多重PCR鉴定水牛胚胎性别的研究

【目的】建立多重PCR鉴定水牛胚胎性别的技术体系,为下一步优化多重巢式PCR方法奠定基础。【方法】采用热裂解法、蛋白酶K＋二硫苏糖醇（DTT）法和吐温-20＋DTT法分别提取水牛卵裂球DNA,比较3种方法对G3PDH基因的扩增效果;同时设计1对检测引物和1对内标引物用于胚胎性别鉴定,提取胚胎DNA后进行多重PCR检测。【结果】吐温-20＋DTT法具有良好的裂解效果,其有效检出率为97.1%;而经吐温-20＋DTT法抽提的DNA用于多重PCR检测,其胚胎鉴定率达到100.0%。【结论】采用吐温-20＋DTT法处理水牛胚胎样品后再进行多重PCR性别鉴定可以简化操作步骤、提高鉴定效率,但样品数量不宜太少。     

多重PCR鉴定水牛胚胎性别的研究

【目的】建立多重PCR鉴定水牛胚胎性别的技术体系,为下一步优化多重巢式PCR方法奠定基础。【方法】采用热裂解法、蛋白酶K+二硫苏糖醇（DTT）法和吐温-20+DTT法分别提取水牛卵裂球DNA,比较3种方法对G3PDH基因的扩增效果;同时设计1对检测引物和1对内标引物用于胚胎性别鉴定,提取胚胎DNA后进行多重PCR检测。【结果】吐温-20+DTT法具有良好的裂解效果,其有效检出率为97.1%;而经吐温-20+DTT法抽提的DNA用于多重PCR检测,其胚胎鉴定率达到100.0%。【结论】采用吐温-20+DTT法处理水牛胚胎样品后再进行多重PCR性别鉴定可以简化操作步骤、提高鉴定效率,但样品数量不宜太少。     

应用PCR法和LAMP法鉴定牛早期胚胎性别的研究

通过设计特异性引物，优化Mg^2＋浓度、退火温度和循环时间等影响PCR的因素，确定了适合现场应用的PCR反应体系；46枚胚胎现场的鉴定率为87％，移植妊娠率为28％，准确率为85％，证明建立的PCR胚胎性别鉴定方法可用于生产。使用LAMP法对126枚常规胚胎和42枚性控胚胎现场鉴定，鉴定率95％，移植妊娠率33％，准确率88％，结果证明该方法可应用于牛早期胚胎性别鉴定。PCR法和LAMP法所鉴定同一样品的结果一致，说明在控制好实验条件的情况下，根据实际情况可选用这两种方法中的任何一种进行性别鉴定应用。     

早期胚胎性别鉴定技术PCR法及其应用现状

对PCR法的原理、特点及PCR法早期胚胎性别鉴定的几个关键环节的研究和应用进行了综述,并对其存在的问题及发展前景作了展望。     

体外培养枫径猪胚胎成纤维细胞系方法的建立

选取枫径猪胚胎,采用胶原酶消化培养法制备猪胚胎成纤维细胞,经数次传代培养及冷冻复苏试验表明胚胎成纤维细胞仍具有正常的传代能力。在体外培养至15代后成纤维细胞核型正常,符合体细胞克隆转基因的要求。用PCR方法建立了枫径猪胚胎成纤维细胞性别鉴定的反应体系,对其中6株细胞进行了性别鉴定。     

PCR技术在胚胎性别鉴定中的应用

家畜早期胚胎性别鉴定对畜牧业生产具有重要的现实意义。本文扼要介绍了胚胎分割技术和采用PCR技术鉴别牛、羊等家畜胚胎性别的操作程序,对影响该技术雌雄判定率的因素进行了综合分析。对这种方法的研究现状、各种技术细节的主要优缺点和发展前景进行了系统介绍。     

哺乳动物性别控制的研究进展

性别控制是一项能显著提高养殖业经济效益的生物工程技术。目前哺乳动物的性别控制的方法很多,主要是通过XY精子分离和早期胚胎性别鉴定来实现。在生产中,还经常采用其它性别控制的方法,如:受精时间控制法、阴道pH值调节法和营养调节法等。就性别决定的机理、XY精子分离以及早期胚胎性别鉴定的几种方法进行了综述,并对性别控制存在的问题及发展前景进行了讨论。     

家畜繁殖生物技术研究现状及趋势

牛胚胎移植技术已趋于成熟。我国新疆牧科院用一步细管法移植牛冻胚受胎率达41%;牛和羊鲜胚四分胚移植也产下1头犊牛和6只羔羊。家畜体外受精,因卵子体外成熟和受精卵体外培养尚不过关,目前仍停留在实验室阶段。胚胎性别鉴定,1990年Koopman发现单拷贝基因,该基因是Y染色体的性决定区,命名为SRY,可利用PCR技术制成雄性特异DNA探针盒,进行马、牛、羊、猪早期胚胎性别鉴定。北京农学院等单位用PCR扩增牛SRY序列进行奶牛胚胎性别鉴定准确率达100%。英、日、法等国已获得牛胚胎细胞核移植后代;我国也获得1只核移植兔。北农大和新疆牧科院合作以绵羊精子为载体导入牛生长激素基因rMTbGH DNA成功,外源基因整合率为3%。     

应用巢式及复合PCR对小鼠早期胚胎进行性别鉴定

根据小鼠SRY基因，设计并合成内外两对巢式PCR引物；同时。根据ZFY—ZFX基因的同源性，设计合成其共同的巢式PCR引物，对昆白小鼠组织DNA样品进行了性别鉴定。雄性样品可扩增262bp的SRY基因和137bp的ZFY—ZFX基因片断，而雌性样品只能扩增137bp的ZFY-ZFX基因片断，其鉴定结果与已知性别一致。将2-细胞、4-细胞、8-细胞和16细胞胚胎视为微量细胞样品进行PCR扩增，通过常规PCR与巢式PCR、复合PCR的比较。确立了巢式及复合PCR的扩增体系。结合核型分析和PCR法共鉴定21枚胚胎，其中雄性12枚，雌性8枚，鉴定准确率为95．2％。     

嵌套式PCR扩增SRY基因序列鉴定牛胚胎性别体系的建立

应用源自牛X和Y染色体同源区的1对外引物P1、P2及其各自特异区的2对内引物P3、P4和P5、P6,进行嵌套式PCR反应,对中国荷斯坦公、母牛静脉血样DNA及牛胚胎样DNA进行特异性条带的嵌套式PCR扩增,并对外、内嵌套式引物的PCR反应体系进行了优化,以准确鉴定牛早期胚胎性别.结果表明,在优化了的PCR反应体系下,中国荷斯坦公牛DNA样品得到178bp和262bp的两个条带,而母牛仅得到262bp的1个条带;静脉血样DNA性别鉴定结果与实际性别相符率为100%,表明本试验建立的体系完全可以用于牛早期的胚胎性别鉴定.     

利用胚胎染色体分析法验证PCR鉴定小鼠胚胎性别技术的研究

 本实验用小鼠切割胚制备了73枚囊胚和扩展囊胚的染色体性别鉴定标本，将其中26枚胚胎的活组织样品（含5-10个细胞）进行聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,简称PCR），以检测Y染色体性别决定区（Sex determining region of the Y,简称SRY）片段的存在，并鉴定胚胎的性别。26个样品中有24个的性别鉴定结果和染色体分析的结果相符，从而证明用PCR鉴定小鼠胚胎性别技术的准确率为92.3%(24/26)。     

Sex Identification of Red-crowned Crane by the Polymerase Chain Reaction

Sex determining gene primers of Oriental White Stork were used to amplify sex-linked gene of the Red-crowned Crane‘s W chromosome-specific by PCR for sex identification. The sexes of 7 couples of grown Red-crowned Cranes and 15 youngs were identified. Through DNA sequence analysis, the identity is 94.7-% between Red-crowned Crane and Oriental White Stork. The results of this study suggest that the application of the polymerase chain reaction technique is practicable for determining sex in the Red-crowned Crane.     

体外生产的牛胚胎在不同发育期的性比率

本研究旨在证实牛体外培养的雄性胚胎生长发育是否快于雌性胚胎。胚胎的性别鉴定采用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）技术。在体外受精的第５天，胚胎根据发育期划分为三个组：１６细胞期，多于１６细胞期和桑椹期。在３个组中，雄性胚胎所占百分率分别是３２％，５３％和６３％。在体外受精的第７天，胚胎根据发育期划分为４个组：桑椹期、早期囊胚期、囊胚期和扩张囊胚期。在性别鉴定后，４个组中雄性胚胎所占百分率分别是２８％，３８％，６０％和７０％。结果表明：牛早期胚胎在体外培养条件下，雄性发育快于雌性。     

用抗雄性特异性单克隆抗体鉴别小鼠胚胎性别

用实验室筛选的雄性特异性单克隆抗体鉴别小鼠胚胎性别时,阳性符合率为67.31% ,阴性符合率为82.22% 。将胚胎在单抗中孵育的时间从105～120 min 减至45 m in,相应地减少了难以分辨雌雄的荧光中间型胚胎数量。为了统一对胚胎中荧光斑的描述,根据荧光组成的基本形状和强度将胚胎荧光型分为8种,按荧光型的不同将胚胎判为阴性和阳性,并逐一用PCR法检测胚胎的真实性别,以检验免疫学鉴别胚胎的符合率,从而建立了更符合客观实际的免疫学鉴别胚胎的标准,提高了小鼠胚胎性别鉴别的效率。     

扩增SRY基因鉴定塔里木兔性别的研究

[目的]采用分子生物学手段对外部性别鉴别特征缺失的塔里木兔进行性别鉴定.[方法]应用双重PCR法同时扩增SRY和APP基因进行性别鉴定.[结果]在验证PCR有效性的基础上,对未知性别的237例塔里木兔样本成功的鉴定出性别,其中121例为雄性,116例为雌性.[结论]实验所使用的引物具有高度的特异性,只能鉴别兔类动物的性别,对一些不完整的或外部性别鉴别特征缺失的兔类样品提供了可行的性别鉴定途径.     

牛Y染色体DNA探针的研究

本研究以ＰＣＲ技术扩增牛Ｙ－ＤＮＡ特异性片段,制备成探针,并用此探针与已知性别奶牛白细胞ＤＮＡ杂交,结果公牛白细胞ＤＮＡ呈阳性杂交,而母牛则为阴性,表明此探针可以用作奶牛的性别鉴定。     

Analysis of the Offspring Sex Ratio of Chicken by Using Molecular Sexing

The overall sex ratio of offspring （dead embryos and hatch chicks） from all the fertilized eggs of 140 hens collected for 30 days was studied using duplex PCR of certain fragments of sex chromosomes. Additional 894 dead embryos over a period of 21 days of incubation were also investigated to verify the sex ratio of the dead embryos. The sex of the early dead embryos was identified using this molecular sexing technique. The sex ratio of the hatch chicks and the total offspring of the hens investigated in this experiment did not differ from the expected sex ratio （i.e., 1：1）., However, the number of female dead embryos was significantly more than that of males. The data indicated that the different physiologic function of males and females contributed to female-biased mortality during incubation. It was also found by further analysis that the sex ratios of the offspring of some hens were significantly biased to female or male over the period investigated, which suggested that the sex ratio of offspring might be influenced by the maternal condition to some degrees.     

应用牙釉质基因鉴定绒山羊早期胚胎的性别

采用酚-氯仿法和煮沸法从南疆绒山羊血液和早期胚胎中提取基因组DNA,分别以雄羊和雌羊的血液基因组DNA和早期胚胎基因组DNA(约20～30胚胎细胞)为模板,以AMEL引物进行PCR扩增和电泳分析.结果表明:绒山羊5ng量和10pg量血液基因组DNA经扩增后雌性只得到1条非特异性带,雄性得到1条非特异性带和1条特异性带;超微量血液基因组DNA样本(10pg)经巢式扩增和电泳分析能够鉴定绒山羊性别;32枚绒山羊胚胎鉴定结果,雄雌性别比17/15;移植胚胎产羔雄雌比15/14.采用牙釉质基因(AMEL),经巢式扩增和电泳分析能够鉴定绒山羊性别,并对胚胎无损伤;南疆绒山羊早期胚胎性别鉴定结果与胚胎移植后产羔性别结果对比,雌雄性别比率差异不显著(P>0.05).     

性控冻精在肉羊胚胎移植中应用效果的研究

为进一步研究肉羊性控精液在胚胎生产上的应用,以萨福克、无角陶赛特纯种肉用绵羊为供体,本地小尾寒羊杂交后代和湖羊为受体,利用子宫角深部输精及一般人工授精等辅助生殖技术使用性控冻精与普通鲜精对两品种肉羊进行人工授精,统计不同品种肉羊的受胎率和可用胚数,对获得的性控胚胎和普通胚胎进行移植,并对比其移植效果。结果表明:萨福克肉羊和无角陶赛特肉羊超排后黄体数差异不明显(P>0.05);普通精液输精所获得的胚胎数极显著高于性控冻精(P<0.01);在受胎率上也做了比较,但差异不显著,受胎率43.2%。由于精液在通过流式细胞仪时,对精子顶体造成一定损伤,因此,无论是子宫角输精或阴道子宫颈输精均影响受精率,但性控精液的推广应用确实可以加速家畜遗传育种速度,缩短育种周期。鉴于此,今后对性控精液的研究重点应该放在精液分离过程中对精子的保护,以减少对精子的损伤。