Inhibition of the transcription of P450 monooxygenase gene CYP9A14 in Helicoverpa armigera (Hübner) by baculovirus-mediated RNAi

采用实时荧光定量PCR,测定棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)细胞色素P450 CYP9A14基因在氯氰菊酯抗性棉铃虫中肠里的表达量,结果表明抗性棉铃虫是敏感棉铃虫中肠表达量的17倍.将棉铃虫中肠P450 CYP9A14基因的一个490bp反向重复片段以双链RNA干扰(double-stranded RNA interference,dsRNAD的方法重组到棉铃虫核型多角体病毒(helicoverpa nuclear polyhedrosis virus,HaNPV)中,结果表明以该重组病毒注射氯氰菊酯抗性棉铃虫体内后,幼虫中肠CYP9A14基因的转录水平显著下降.     

斜纹夜蛾P450基因CYP4M14和CYP4S9的克隆与mRNA表达水平研究

【目的】研究斜纹夜蛾对溴氰菊酯抗性的分子机制。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆CYP4M14和CYP4S9 cDNA全长序列,采用实时定量PCR技术分析这两个基因在斜纹夜蛾抗、感品系6龄幼虫中肠和脂肪体中mRNA 的表达水平。【结果】克隆得到斜纹夜蛾细胞色素P450基因CYP4M14和CYP4S9的cDNA全长序列,序列分析表明,CYP4M14编码区长1 512 bp,编码 504个氨基酸;CYP4S9编码区长1 473 bp,编码 491个氨基酸;实时定量PCR分析结果表明,在中肠中,CYP4M14和CYP4S9在抗性品系中的mRNA表达量分别是敏感品系中的4.85和18.63倍;在脂肪体中分别是在敏感品系中的75.14和6.07倍。【结论】斜纹夜蛾对溴氰菊酯的高水平抗性可能与CYP4M14和CYP4S9的过量表达有关。     

野桑蚕细胞色素P450氧化酶活性测定及CYP9家族基因的诱导转录

采用酶标板酶活性动力学法检测了氯氰菊酯诱导苏大野桑蚕中肠和脂肪体的PNOD活性。结果表明：氯氰菊酯诱导24 h,脂肪体、中肠PNOD活性分别增加了18.7%,12.2%。根据野桑蚕CYP9A20基因(GenBank登录号：FJ378716)、CYP9A21基因(GenBank登录号：FJ265741)、CYP9A22基因(GenBank登录号：EF535806) 和CYP9G3基因片段设计引物,用半定量RT-PCR方法分析了氯氰菊酯诱导野桑蚕CYP9家族基因的表达水平。结果表明,氯氰菊酯诱导24 h,CYP9A21基因在中肠的mRNA表达量是对照的2.1倍,CYP9A20,CYP9A21,CYP9G3基因在脂肪体的mRNA表达量是对照的1.9,3.5,1.4倍。推测野桑蚕CYP9A21等基因的过量表达可能导致野桑蚕对氯氰菊酯氧化解毒代谢的增强。     

棉铃虫细胞色素P450家族 CYP6AE14 基因克隆、序列分析及蛋白原核表达

采用同源克隆技术克隆石河子棉区棉铃虫抗性品系的P450家族解棉酚基因 CYP6AE14 。克隆获得的目的基因全长1 581 bp,编码526个氨基酸。序列分析表明,该抗性品系的 CYP6AE14 有1个氨基酸发生突变,即Y25F;其与烟草天蛾的CYP6AE32同源性较高,达60%。利用原核表达载体pET28 a在大肠杆菌中成功表达棉铃虫P450 CYP6AE14 基因,为进一步的基因功能验证奠定基础。     

P450基因在氯虫苯甲酰胺不同抗性品系小菜蛾中的表达及功能分析

【目的】以十字花科蔬菜害虫小菜蛾（Plutella xylostella）为研究对象,筛选参与小菜蛾代谢氯虫苯甲酰胺的主要细胞色素P450解毒基因,为阐明不同抗性水平小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性机理提供依据。【方法】利用叶片药膜法测定不同小菜蛾种群3龄幼虫对氯虫苯甲酰的抗性水平,通过转录组测序、insectbase数据库和小菜蛾基因组数据库筛选得到52个细胞色素P450基因。应用MEGA5.10软件对52个细胞色素P450基因进行进化分析,获得与抗药性密切相关的CYP3和CYP4家族P450基因。利用实时荧光定量PCR方法分析目的基因在小菜蛾室内筛选种群（HZY）和田间抗性种群惠州种群（HZ）、连州种群（LZ）、东升种群（DS）、钟落潭种群（ZLT）中的表达量,选用RNA干扰技术,采用注射法,验证在抗性种群中显著上调表达的CYP6BF1V4在小菜蛾抗氯虫苯甲酰胺中的功能。【结果】抗药性测定结果表明,LZ和HZ小菜蛾种群为中等水平抗性,ZLT、DS和HZY小菜蛾种群为高水平抗性。对52个细胞色素P450基因的系统发育树分析发现,小菜蛾拥有10个CYP4家族基因,28个CYP3家族基因,其中2个CYP4家族基因在HZ和HZY种群中的表达量显著高于敏感种群,4个CYP3家族基因表达量与小菜蛾抗性呈正相关,8个基因在中等水平抗性小菜蛾体内的表达量高于在高水平抗性小菜蛾体内的表达量。对田间种群进一步筛选得到6个与小菜蛾抗氯虫苯甲酰胺密切相关,在不同抗性种群中均上调表达的细胞色素P450基因,其中4个为CYP6家族基因（CYP6BF1V4、CYP6BF1V3、CYP6f1和CYP6B6）,2个为CYP9家族基因（CYP9G2.1和CYP9G2.2）,以CYP6BF1V4的表达量最高,其在抗性种群中的表达量是在敏感种群中表达量的3.5—6.3倍。RNA干扰结果显示,沉默CYP6BF1V4能够显著提高小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的敏感性。【结论】CYP6BF1V4、CYP6BF1V3、CYP6f1、CYP6B6、CYP9G2.1和CYP9G2.2可能在小菜蛾体内协同调控多功能氧化酶的表达,从而加快小菜蛾代谢氯虫苯甲酰胺的速度,提高小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性。     

响应槲皮素诱导的美国白蛾P450基因及CYP6ZB2功能分析

【目的】明确美国白蛾（Hyphantria cunea）响应槲皮素诱导的差异表达P450基因及系统发育关系,探究美国白蛾P450基因对槲皮素诱导的剂量效应,以及P450基因在美国白蛾对槲皮素的解毒适应中的作用。【方法】基于槲皮素诱导的美国白蛾中肠转录组数据,从中筛选显著差异表达的P450基因,应用MEGA X软件对5个P450基因及其他近缘物种的P450基因进行系统进化关系分析;通过RT-qPCR技术检测5个P450基因在不同槲皮素浓度（0.5%、1.0%、2.0%和4.0%）处理下的表达模式;克隆CYP6ZB2全长cDNA序列,利用RNA干扰（RNAi）技术探明CYP6ZB2基因沉默对美国白蛾体重及存活率的影响。【结果】从转录组的差异表达基因中筛选到5个显著响应槲皮素诱导的P450基因,经P450命名委员会分别被命名为CYP4G296、CYP4G297、CYP333A30、CYP304F33和CYP6ZB2(GenBank登录号：ON032363—ON032367)。系统发育分析表明,这5个基因被聚类到CYP2、CYP3、CYP4和线粒体CYP进化枝。RT-qPCR结果表明,P450...     

番茄抗叶霉病相关基因片段克隆及VIGS重组载体的构建与鉴定

以含有Cf-19基因的番茄抗叶霉病品种CGN18423为材料,运用RT-PCR技术克隆番茄抗叶霉病相关基因细胞色素P450 90A1-like(CYP 90A1-like)部分序列,片段长295 bp;以番茄八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)基因作为阳性对照,片段长349 bp。测序结果表明,序列与番茄同源性达100%;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,在番茄感染叶霉病后,随时间延长CYP 90A1-like基因相对表达量呈上调趋势,说明该基因在番茄抗叶霉病过程中有重要作用;以烟草脆裂病毒(TRV2)为载体,成功构建CYP 90A1-like、PDS基因的病毒诱导基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)重组载体。构建的p TRV2-CYP 90A1-like、p TRV2-PDS重组载体将为下一步利用VIGS技术在番茄上研究CYP 90A1-like基因与番茄抗叶霉病的关系奠定试验基础。     

细胞色素P450新家族的第一个基因CYP337A1的分子克隆与序列分析

依据家蚕基因组数据, 通过BLASTP比对, 选择了主要与抗性相关的CYP3集团(clan)中具有完全编码框并含有P450基因特征结构域的1条序列为研究对象, 用RT-PCR方法对其进行了克隆. 结果表明, 该基因ORF为1 467 bp, 编码489个氨基酸, 推定的蛋白质分子质量为56.60 KDa, 等电点为8.64. 只有1个内含子, 外显子/内含子边界处符合GT-AG规则. 与美国棉铃虫的CYP321A、邪恶按蚊的CYP6P9的相似性(identity)相对较高, 分别为34%、 32%, 低于同一家族成员氨基酸相似性应高于40%的规定, 从而被细胞色素P450委员会命名为新家族的第一个基因CYP337A1(GenBank 登陆号: EF415297).     

橘小实蝇幼虫解毒酶系基因应对高效氯氰菊酯胁迫的组织特异性表达

【目的】基于橘小实蝇（Bactrocera dorsalis）转录组数据,系统分析橘小实蝇幼虫解毒代谢酶系基因在受到高效氯氰菊酯持续胁迫时的表达模式,鉴定其中起主要作用的基因,并探讨这些基因组织差异表达的生物学意义。【方法】利用qPCR技术检测橘小实蝇幼虫受到高效氯氰菊酯持续胁迫后,30个解毒代谢酶系（GSTs、P450s、CCEs）基因在整虫、中肠以及脂肪体的表达水平变化情况。【结果】在高效氯氰菊酯持续胁迫作用下,橘小实蝇8个GSTs基因中,其mRNA表达量出现明显上调的主要是Delta家族的4个基因,它们在中肠和脂肪体均出现了5.6-32.5倍的过量表达,而其他家族的GSTs基因经高效氯氰菊酯胁迫后没有出现明显的应激反应。同时,Delta家族的GSTs基因虽然在中肠和脂肪体对药剂胁迫有积极的响应,但是它们的表达在整虫却没有明显的变化。6个CCEs基因在整虫中出现一定程度的上调,其中α-E3基因的表达量上调了4.1倍,但是这些基因在中肠和脂肪体均没有出现上调的情况。16个P450s基因的定量分析结果表明,有多个P450s基因的mRNA的表达出现了上调,且大部分基因属于CYP4和CYP6两个家族。其中,CYP4家族中出现明显上调反应的主要有CYP4D47（中肠）、CYP4E9（整虫、脂肪体）和CYP4P5（整虫、脂肪体）。CYP4AD1的表达量在中肠和脂肪体均有一定程度的上调,而在整虫中没有变化。另外,CYP4S18和CYP4AC4没有出现应激表达或者表达量的变化不明显。CYP6家族中,CYP6A48和CYP6A41在脂肪体的表达量显著上调,分别提高了18.0和9.6倍,CYP6G6和CYP6A50在脂肪体的表达量也有一定程度的上升,而CYP6EK1的表达量虽然在整虫提高了4.8倍,但是在中肠和脂肪体并没有明显的变化。其他家族的P450s基因,如CYP12C2、CYP9F6、CYP12N1和CYP309B1等基因的表达量经高效氯氰菊酯胁迫后在脂肪体中也出现了显著的上调,而CYP317B1的表达量在药剂压力下并没有明显的变化。【结论】橘小实蝇幼虫在应对高效氯氰菊酯胁迫时,体内的解毒代谢酶系基因集中在中肠和脂肪体高水平表达,但存在整体保持平衡的现象,推测橘小实蝇在应对杀虫剂的持续胁迫时,存在趋于平衡的能量分配策略,即通过提高能量的利用效率,减少在抵御外源杀虫剂伤害时额外能量的消耗。这种可以避免出现适合度代价的策略可能是昆虫应对环境压力的一种重要适应机制。     

美洲棉铃虫CYP321A1基因启动子区萤火虫荧光素酶报告基因载体的构建及活性测定

【目的】构建美洲棉铃虫细胞色素P450基因CYP321 A1启动子区萤火虫荧光素酶报告基因载体,为探索CYP321 A1基因的转录调控机制奠定基础。【方法】设计合成PCR引物,从美洲棉铃虫基因组DNA中扩增并克隆CYP321 A1基因的启动子区;将克隆的启动子片段插入载体pGL3-basic构建萤火虫荧光素酶报告基因载体p(-1 470/+64);用p(-1 470/+64)转染美洲棉铃虫脂肪体细胞系BCIRL-HzFB33,并用双荧光素酶报告基因检测系统分析该启动子活性。【结果】p(-1 470/+64)经双酶切、PCR鉴定及DNA测序分析鉴定准确无误;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,证实所构建的重组载体p(-1 470/+64)可以反映CYP321 A1启动子活性;黄酮、花椒毒素处理极显著地增强了重组载体p(-1 470/+64)的荧光活性。【结论】成功构建了美洲棉铃虫细胞色素P450基因CYP321 A1启动子区萤火虫荧光素酶报告基因载体,CYP321A1启动子活性可以被植物次生物质黄酮、花椒毒素高度诱导。     

大黑鳃金龟消化与解毒相关基因的组织表达研究

[目的]明确大黑鳃金龟幼虫消化酶和解毒相关基因在不同组织中的表达情况,筛选中肠特异表达基因。[方法]利用RT-PCR方法对大黑鳃金龟幼虫中肠消化酶(胰蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶)基因和解毒相关基因(细胞色素P450、谷胱甘肽S-转移酶、酯酶)在不同组织中的表达进行分析。[结果]所调查的大黑鳃金龟的6个谷胱甘肽S-转移酶在中肠中都有表达,有3个基因在中肠中特异性表达。细胞色素P450家族中CYP 6A20和CYP 4C1 2个基因在中肠中特异表达,3个氨肽酶基因(APN1、APN2和AP2)只在中肠中表达。[结论]大部分大黑鳃金龟的消化酶和解毒酶基因在中肠中表达量最高。     

棉铃虫CYP4家族基因片段克隆及序列分析

以5龄实验室品系棉铃虫的总RNA为模板,采用一对昆虫细胞色素P450简并引物,利用反转录—多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增并筛选出10个新的长度约450bp的cDNA片段,并对这些序列与GeneBank中已知序列进行相似性分析,初步推测这10个P450基因片段属于CYP4家族的CYP4M和CYP4S2个亚家族。     

转舞毒蛾CYP6B53基因果蝇品系对2种杀虫剂的胁迫响应

昆虫细胞色素P450是重要的解毒酶,参与杀虫剂代谢。利用转基因果蝇技术探究舞毒蛾CYP6B53基因对溴氰菊酯和百树菊酯的胁迫响应:通过药膜法以低剂量(0.77 mg/L)溴氰菊酯和百树菊酯胁迫转CYP6B53基因果蝇(命名为att P40CYP6B53)及非转基因对照果蝇(命名为att P40),分别测定了细胞色素P450酶活性和CYP6B53基因表达量对2种杀虫剂的胁迫响应。结果表明:低剂量拟除虫菊酯胁迫下,转CYP6B53基因果蝇体内细胞色素P450活性表现出不同的时间效应,以24 h时表现为例,溴氰菊酯胁迫24 h显著抑制P450活性,而百树菊酯胁迫则显著诱导P450活性;转基因果蝇体内CYP6B53 m RNA表达水平对2种杀虫剂24 h胁迫响应呈现出相似的结果。综上,CYP6B53基因调控P450活性参与溴氰菊酯和百树菊酯胁迫响应,但胁迫响应存在显著的时间效应。     

细胞色素P450新家族的第一个基因CYP337A1的分子克隆与序列分析

依据家蚕基因组数据,通过BLASTP比对,选择了主要与抗性相关的CYP3集团（clan）中具有完全编码框并含有P450基因特征结构域的1条序列为研究对象,用RT-PCR方法对其进行了克隆.结果表明,该基因ORF为1 467 bp,编码489个氨基酸,推定的蛋白质分子质量为56.60 KDa,等电点为8.64.只有1个内含子,外显子/内含子边界处符合GT-AG规则.与美国棉铃虫的CYP321A、邪恶按蚊的CYP6P9的相似性（identity）相对较高,分别为34%、32%,低于同一家族成员氨基酸相似性应高于40%的规定,从而被细胞色素P450委员会命名为新家族的第一个基因CYP337A1（GenBank登陆号：EF415297）.     

基于定量PCR技术的AcNPV-CarE病毒液滴度测定及酯酶表达条件优化

为了制备具有生物学功能的棉铃虫羧酸酯酶(CarEs)体外表达产物,用于研究其对有机磷等化学杀虫剂的代谢解毒作用,该文尝试将棉铃虫羧酸酯酶基因在草地夜蛾细胞系Sf9和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)为载体的表达系统中进行表达,采用实时荧光定量PCR技术测定棉铃虫羧酸酯酶基因和病毒载体重组体(AcNPV-CarE)的病毒液滴度,并通过不同转染系数(MOI)和不同收获时间下培养液中细胞体积单位变化趋势,以及表达产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和α-乙酸萘酯染色结果,优化了棉铃虫羧酸酯酶在Sf9细胞中的最佳表达条件.结果表明:重组病毒液P1stock在Sf9细胞中扩大培养至第三代以后的病毒液(P3和P4stock)滴度均在2×108 pfu/mL以上;采用P4stock重组病毒液,在MOI为2,Sf9细胞体积单位为3×106个/mL,转染后48h收获细胞沉淀,可得到具有酶活的最大量羧酸酯酶表达产物.上述结果为棉铃虫羧酸酯酶的异源真核表达和具有天然酶活表达产物的制备提供了有价值的参考.     

新疆马铃薯甲虫对噻虫嗪的抗性监测及其细胞色素P450基因表达分析

【目的】以世界性害虫马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）为研究对象,筛选其参与噻虫嗪解毒的细胞色素P450主效基因。【方法】于2018、2019年利用点滴法监测新疆察布查尔县、伊宁县、塔城市、乌鲁木齐市和吉木萨尔县11个马铃薯甲虫田间种群对噻虫嗪的抗性水平,并测定分析噻虫嗪LD₅₀处理72 h后成虫中3种主要解毒酶细胞色素P450酶（P450）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）和酯酶（EST）的活性变化。利用Illumina HiSeq^TM 2500 高通量测序技术进行转录组测序,获得抗性和敏感种群之间的差异表达基因（DEG）,运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术验证3个P450基因并分析6个P450基因（CYP4C1、CYP9e2、CYP305a1、CYP9Z25、CYP9Ya和CYP9Yc）在不同种群及噻虫嗪处理后的表达情况。【结果】抗性监测发现,2018年的YN1、URMQ1、TC和QPQL1以及2019年的YN2和JMS种群成虫对噻虫嗪抗性倍数（RR）分别达到5.99、8.81、10.86和20.33倍和11.82、14.05倍,为低至中水平抗性。解毒酶活性测定结果表明,2个敏感种群URMQ2、URMQ3以及2个抗性种群YN2、JMS成虫分别经噻虫嗪LD₅₀处理72 h后其P450活性均显著增加,分别为对照的1.76、2.75、1.91和1.66倍。另外,URMQ3种群的GST（CDNB和DCNB为底物）及URMQ2、YN2种群的EST活性显著升高,分别为对照的1.19、2.10倍和1.35、1.91倍。转录组分析表明,通过合并组装分别获得噻虫嗪敏感和抗性种群样品56 872 051和62 249 136个原始序列数据以及55 903 706和61 082 076个过滤后的序列数据,过滤后的序列长度分别为8.39和9.16 G,碱基错误率均为0.03%。抗性种群中差异表达的P450基因13个,其中2个基因显著上调。3个上调的P450基因CYP4C1、CYP9e2和CYP305a1的qRT-PCR检测结果与转录组测序结果基本一致,qRT-PCR分析还发现CYP9Ya、CYP9Yc、CYP4C1、CYP305a1和CYP9Z25在抗性种群成虫中表达量显著增加,噻虫嗪LD₅₀处理均可引起URMQ2种群4龄幼虫和成虫CYP9Ya、CYP9Yc表达量显著上调。相关性分析发现成虫对噻虫嗪的抗性水平与CYP9Ya表达量呈显著正相关。【结论】CYP9Ya可能在马铃薯甲虫中对噻虫嗪具有重要的解毒作用,其他基因的作用也不能排除。     

拟南芥CYP76C2基因(At2g45570)的克隆及其菌核病抗性功能分析

以拟南芥基因组DNA为模板,扩增出细胞色素P450(CYP76C2)基因的ORF,成功构建了CYP76C2基因的过表达载体并获得转基因植株.通过离体和活体接种表明,CYP76C2基因的过表达植株对核盘菌的抗性增强.     

CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1基因在小尾寒羊下丘脑-垂体-卵巢轴的表达

为揭示类固醇生成相关基因CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1在绵羊多羔繁殖中的作用,以不同繁殖力小尾寒羊为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术检测CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1基因在小尾寒羊大脑、小脑、下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管中的表达。结果表明:CYP11A1基因主要在小尾寒羊卵巢、输卵管、子宫内表达;CYP11A1基因在单羔小尾寒羊卵巢的表达极显著低于多羔群体(P0.01),在子宫的表达量极显著高于多羔群体(P0.01);CYP17A1基因主要在小尾寒羊卵巢、输卵管、下丘脑表达;CYP17A1基因在多羔小尾寒羊群体下丘脑、子宫的表达量显著低于单羔群体(P0.05)。CYP19A1基因主要在小尾寒羊卵巢、下丘脑表达。本究结果提示CYP11A1、CYP17A1基因可能参与小尾寒羊多羔性状的调控。     

野桑蚕不同组织细胞色素P450 CYP305B1V1基因的诱导表达特征研究

[目的]研究不同诱导物对野桑蚕各组织中细胞色素P450CYP30581V1基因表达的影响。[方法]参照GenBank中公布的野桑蚕CYP305B1V1基因的mRNA序列,设计1对引物,采用半定量RT-PCR方法分析经NaF、芸香苷、氯氰菊酯和蜕皮激素处理的野桑蚕各组织中CYP305B1V1基因的表达情况,并对该基因的氨基酸序列进行同源性比较和进化分析。[结果]氯氰菊酯、芸香苷和NaF影响野桑蚕6TP305B1V1基因在组织中的表达,蜕皮激素无明显影响。氨基酸的同源性分析表明该基因氨基酸序列与家蚕CYP305B1的氨基酸序列同源性最高（100％）;与赤拟谷盗推测的CYP305A1、蜜蜂推测的CYP305A1、果蝇CYP305A1、冈比亚按蚊CYP305A2及库蚊CYP2L1有较高的同源性。[结论]野桑蚕CYP30581V1基因可能主要参与外源性化舍物的代谢,对揭示细胞色素P450的功能和不同药物的代谢机理具有重要意义。     

A亚群禽白血病病毒env基因在昆虫细胞中的表达与鉴定

为获得A亚群禽白血病病毒(ALV-A)env基因的表达产物,以ALV-A AH10毒株病毒RNA为模板,通过反转录PCR扩增得到env基因,将其克隆到转移载体p Fast Bac1中,转化DH10Bac感受态细胞,获得重组穿梭质粒r Bacmid-env A,r Bacmid-env A转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒。间接免疫荧光试验(IFA)和免疫印迹试验(Western-blot)结果显示,重组蛋白可与抗ALV-A抗体发生特异性反应,重组蛋白分子大小约为90 000,与预期大小相符,表明env基因在Sf9细胞中获得了良好表达。