转座子诱变甘蓝黑腐病黄单胞菌所获胞外多糖突变体的验证

利用转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５上的抗性基因,通过“鸟枪法”克隆到用这种转座子诱变甘蓝黑腐病黄单胞菌所获得的三个胞外多糖突变体菌株Ｔ１０６、Ｔ１１３和Ｔ１１７中的转座子及其相邻序列的ＤＮＡ片段,并利用含有这些片段的重组质粒,通过标记置换构建了突变体。通过检测标记置换突变体的胞外多糖产量及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,证实了胞外多糖突变株Ｔ１０６、Ｔ１１３和Ｔ１１７不仅确系转座子插入所致,而且转座子插入的位点分布在染色体的不同区域。从而证实了我们所报道的诱变体系是可行的     

采用两种突变方法对甘蓝黑腐病菌XC_1348基因的功能解析

为研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004基因组中一个功能未知的假定蛋白XC_1348的基因功能,本研究用自杀质粒pK18mob和pK18mobSacB分别通过同源单交换和同源双交换构建XC_1348的非极性整合突变体1348nk和有标记的缺失突变体DM1348Gm,并对两种突变体的表型进行检测,结果显示该基因突变后不影响细菌的胞外多糖（EPS）产量、胞外酶活性以及细菌游动性.有趣的是该基因的两种突变体的致病力存在较大差异,原因可能是Xcc经两种方法定点突变后分别具有的不同基因组结构而影响到某些基因的表达所致.通过研究初步了解了XC_1348基因的功能并为今后改进定点突变方法提供现实依据.     

十字花科黑腐病菌中调控致病相关基因hpaS的XC_2486基因鉴定

十字花科黑腐病菌hpaS影响致病性、HR其编码产物分别与HpaR2、HrpG形成双组分系统。为了深入了解hapS的表达调控机制,本研究将hpaS的启动子与蔗糖敏感基因sacB融合,构建了hpaS的表达报告质粒pL6sacB3670并导入十字花科黑腐病菌野生型菌株8004中,获得了报告菌株8004/pL6sacB3670。然后利用转座子EZ：Tn5对该报告菌株进行诱变,筛选到一株转座子EZ：Tn5插入基因组的克隆。通过测序定位分析发现该克隆是由转座子EZ：Tn5插入到编号为XC_2486的ORF所产生的。然后将hpaS启动子与报告基因gusA融合的报告质粒pL6GUS3670分别导入野生型8004和XC_2486的突变体239C02中,测定比较pL6GUS3670的GUS表达水平,结果显示在突变体背景下GUS表达水平明显比在野生型背景下降低。这表明XC_2486正调控hpaS的表达。对XC_2486突变体239C02进行致病性和过敏反应检测发现,XC_2486与致病性相关,与HR无关。     

不同接种浓度对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种胞外多糖突变体致病性的影响

利用转座子 Tn5gus A5诱变和标记置换方法 ,构建了野油菜黄单胞菌野油菜致病变种( Xanthomonas campestris pv.campestris)系列标记置换突变体 ,其中 6个突变体的胞外多糖产量显著降低。致病试验结果表明 ,胞外多糖产量对 Xcc的致病性有明显的影响 ,不同接种浓度对 Xcc胞外多糖突变体致病性亦有明显影响。     

水稻白叶枯病菌rpfC基因DNA序列的测定分析

ｒｐｆＣ是甘蓝黑腐病菌中全局性调控胞外酶和胞外多糖合成以及致病性的一个基因簇中的一个基因。已从水稻白叶枯病菌中鉴定和克隆到一个在功能上能互补甘蓝黑腐病菌的ｒｐｆＣ突变体的基因，并通过构建突变体证实了这一基因在水稻白叶枯病菌致病性中起重要作用。本研究对水稻白叶枯病菌的这一基因的ＤＮＡ序列进行了测定分析，结果表明，它与甘蓝黑腐病菌的ｒｐｆＣ基因具有高度的同源性。因此，将水稻白叶枯病菌的这一基因也称为ｒｐｆＣ基因     

胞外多糖对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种气孔入侵能力的影响

利用 Tn5gus A5插入诱变和标记置换等分子遗传学方法 ,构建了野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 ( Xanthomonas campestris pv.campestris) 80 0 4菌株的系列突变体。其中有 6个突变体的胞外多糖产量显著降低。将它们喷雾接种寄主植物萝卜时 ,有 2个突变体仍具有一定的致病性 ,4个突变体无致病性。结合扫描电镜观察 ,我们认为胞外多糖产量影响着该病菌气孔入侵能力     

野油菜黄单胞菌XC1892基因与致病力关系的分析

野油菜黄单胞菌野油菜变种(简称Xcc)是十字花科作物黑腐病的病原菌。在前期工作中,从Xcc8004菌株获得1株编号为XC1892的基因的转座子Tn5gusA5突变体,其致病力降低。根据基因组注释,XC1892编码1个DsbE蛋白,参与细胞色素的合成。为评估XC1892的功能,采用自杀质粒pK18mob对XC1892进行诱变,获得非极性突变体1892nk。对突变体的表型分析发现,其致病力及胞外多糖产量分别是野生型的59%和55%。用一段包含XC1892基因的DNA片段对突变体1982nk进行功能互补,其致病力和胞外多糖产量基本得到恢复。这表明XC1892基因与Xcc的致病力和胞外多糖合成产量有关。     

野油菜黄单胞菌2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶基因的突变分析

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种是发酵工业生产黄原胶的菌种,通过对Xcc8004菌株全基因组序列进行搜索,发现该菌株拥有完整的ED、EMP、HMP等糖代谢途径。为评估ED途径对细胞功能的影响,选择基因组中编码ED途径的关键酶——2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因eda进行诱变,构建非极性突变体。通过对突变体表型进行分析,发现eda基因的突变体在培养基中能够正常生长繁殖,但其胞外多糖产量则降低77．6％。用一段包含eda基因的DNA片段对突变体进行功能互补,能基本恢复胞外多糖产量。这表明eda基因对细胞合成胞外多糖有重要影响,也暗示ED途径对细胞生长是非必要的,而对细胞大量合成胞外多糖是必须的。     

野油菜黄单胞菌XC3813-3815基因启动子的定位分析

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（简称Xcc）是十字花科作物黑腐病的病原菌,同时也是发酵工业生产黄原胶的菌种。在以前的工作中,证实了Xcc8004菌株基因组中一个包含XC3813-3815三个基因的新位点与致病性和胞外多糖（EPS,又称黄原胶）合成有关。本工作通过PCR合成包含相应ORF及其上游不同长度的DNA片段,并克隆于不带启动子的质粒载体pLAFR6后,将所获的重组质粒互补相应的突变体。通过这一功能互补的方法,确定了这三个基因在其ORF上游约50bp内分别拥有自身的启动子。     

水稻细菌性条斑病菌REC结构域蛋白基因vemRXoc的功能鉴定

水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc）是水稻的主要病原细菌之一,该菌引起的水稻细菌性条斑病可导致水稻减产、品质下降。Xoc GX01菌株基因组中含有一个与十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc）的致病相关基因vemR一致性高达95.27%的同源基因XOC2152,其编码蛋白中含有磷酸信号识别受体REC结构域。为了研究XOC2152基因在Xoc中的生物学功能,本研究通过基于自杀质粒pK18mob同源整合方法,构建了XOC2152的非极性突变体NK2152。该突变体的胞外多糖产量仅为野生菌株的27.33%,平板游动半径为野生菌株的40.96%,对铜离子耐受能力极显著降低。针刺接种水稻（日本晴品种）10d后,Xoc GX01处理的病斑平均长度为（3.86±1.19）cm,而突变体NK2152处理的病斑长度为（0.98±0.45）cm。带有该基因片段的pLAFR3可以互补突变体的表型和致病力变化。上述结果表明XOC2152基因具有与Xcc的vemR类似的功能,被命名为vemRXoc基因。本研究表明XOC2152基因（vemRXoc基因）与水稻细菌性条斑病菌的致病力、胞外多糖产量、运动能力以及对铜离子的耐性等相关。     

野油菜黄单胞菌6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的初步分析

野油菜黄单胞菌野油菜变种是发酵工业生产黄原胶的菌种,对该菌8004菌株全基因组序列进行分析,发现基因组中有两个编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因,编号分别为XC1977和XC4082,同源性分析显示这两个基因演绎的氨基酸序列只有36.3%的相似性。为了解这两个基因的功能,采用自杀质粒pK18 mob对XC1977和XC4082分别进行诱变,构建这两个基因的非极性突变体,对突变体表型初步分析,发现XC1977和XC4082分别突变后不影响细胞的生长繁殖,但对胞外多糖产量的影响则不相同,XC1977突变使胞外多糖产量降低56.3%,而XC4082突变基本不影响胞外多糖产量,表明8004菌株的两个zwf基因在细胞中的功能不同,XC1977与细胞的胞外多糖合成产量有关。     

野油菜黄单胞菌6-磷酸果糖激酶基因的初步分析

6-磷酸果糖激酶是糖酵解途径中的关键酶,它催化糖酵解途径中第一个不可逆反应。本研究利用pK18mobsacB自杀质粒采用同源双交换的方法对野油菜黄单胞菌Xcc8004中的6-磷酸果糖激酶基因（XC_0872）进行缺失突变,获得无标记的缺失突变体DM0872。表型检测结果显示DM0872突变体不影响野油菜黄单胞菌对葡萄糖和果糖的利用,不影响胞外多糖的合成,也不影响其致病性。该结果显示糖酵解途径在野油菜黄单胞菌的地位并不重要。另外,我们利用RT-PCR方法检测了XC_0872的转录情况,结果显示XC_0872在Xcc8004中是转录的。而之前曾有报道称黄单胞菌中无法检测出6-磷酸果糖激酶活性,这表明XC_0872进行了转录后调控从而使6-磷酸果糖激酶活性受到限制。本研究为野油菜黄单胞菌中糖酵解途径的调控提供了理论依据,对揭示野油菜黄单胞菌中该途径的调控机制具有一定的意义。     

十字花科黑腐病菌中转录调控因子HpaR1调控一个纤维素酶基因的表达

十字花科黑腐病菌（Xcc8004）中的一个转录调控因子XC2736（npaRI）在致病过程中具有重要的作用。前期研究发现该转录调控因子可能调控胞外纤维素酶的合成。为了解HpaRI对纤维素酶的转录调控机理,本研究对HpaR1进行原核表达纯化,并与488bp的包含XC0639的启动子区DNA片段进行凝胶电泳迁移率试验,发现HpaR1与XC0639启动子可以发生结合。将488bp的XC0639的启动子DNA片段与报告基因gus融合,构建XC0639的报告质粒pGUS0639r,分别导入野生型8004菌株和缺失突变体DM2736中,分析发现在突变体背景下GUS的表达水平比野生型背景明显降低。表明HpaRl正调控XC0639的表达。构建XC0639的极性整合突变体PK0639,检测发现PK0639几乎丧失胞外纤维素酶的活力;通过功能反式互补构建的互补菌株CPK0639可以恢复纤维素酶活性。研究结果表明HpaRl通过调控纤维素酶基因XC-0639的表达来调控细胞的纤维素酶活性。本研究为更深入地了解HpaR1如何调控细菌生理生化功能奠定了基础。     

野油菜黄单胞菌分泌组双向电泳样品制备方法的建立

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc）是十字花科植物黑腐病的病原细菌。我们建立了Xcc的蛋白质组学研究平台,用于分离、鉴定该菌的致病相关蛋白。为了减少胞外多糖（exopolysaccharide,EPS）对蛋白材料质量的影响,我们构建了EPS缺陷的Xcc8004ΔgumB突变体。本研究以Xcc8004ΔgumB出发菌株,用诱导培养液培养,取细胞上清通过超滤浓缩得到蛋白质粗提物,分别采用丙酮沉淀法、试剂盒纯化法和丙酮沉淀-试剂盒联用法来纯化蛋白质粗提物,通过比较双向电泳的结果优选最佳的样品制备方法。结果证明丙酮沉淀-试剂盒联用法较为理想,所得双向电泳图片清晰,分辨率高。因此,此方法可以用于制备野油菜黄单胞菌分泌组双向电泳样品,并可以满足进一步研究的需要。     

3种接种方法对十字花科黑腐病菌Xcc8004菌株在拟南芥Col-0上致病力的影响

十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pathovar carnpestris,Xcc）是引起十字花科植物黑腐病的病原菌,也是研究寄主与病原微生物相互作用分子机理的模式菌之一。Xcc可以感染白菜、萝卜和甘蓝等十字花科农作物,也可以感染重要的模式植物拟南芥（AroJoidopsisthaliana）。由于拟南芥的全基因组测序已经完成,因此,拟南芥是研究寄主植物对Xcc浸染的防卫反应的分子机理的最理想的寄主材料。但是,到现在为止,一套完善的在拟南芥上进行xcc致病检测的实验系统还没有建立。为此,本研究比较了“叶片压渗法”、“剪叶法”和“叶片中脉穿刺法”这3种常用的病原细菌接种方法对Xcc的实验室菌株8004f以下简称Xcc8004）在哥伦比亚生态型拟南芥似．thanlianaecoype Colombia0,Col-0）上的致病力的影响。结果发现,在拟南芥Col-0叶片上用“叶片压渗法”接种Xcc8004可以引起明显致病症状,而用“剪叶法”和“叶片中脉穿刺法”接种均不能引起病症。这一结果说明,不同的接种方法的对Xcc在拟南芥上的致病力有很大的影响。因此,要在拟南芥Col-0上进行Xcc8004的致病力检测,本研究建议采用“叶片压渗法”而不用“剪叶法’和“叶片中脉穿刺法”。此外,本研究还建立了一套简易的拟南芥试验用苗的栽培方法。     

克隆包含以拟南芥为寄主的甘蓝黑腐病菌Xcc1067无毒基因的DNA片段

本研究探索了以拟南芥为寄主的甘蓝黑后病菌的致病条件，观察了其病症的发展．建立了菌株Ｘｃｃ１０６７的ｐＩＪ３２００为载体的基因文库，从基因文库中筛选出拟南芥Ｃｏｌｕｍｂｉａ为寄主的Ｘｃｃ１０６７菌株的无毒基因克隆，该克隆的进一步分析正在进行。