 序列,命名为VvGID1A（基因 登录号：JQ669511）,全长1 681 bp,含有1 个1 035 bp 的开放阅读框,编码344 个氨基酸,该氨基酸序 列还包含两个激素敏感酯酶家族保守的结构域HGG 和GXSXG。系统进化分析表明,VvGID1A 与蒺藜苜 蓿、棉花和拟南芥之间的一致性分别为70.25%、70.08%和68.21%。荧光定量RT-PCR 结果表明,VvGID1A 在葡萄花序、老叶和卷须中表达水平高于茎尖和幼叶,而在GA 处理果实中的表达水平低于未处理的对照 样品。瞬时表达载体的构建及洋葱表皮细胞转化后,洋葱表皮细胞的瞬时表达结果显示,该基因的表达 产物定位在细胞核上。     

薄壳山核桃MADS-box基因CiMADS9的克隆与功能分析

以薄壳山核桃（Carya illinoinensis）‘马罕’雄花为材料,利用获得的MADS-box基因保守片段设计特异引物,通过RACE技术克隆MADS-box家族基因的cDNA序列,命名为CiMADS9。该基因长为1 077 bp,开放阅读框（ORF）768 bp,编码255个氨基酸残基。生物信息学分析表明该基因具有典型的MADS-box结构域和半保守的K区,是MIKC型MADS-box基因。聚类分析分析表明该基因属于AGL15亚家族。实时荧光定量PCR结果表明,CiMADS9在生殖器官（雄花、雌花、幼果）中的表达量高于营养器官（叶、枝条）中的,并且在雄花中的表达量最大。将目的基因通过农杆菌介导法转化拟南芥,获得了转基因植株。与对照相比,转基因拟南芥中过量表达该基因使植株开花延期,基生叶增加。     

菜薹花芽分化及BrcuFLC基因的克隆与表达

通过制作石蜡切片研究了菜薹(Brassica campestris L. ssp. chinensis (L.) Makino var. utilis Tsen et Lee)早熟品种‘油青49’和晚熟品种‘油青甜菜心80天’的花芽分化过程,结果表明,当展开2~3片真叶时花芽分化开始启动。用已报道的拟南芥Flowering locus C (FLC) 基因和FRIGIDA (FRI) 基因的保守区域设计引物,通过RT-PCR的方法从两个菜薹品种中均克隆得到了两个决定开花的关键基因,并命名为BrcuFLC (GenBank登录号为EF138603)和BrcuFRI (GenBank登录号为EU700362)。半定量式RT-PCR表达分析表明, BrcuFLC基因在早、晚熟菜薹品种的不同发育时期表达存在差异,表达量随真叶数增加而逐步减少,但在晚熟品种中BrcuFLC表达量降低幅度小;BrcuFRI则在早、晚熟品种的所有阶段表达都较低。BrcuFLC在菜薹不同部位表达的情况不同,在茎、叶中的表达强,花次之,根中表达较弱;而BrcuFRI在早、晚熟品种根中的表达量明显高于其它3个部位。     

香蕉泛素结合酶基因与果实成熟关系的研究

根据香蕉果实采后早期成熟的抑制缩减杂交文库获得的香蕉泛素结合酶基因片段,从香蕉（Musa acuminate L. AAA group‘Brazilian’）果实中克隆了泛素结合酶基因的cDNA全长,命名为MaUCE1。该cDNA全长890 bp,编码152个氨基酸。BlastX分析表明,该基因所推导的氨基酸序列与烟草（BAB40310）、小麦（AAA34310）、拟南芥（L19351）和马铃薯（ABA46759）有较高的一致性（95.39%、95.39%、92.11%和90.79%）,并且结构域分析发现该序列具有泛素结合酶E2的酶活性中心部位和一个与其他真核生物泛素E2酶相同,在泛素E2硫酯键形成中具有催化活性,并在进化上高度保守的半胱氨酸残基。该基因在香蕉根、茎、叶、花、果实中均有表达,但在花和果实中的表达量较高,并且在果实成熟后期表达量升高,与淀粉磷酸化酶活性变化一致,与淀粉含量的变化呈负相关,暗示该基因可能参与香蕉果实成熟过程中的分解代谢,而与果实成熟启动无关。