几种野生药用植物内生放线菌的遗传多样性及抗菌活性

从四川省雅安市采集的7份中药材植物样品中分离出106个内生放线菌菌株,采用16S rDNA-RFLP和16SrDNA序列分析研究了其系统发育。16S rDNA-RFLP将供试菌株分成了6个遗传群;代表菌株的系统发育分析表明,供试菌株主要为链霉菌属(Streptomyces);其余菌株分布于野野村菌属(Nonomuraea),小单孢菌属(Micromono-spora),拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis),糖霉菌属(Glycomyces),厄氏菌属(Oerskovia),纤维菌属(Cellulosimicrobi-um)等6个稀有放线菌属,大多数供试菌株对细菌及病原真菌有较为广谱的抗菌活性。揭示了该区域药用植物内蕴藏着丰富的内生放线菌资源。     

9株土壤放线菌分离鉴定及抗菌活性

初步研究了贵州习水国家级自然保护区土样放线菌。用改良HV培养基分离放线菌,对9株放线菌进行了形态学、生理生化和分子鉴定,系统发育分析和抗菌活性检测。结果显示:1株为小单孢菌属(Micromonospora),相似性97%;8株为链霉菌属(Streptomyces),相似性96%~99%。抗菌活性检测发现,链霉菌C2对3株供试细菌有抑菌作用,抑菌圈直径8.5~12 mm;链霉菌C12对5株供试细菌具有抑菌效果,抑菌圈直径17~20 mm。研究结果表明,小单孢菌为稀有放线菌,链霉菌为优势放线菌;C2和C12相比,C2抑菌作用弱,C12抑菌作用强,C12抑菌谱更广,效果更好。     

西藏青稞根际土壤可培养放线菌的遗传多样性及其促生功能分析

【目的】认识藏区青稞根际土壤中可培养放线菌的遗传多样性及应用价值。【方法】采集藏区青稞根际土壤,对根际样品中的放线菌进行分离,测定分离菌株的溶磷能力、抗病促生(IAA产量)能力,并运用反转录重复因子扩增(BOXA1RPCR)技术、16S r RNA基因测序和系统发育分析系统分析可培养放线菌的系统发育地位。【结果】通过7种培养基共分离得129株放线菌菌株,其中有51株菌株(占总分离菌株的39.5%)产IAA,8株产量较高(>57 mg/L),77株(占总分离菌株的60.0%)表现出溶磷活性。基于BOXA1R-PCR图谱,采用平均连锁聚类法(UPGMA)进行聚类分析,129株菌被分成19种不同的遗传图谱类型。基于分离菌株的菌落特征和遗传聚类图谱选取32株代表菌株进行16S rRNA基因序列测定。通过Mothur软件对分离菌株进行OTUs(operational taxonomic units)聚类分析,共得到5个OTU分类单元,其中以OTU1为主。系统发育显示代表菌株分属于链霉菌属(Streptomyces),拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis),类诺卡氏菌属(Nocardioides),小单孢菌属(Micromonospora),放线菌属(Actinomyces)等5个属,其中链霉菌属(Streptomyces)为优势种属。【结论】西藏青稞根际土中放线菌多样性明显,这些放线菌中蕴藏着大量的有开发应用前景的菌株。     

贵州地区土壤中需氧放线菌的分离鉴定

为了解贵州土壤需氧放线菌的分布特点、系统发育和物种多样性,采集贵州贵阳、遵义、安顺、铜仁、毕节、黔南、六盘水、黔东南、黔西南9个区域的农耕地、湿地、森林3个类型土壤标本进行需氧放线菌的分离纯化,扩增其16S rDNA 基因序列后在 GenBank 中进行 Blast 比对分析,并以邻接法构建系统发育树。结果表明：在贵州9个区域108份土壤中分离出173株需氧放线菌,其中链霉菌属（Streptomyces）165株、北里孢菌属（Kitasatospora．）5株、诺卡氏菌属（Nocardioides）2株,在遵义农耕地土壤中分离出链霉菌属潜在新种1株（GYM8-3）。贵州土壤需氧放线菌主要为链霉菌属,在种间水平上存在分类多样性和地域差异性。     

贵州矿区放线菌多样性及对汞的抗性

为探明贵州喀斯特重金属污染区域土壤放线菌多样性特征以及为其污染修复应用奠定基础,从贵州铜仁地区的25份土壤样品中,采用梯度稀释涂布法,利用3种处理方式、7种培养基分离放线菌;通过形态特征、16SrDNA基因序列分析结合生理生化特征鉴定放线菌;同时筛选重金属汞抗性菌株。结果从土样中共分离出56株典型放线菌菌株,经初步鉴定,分属于链霉菌属、孢囊链霉菌属、高温单孢菌属、线杆菌属、间孢囊菌属、诺卡氏菌属、小单孢菌属;其中链霉菌属放线菌占68%。筛选出了1株对汞有较高抗性(75mg·L~(-1))的放线菌菌株,优良耐受菌株的最大抗性约85 mg·L~(-1),菌株经鉴定为枝链霉菌Streptomyces rameus。共分离出56株,分属于7个属的放线菌菌株;筛选出1株重金属汞高抗菌株,经鉴定为枝链霉菌。     

西藏低温放线菌的多样性及其生物活性

【目的】研究西藏低温环境下放线菌的组成及其抑菌效果和酶活性,为放线菌新药物先导化合物和高活性酶的筛选提供资源。【方法】从西藏低温地区采集16份土样,用平板稀释法分离放线菌,经形态学和培养特征初步鉴定后得到有代表性的低温放线菌,对这些代表性菌株的16S rRNA基因序列进行系统发育分析,对其进行鉴定;采用菌丝生长速率法测定代表性低温放线菌菌株发酵液对11种农作物真菌的抑菌活性,并对其纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等活性进行测定。【结果】从16份土样中共分离到22株有代表性的低温放线菌,其在10~25℃均能生长。16S rRNA基因序列分析表明,这22株菌分布于放线菌门放线菌纲2个亚目3个科的3个属,即链霉菌亚目(Streptomycineae)链霉菌科(Streptomycetaceae)链霉菌属(Streptomyces)、假诺卡氏亚目(Pseudonocardineae)束丝放线菌科(Actinosynnemataceae)伦茨氏菌属(Lentzea)和假诺卡氏亚目(Pseudonocardineae)假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)拟无支酸菌属(Amycolatopsis),其中以链霉菌属最多,占分离菌的91%。在分离的22株代表性低温放线菌菌株中,27.3%的菌株有抑菌活性;40.9%的菌株具有纤维素酶活性,22.7%的菌株具有淀粉酶活性,18.2%的菌株具有蛋白酶活性。【结论】西藏低温生境中蕴藏着丰富的低温放线菌资源,其中一些菌株具有拮抗活性和酶活性。     

25株植物内生放线菌的系统发育分析

[目的]初步确定25株植物内生放线菌的种属关系。[方法]采用改进的FRED法从小麦、大葱、油菜等植物中分离出的25株内生放线菌中提取基因组DNA,对其16S rDNA序列进行PCR扩增和测序,并对其进行系统发育分析。[结果]系统发育分析结果表明25株植物内生放线菌可分为5个属,其中1株糖霉菌属,2株拟诺卡氏菌属,7株诺卡氏菌属,10株小单孢菌属和5株链霉菌属。[结论]25株供试菌株中,小单孢菌属所占比例最高。供试内生放线菌与相应菌属中已知菌株之间的进化距离集中在97.39%~99.92%范围内。     

北极海洋沉积物中放线菌多样性及抑菌活性筛选

采用平板涂布法利用6种培养基从北极海洋沉积物中共分离出109株放线菌。选取34株代表菌株进行16S rDNA测序分析。结果表明,它们分属于链霉菌属(Streptomyces)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)和拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis),其中Streptomyces为优势菌属;不同采样点获得放线菌的种类和数量有较大不同,站位点P37分离到的放线菌数量和种类最多;在109株放线菌中,有39株对病原菌有抑菌活性,其中有21株、11株和17株放线菌分别对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长有抑制作用。     

两种放线菌基因组DNA PCR模板制备方法的比较

[目的]比较制备放线菌基因组DNA PCR模板的两种方法液氮研磨法及TE煮沸法.[方法]以从河西走廊盐碱土壤中分离鉴定的8属16株菌为材料,包括糖丝菌属（Saccharothrix）Ⅳ23-3-4、类诺卡氏菌属（Nocardioides）Ⅴ22-5-1、原小单孢菌属（Promicromonospora）ⅨX5-4-3、小单孢菌属（Micromonospora）Ⅱ23-4-1、放线多孢菌属（Actinopolyspora）Ⅳ8-2-5、拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）Ⅱ8-4-3、链单孢菌属（Streptomonospora）DA01305、链霉菌属金色类群DA03401、链霉菌属金色类群DA01408、链霉菌属蓝色类群DA09140、链霉菌属金色类群DA01308、链霉菌属灰红紫类群DA05213、链霉菌属蓝色类群DA11417、链霉菌属粉红孢类群DA04401、链霉菌属灰红紫类群DA04402、链霉菌属球孢类群DA04307.对两种方法制备的PCR模板进行16S rDNA的扩增,PCR产物进行电泳检测.[结果]两种方法均能得到比较清晰的目的条带,但TE煮沸法简化了放线菌基因组DNA PCR模板制备的过程,可用于高通量放线菌PCR模板的快速制备.[结论]该研究为大批量菌株的快速鉴别和系统分类提供了有效的方法.     

济宁市土壤放线菌资源调查研究

从济宁市采集土样,采用高氏1号琼脂和淀粉铵琼脂两种培养基分离放线菌,按国内外通用方法进行鉴定,并对土壤放线菌主要属——链霉菌属的类群进行分析与鉴定。结果表明:同一样品在高氏1号琼脂培养基上分离得到的放线菌要高于淀粉铵培养基上的。放线菌组成中,链霉菌占绝大多数,达放线菌总数的70%以上,其次是小单孢菌属,马杜拉放线菌属和诺卡氏菌属;链霉菌类群的组成较复杂,主要为白孢类群和粉红孢类群。     

甘蔗叶冠形态与抗梢腐病相关性探讨

为明确甘蔗叶冠形态与抗梢腐病相关性,在南宁市设置大田试验,以广西蔗区甘蔗梢腐病主要致病菌Fusarium verticillioides为毒源,对美国佛罗里达引进的13个甘蔗新品(系)和广西主栽品种ROC22进行接种研究。主成分分析法和相关性分析结果显示,甘蔗抗梢腐病性与其+1叶叶面积极显著正相关,与角度指数显著正相关。根据梢腐病病情指数抗性评价和聚类分析,14个参试甘蔗品种(系)被分成4类,即高抗品种CP07-2518、CP06-4647、CP06-3458和CP06-3332;抗病品种CP07-2547、CP07-1527、ROC22、CP06-3477和CP06-2897;中抗品种CP09-4707、CP09-4369和CP07-1533;中感品种CP06-3051和CP06-2422。结果表明,甘蔗叶冠形态与其抗梢腐病性存在一定相关性。株型紧凑、叶片狭窄直立且易脱叶的甘蔗品种对梢腐病抗性较强。反之,叶片宽大、披散下垂型且不容易脱叶的甘蔗品种对梢腐病抗性较差。     

采用多基因联合方法鉴定福建长乐和福清产区马铃薯Y病毒株系组成

【目的】马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯生产上危害较为严重的病毒,也是制约马铃薯可持续发展的主要病毒之一。论文旨在开发一套简便、准确、快速的PVY分子鉴定技术,并采用该技术及时查明福建省部分产区PVY病害的发生、分布及PVY株系组成。【方法】采用ELISA方法对采自福建省长乐市、福清市马铃薯种植区疑似受PVY感染的样品进行检测,并根据文献报道的PVY P1、VPg和CP基因保守区设计3对简并引物,对ELISA检测后的阳性样品进行基因扩增、克隆,并将获得的序列进行核苷酸序列一致性、重组位点、基因型分布和系统发育分析。【结果】ELISA检测结果表明,17份样品中有13个样品与PVY抗体呈阳性反应,其他呈阴性反应。13个阳性样品均能成功扩增出3个与P1、VPg和CP基因预期大小一致的特异片段。BLAST比对分析显示P1、VPg和CP基因与文献报道的已知PVY分离物的核苷酸序列一致性分别为72%—99%、85%—99%和88%—99%。P1、VPg和CP 3个基因联合序列分析显示,FQ01分离物与PVY~(N-Wi)株系的核苷酸序列一致性最高,FQ08分离物与PVYE株系的核苷酸序列一致性最高,CL01、CL02、CL05和CL13 4个分离物与PVY~(NTN-NW)株系SYR-I型的核苷酸序列一致性最高,CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12 7个分离物与PVY~(NTN-NW)株系SYR-II型的核苷酸序列一致性最高。重组分析显示,除CP基因外,长乐市和福清市两个产区的PVY分离物的P1和VPg基因中均检测到显著的重组信号。基因型统计分析结果显示,长乐产区的P1基因为N型(60%)和N×O重组型(40%),VPg基因均为N×O重组型,而CP基因均为O型,而福清产区的P1基因为N型(25%)和N×O重组型(75%),VPg基因为N×O重组型(87.5%)和O型(12.5%),而CP基因除了一个分离物为N型外,其他均为O型。系统发育分析显示分离物FQ01与PVYN-Wi株系聚为一簇,FQ08与PVYE株系聚为一簇,CL01、CL02、CL05和CL13与PVY~(NTN-NW)株系SYR-I型聚为一簇,CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12与PVY~(NTN-NW)株系SYR-II型聚为一簇,表明在系统发育关系上,分离物FQ01与PVYN-Wi株系最近,FQ08与PVYE株系最近,CL01、CL02、CL05和CL13与PVY~(NTN-NW)株系SYR-I型最近,CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12与PVY~(NTN-NW)株系SYR-II型最近。【结论】PVY在福建省长乐市、福清市马铃薯种植区普遍存在,重组株系已成为田间的主流株系,且PVY~(NTN-NW)已成为优势重组株系。     

侵染广东黄秋葵的木尔坦棉花曲叶病毒及伴随卫星DNA的分子特征

从广东省表现黄脉曲叶的黄秋葵病株上分离到病毒分离物Okra06,PCR检测结果显示,该病毒属双生病毒科Geminiviridae菜豆金色花叶病毒属Begomovirus.基因克隆及序列分析结果表明,其基因组仅含A组分(DNA-A),全长为2 737 nt,推导编码6个开放阅读框(Open reading frame,ORF).该组分与木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leafcurl Multan virus,CLCuMV)分离物G6的核苷酸序列相似性最高,为99.7%;二者编码的6个ORF相似性分别为100%、100%、99.6%、99.8%、100%和99.7%.该病毒还伴随有卫星分子β(DNAβ),全长为1 346 nt,推导其互补链上编码1个ORF(C1).该分子与伴随CLCuMV分离物G6 DNAβ的核苷酸序列相似性也最高(99.5%).DNAβ系统进化分析显示,Okra06 DNAβ与CLCuMV-[G6]DNAβ、CLCuMV-[Gx08]DNAβ亲缘关系最近,三者形成一个独立分支;进一步与其他CLCuMV DNAβ和CLCuV DNAβ聚类在一起.这些结果证明,侵染广东黄秋葵的病毒分离物Okra06属于CLCuMV,且该分离物与引起广东朱槿曲叶病的CLCuMV-G6应同属木尔坦棉花曲叶病毒朱槿株系.     

基于EST序列的杨树候选SNPs标记分析

利用生物信息学方法对来自2个不同cDNA文库的2万余条杨树EST序列进行了候选SNPs标记.研究结果表明,在获得的94个碱基替代型候选SNPs中,A/G替换类型最多,占32.98%,C/T替换型占13.83%,其它碱基置换型SNPs占53.20%.同时,对其中20个候选SNPs位点的重新测序结果表明,有13个(占65%)候选sNPs位点得到证实,其中,11个位点为碱基替代型SNPs,另外2个为杂合型位点.     

白杨新杂种田间溃疡病抗性调查

对10年生银白杨和84K杨人工杂交初选优良无性系对比试验林的抗病性进行调查,并对各个无性系发病率、感病指数和相对抗病指数进行分析。结果表明,高度抗病无性系是02-09-22、02-11-10、毛-30、101杨、02-08-21和河北杨;中度抗病无性系分别为02-12-29、02-14-26、02-05-09和02-04-22;抗病无性系分别为02-08-30、02-08-26、02-13-26、02-04-32、02-04-05、02-04-36和02-10-20;中度感病无性系02-15-05、02-20-24、02-21-30、02-07-23、02-15-18、02-21-11、02-06-02、02-21-33、02-05-22、02-06-26、02-03-20和02-12-26;高度感病无性系是02-12-33和02-07-22。     

云南地区草地贪夜蛾肠道细菌的分离及鉴定

草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)自2019年1月入侵中国以来,现已蔓延至全国25个省份.为了解草地贪夜蛾的肠道微生物的组成,近期该课题组在云南蒙自地区的玉米地采集了草地贪夜蛾幼虫及成虫,通过分离培养结合16S rDNA测序鉴定其肠道细菌分离株的种属.在幼虫肠道中分离到32个细菌分离株,通过16S rDNA序列同源聚类可归为4个属,分别为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠球菌属(Enterococcus)、沙雷氏菌属(Serratia)和摩根菌属(Morganella),其中克雷伯氏菌属(Klebsiella)丰度最高,为53.1%;在成虫肠道中分离到16个细菌分离株归为5个属,分别为不动杆菌属(Acinetobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、微球菌属(Micrococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和肠杆菌属(Enterobacter),其中不动杆菌丰度最高,为56.0%.该研究首次对入侵中国的草地贪夜蛾成虫肠道细菌进行分离鉴定,为后续研究草地贪夜蛾生物学适应性等重要问题奠定了基础.     

广西涠洲岛3种海参共附生细菌多样性及其延缓衰老活性分析

【目的】明确广西涠洲岛海参共附生细菌多样性，筛选出具有延缓衰老活性的菌株，为挖掘延缓衰老活性的新化合物提供菌种资源。【方法】选用9种选择性培养基对来源于广西涠洲岛的3种海参［异色哈威参（Havelockia versicolor）、玉足海参（Holothuria leucospilota）和方柱翼手参（Colochirus quadrangularis）］共10份样品进行共附生细菌分离纯化，基于16S rRNA测序分析其多样性，并以秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）为模型评价共附生细菌发酵粗提物的延缓衰老活性。【结果】从广西涠洲岛3种海参中共分离获得63株共附生菌株，隶属于3门4纲14目25科35属，以放线菌纲（Actinobacteria）为优势菌群，共有31株（占49.21%）；放线菌GXIMD LM0085和GXIMD LM0159有可能为潜在新种，与对应有效发表菌株Kocuria assamensis、K.salsicia的相似性分别为97.38%和97.00%。不同培养基分离获得的海参共附生细菌在属类水平上存在明显的数量差异，以M9培养基分离获得的菌属数量最多（19属28株），P7培养基分离获得的最少（仅6属6株）；在筛选确定的35属细菌中，仅Cobetia和嗜盐单胞菌属（Halomonas）在9种培养基均有生长分布，多达13个属仅在单一的培养基中生长。不同海参分离获得的共附生细菌数量排序为1#异色哈威参>方柱翼手参>2#异色哈威参>玉足海参，除了玉足海参外，其他3只海参体内的共附生放线菌相对丰度明显高于体表共附生放线菌相对丰度。线虫寿命试验发现，有6株共附生细菌的发酵粗提物能显著延长秀丽隐杆线虫寿命（P<0.05），分别是GXIMD LM0037（寡养单胞菌属）、GXIMD LM0005（链霉菌属）、GXIMD LM0071（副球菌属）、GXIMD LM0114（寡养单胞菌属）、GXIMD LM0099（原小单孢菌属）和GXIMD LM0032（短状杆菌属）。【结论】广西涠洲岛海域海参蕴含着多样性丰富的共附生细菌资源，具有潜在的新物种，且部分菌株具有延缓衰老活性，在延缓衰老活性物质挖掘及新型抗衰老药物研发方面具有巨大潜力。     

塔里木盆地北缘土壤放线菌分布多样性分析

选用4种培养基进行涂布平板分离塔里木盆地北缘土壤放线菌样,所分离菌株初步鉴定为6个属,链霉菌是优势菌(占51.2;～100;).在几种不同利用类型的土壤中,耕作土壤中放线菌分布最丰富.典型相关分析得出,放线菌分布多样性主要受土壤总盐含量的影响,随总盐含量的升高而降低,总盐含量与放线菌数量和种类之间呈负相关,结合回归分析得出,在土壤总盐中,Mg2+和Cl-1含量是影响放线菌分布的主要因素;其次,对塔里木盆地北缘土壤放线菌而言,土壤有机质、速效磷及速效氮含量对其分布多样性影响不显著.     

毛竹根部解磷细菌的筛选及多样性研究

本研究对毛竹(Phyllostachys pubescens)根部(包括根际、根面及内生细菌)解磷细菌进行了筛选,并通过16S rDNA序列分析对其多样性进行了初步研究。从179株毛竹根部细菌中筛选出26株解磷细菌,包括14株根际细菌、8株根面细菌、4株内生细菌。其中,芽孢杆菌BK24的解磷活性最高,其解磷活性达到369.06 mg/L。16S rDNA序列分析表明:26株解磷细菌中,13株属于厚壁菌门(Firmicutes,50.00%),5株属于变形菌门β亚群(Betaproteobacteria,19.23%),4株属于变形菌门γ亚群(Gammaproteobacteria,15.38%),4株属于放线菌门(Actinobacteria,15.38%)。芽孢杆菌属(Bacillus,38.46%)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia,19.23%)为优势菌属。