GlgC基因种子特异过表达载体的构建及对甘蓝型油菜的转化

【目的】通过表达外源GlgC基因增加甘蓝型油菜种子淀粉积累,从而可能增加含油量,为油菜高含油量育种提供一种潜在的新途径。【方法】本研究将定点突变的大肠杆菌AGPase基因GlgC分别和2个种子特异表达启动子DOF(拟南芥球形胚阶段启动子)、Cruc(油菜种子特异蛋白启动子)重组,构建2个GlgC过表达载体pMB-DOF-TG和pMB-Cruc-TG。利用农杆菌介导法转化甘蓝型油菜,获得转基因植株。【结果】PCR及半定量RT-PCR检测结果显示,GlgC基因已导入油菜再生植株基因组并获得表达。【结论】获得了甘蓝型油菜转GlgC基因阳性株,为利用遗传改良技术实现上述途径在油菜育种中的应用奠定前期基础。     

两个ADP-葡萄糖焦磷酸化酶α亚基基因在甘薯中的超量表达

ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)催化ADP-葡萄糖合成反应,是淀粉生物合成的限速酶之一。为研究甘薯AGPase与块根淀粉合成的关系,从高淀粉甘薯品种川薯34中克隆了AGPase基因的两个α亚基编码序列AGPa1和AGPa2;构建植物表达载体pC-AGPa1和pC-AGPa2后经根癌农杆菌EHA105介导分别导入甘薯品种西成薯007;获得表达了GUS的7株AGPa1和5株AGPa2转基因甘薯植株。RT-PCR和AGPase活性检测表明,AGPa1和AGPa2基因在转基因植株中表达水平高于对照,并引起甘薯叶片中AGPase活性显著增加。     

根癌农杆菌介导的fad2 RNA干扰体基因转化甘蓝型油菜的研究

Δ12-油酸去饱和酶(Delta-12 oleate desaturase FAD2)是植物产生多聚不饱和脂肪酸的关键酶。对fad2基因表达进行抑制,可提高油菜种子油酸的相对含量。依据hpRNA介导的RNAi技术的原理,构建了以甘蓝型油菜fad2基因为靶标的RNAi植物表达载体pCAMBIA3301-fad2i。以甘蓝型油菜Y14-1的带柄子叶作为转化受体,利用根癌农杆菌介导法,将fad2RNA干扰体基因导入甘蓝型油菜中,获得了PPT抗性植株。同时还探讨了影响Y14-1品种转化频率的几个要素,为甘蓝型油菜的高效转化提供参考依据。对获得的再生植株进行GUS组织化学染色检测和PCR检测,证明外源基因已整合到油菜基因组中。     

转harpinXooc蛋白编码基因hrf2对油菜抗菌核病的影响

【目的】尝试利用转基因方法提高油菜抗病性。【方法】将来自水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola）编码harpinXooc蛋白的hrf2基因插入植物表达载体pCAMBIA1301中,构建了植物重组表达质粒pCAMBIA1301-hrf2。由根癌农杆菌LBA4404介导,将重组表达质粒pCAMBIA1301-hrf2转化甘蓝型油菜杨油4号子叶节。【结果】获得了抗潮霉素的再生转基因油菜植株,经PCR,RT-PCR和GUS染色检测证明hrf2基因已整合到油菜基因组中。抗病性鉴定结果表明,转基因油菜对油菜菌核病有较好的抗性,在转基因植株叶片上油菜菌核病菌菌丝的生长受到明显抑制。【结论】利用农杆菌转化法可将hrf2基因导入油菜基因组中,并使转基因油菜对菌核病的抗性提高。     

百合AGPase基因RNAi载体构建及遗传转化研究

【目的】AGPase基因可在百合鳞茎膨大发育过程中影响淀粉的合成代谢,从而调控鳞茎发育,构建干扰AGPase基因RNAi载体并遗传转化进行反向下调作用研究,可为该调控机制的研究提供更多信息。【方法】克隆300 bp的AGPase基因保守序列,利用Gateway技术通过BP反应将该序列插入入门载体p DONR221,进行LR反应将该序列正反向插入干扰载体p Jawohl8-RNAi中,经过酶切鉴定所构建RNAi载体的正确性;并通过农杆菌介导法转入百合组培苗中,PCR检测RNAi载体转化农杆菌,荧光定量PCR检测农杆菌转化植株的AGPase相对表达量变化。【结果】成功构建p DONR221-AGPase入门克隆与p Jawohl8-RNAi-AGPase表达载体,遗传转化百合愈伤诱导出AGPase表达量下调的转化植株。【结论】采用Gateway技术可方便构建RNAi表达载体,选择的AGPase保守序列能作为干扰片段对百合AGPase自身转录的mRNA进行下调。     

生长素合成关键酶基因iaaM种子特异表达载体的构建及转基因油菜的获得

生长素是重要的植物激素,它对植物的生长发育具有重要的调控作用,它能诱导营养物质向其含量高的部位运输。通过转基因技术提高内源生长素在油菜种子中的含量,诱导营养物质向种子运输,为提高油菜灌浆速度,增加产量提供了新的研究方向。iaaM基因编码的色氨酸单加氧酶是催化色氨酸(Trp)转变为生长素(IAA)的关键酶,将iaaM基因与油菜(Brassica napusL.)种子发育早期特异性表达的储藏蛋白专一性启动子(Napin)融合并插入植物表达载体pCAMBIA3301中,构建iaaM基因的种子特异表达载体,并经农杆菌介导转化甘蓝型油菜。经PPT抗性筛选、GUS组织化学检测、PCR检测,初步证实外源基因已整合进油菜基因组,获得转基因植株。     

抗真菌、抗渗透胁迫基因多价植物表达载体构建及对黄瓜遗传转化的研究

本研究以黄瓜为试材,建立黄瓜植株再生体系和遗传转化体系;构建了分别由双35S组成型启动子、E12强组成型启动子和rd29A诱导型启动子调控的核糖体失活蛋白基因、几丁质酶基因和DREB1A基因的多价基因植物表达载体;利用农杆菌介导入法将其导入黄瓜优良品种,获得了转pBDCR T0及T1代PCR阳性植株。T1代转基因植株的抗逆性实验表明,DREB1A基因的表达可以提高黄瓜的抗旱性。本研究为培育抗逆境及抗真菌病转基因植株探索途径,并为进一步揭示核糖体失活蛋白基因、几丁质酶基因和DREB1A基因的分子机理提供了理论依据。     

根癌农杆菌介导AtNHX1基因转化甘蓝型油菜的研究(摘要)(英文)

[目的]研究根癌农杆菌介导AtNHX1基本对甘蓝型油菜的转化。[方法]采用根癌农杆菌介导法,应用cre/lox植物表达载体,研究Na+/H+逆向转运蛋白AtNHX1基因对甘蓝型油菜的转化。[结果]甘蓝型油菜带柄子叶的再生频率远大于下胚轴的再生频率,因此选择带柄子叶作为转化受体。带柄子叶经浓度OD600为0.4的菌液中侵染8～10min,卡那霉素抗性绿苗率达3.75%。[结论]对抗性植株的PCR检测证明,外源基因已经整合到油菜基因组中,为提高甘蓝型油菜耐盐能力研究提供了新的途径。     

玉米几丁质酶基因导入甘蓝型油菜的研究

以甘蓝型油菜（Brassica napus L.)下胚轴为转化材料,通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)介导将玉米几丁质酶基因（Maize Chitinase gene)导入双低油菜品种D2中,获得了抗卡那霉素（Kanamycin Kan)的再生植株,并对影响遗传转化的一些因素进行了研究。结果表明：适当的预培养对油菜下胚轴的遗传转化是必要的;油菜下胚轴遗传转化过程中的过敏反应可通过一些措施缓解;延迟筛选可提高油菜下胚轴的转化率。对抗性植株进行PCR检测表明：部分抗性植株在多次重复检测中的均显示较强的阳性反应,初步证明外源基因已整合到油菜基因组中。     

IrrE基因转化甘蓝型油菜及其分子检测

为提高油菜的盐胁迫的耐受性,文章以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)下胚轴为转化材料,通过农杆菌介导法将耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans,DR)的IrrE基因导入甘蓝型油菜84100-18(玻里马细胞质雄性不育恢复系)中,经过卡那霉素的筛选培养,获得了抗卡那霉素的再生植株,对抗性植株进行PCR和实时荧光定量PCR检测。结果表明:部分抗性植株多次重复检测显示为阳性植株,初步证实了IrrE已整合到油菜基因组中并且IrrE基因已经在这些植株中进行mRNA水平的转录。     

利用花粉介导法获得油菜RNAi转基因植株

以甘蓝型油菜7B为试验材料,利用花粉介导法将携带RNA干扰的HKL1基因的pCaMHKL1-RNAi质粒转入7B中,获得转基因油菜植株,通过PCR分别对T_1,T_2植株进行了转基因鉴定,并对转基因植株后代的生长发育进行研究。结果表明,T_2的RNAi植株与野生型植株相比,出真叶时间较晚,株型较矮小;qRT-PCR结果表明,RNAi植株中HKL1基因的相对表达量为野生型植株的24.6%~67.9%;不同的RNAi植株中HKL1基因的表达量各不相同;利用花粉介导法在甘蓝型油菜中进行RNAi质粒转化,外源基因可以在后代植株中稳定遗传。花粉介导法较之农杆菌侵染、基因枪法等基因转化方法操作更加简单、适用性更强。     

农杆菌介导法将深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因(D6D)导入油菜的研究

△6-脂肪酸脱氢酶基因可将亚油酸转化为γ-亚麻酸。我们将克隆的深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因(D6D)插入植物表达载体pBI121,构建了重组质粒pBI121-D6DMI。通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导途径,将深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因导入了甘蓝型油菜恢复系,经过诱导分化获得抗卡那霉素的再生植株。PCR检测及Souther杂交结果表明,外源基因△6-脂肪酸脱氢酶基因已整合到油菜再生植株的基因组中。     

甘蓝型油菜透明种皮12（TT12）基因家族反义抑制植物表达载体的构建

【研究目的】构建一个同时反义共抑制甘蓝型油菜(Brassica napus)透明种皮12基因家族(BnTT12)转录的植物表达载体。【方法】通过PCR扩增得到BnTT12家族一段503bp的特异保守片段TT12A,通过亚克隆整合到中间载体pCambia2301G,构建TT12反义植物表达载体pCambi-a2301G-TT12A。采用液氮冻融法将其转化到根癌农杆菌。【结果】经过PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌LBA4404菌株中形成TT12反义表达载体的工程菌株。【结论】pCambia2301G-TT12A的成功构建为利用此反义载体通过遗传转化获得转基因新型黄籽油菜和进一步探明TT12基因在甘蓝型油菜种皮色素合成途径中的分子生物学机理奠定了基础。     

农杆菌介导法将深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氨酶基因（D6D）导入油菜的研究

△^6-脂肪酸脱氢酶基因可将亚油酸转化为γ-亚麻酸。我们将克隆的深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因（D6D）插入植物表达载体pBI121。构建了重组质粒pBI121-D6DMI。通过农杆菌（Agrobacteritom tumefaciens）介导途径，将深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因导入了甘蓝型油菜恢复系，经过诱导分化获得抗卡那霉素的再生植株。PCR检测及Souther杂交结果表明，外源基因△^6-脂肪酸脱氢酶基因已整合到油菜再生植株的基因组中。     

甘蓝型油菜Fad2基因RNAi载体无选择标记转化研究

利用甘蓝型油菜‘Wester’的cruciferin启动子及NOS终止子构建了无选择标记基因且含有反义结构的油酸脱饱和酶基因(Fad2)的RNAi表达载体.通过农杆菌介导法,获得了无选择标记转基因植株;再生植株的PCR检测表明,外源基因已高频率地整合到油菜基因组中.     

抗草甘膦与磷高效吸收基因双价表达载体的构建及对甘蓝型油菜的遗传转化

【目的】甘蓝型油菜是产油效率较高的油料作物,在其生长过程中往往伴随着土壤环境中磷素匮乏及杂草胁迫,严重影响着最终产量和品质.因此,同时解决有效磷匮乏及草害问题已经成为目前油菜研究的重要方向.【方法】采用PCR法克隆得到了与草甘膦抗性(eCTP和EPSPS)和磷高效吸收(Pht1;2和phyA)的相关目的基因,随后构建了双价植物表达载体,通过农杆菌介导法转化甘蓝型油菜,对转化植株进行PCR检测筛选,并通过qRT-PCR法对筛选的阳性植株内目的基因的表达进行定量分析.【结果】将PCR扩增得到的片段经琼脂糖凝胶电泳检测,结果符合预期.测序结果也与GenBank注册序列同源性高度一致,可用于后续试验.对转基因油菜进行草甘膦抗性筛选和PCR扩增检测,共获得5株转基因阳性植株.实时荧光定量结果发现转基因阳性植株内phyA和EPSPS基因的表达量均较对照植株有显著提高.【结论】本研究成功构建了抗草甘膦和磷高效吸收基因双价植物表达载体,获得的转基因阳性植株同时兼具草甘膦抗性及磷素高效吸收利用的特性,为培育甘蓝型油菜优良种质资源提供了理论依据.     

甘蓝型油菜反义 Fad2 基因 RNAi 载体无选择标记转化研究

利用甘蓝型油菜种子特异性贮存蛋白基因cruciferin启动子及NOS终止子构建了无选择标记基因且含有反义结构的油酸脱饱和酶基因(Fad2)的RNA i表达载体。通过农杆菌介导法,获得了无选择标记转基因植株;再生植株的PCR检测表明,外源基因已高频率地整合到油菜基因组中,而且获得的转基因种子通过脂肪酸含量分析表明,油酸含量比对照有了很大的提高。     

甘蓝型油菜F3’H基因反义植物表达载体的构建

类黄酮3’-羟化酶(F3’H)是类黄酮途径中的一个关键酶,对种皮色泽和花色的形成具有重要作用。通过PCR法扩增了甘蓝型油菜(Brassica napus L.)F3’H基因的一段特异保守片段F3’HA,并将其亚克隆到中间载体pCAMBIA2301G中,构建了F3’H反义植物表达载体pCAMBIA2301-F3’HA,通过PCR鉴定和酶切鉴定证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌LBA4404菌株中形成工程菌株。为进一步研究F3’H基因在甘蓝型油菜种皮色素合成途径中的分子生物学机理和该基因的代谢调控网络奠定基础。     

Bt毒蛋白基因导入甘蓝型油菜获得转基因植株

以甘蓝型油菜湘油13号为试验材料,建立了高效稳定的子叶柄再生体系,以4～5d无菌苗的子叶柄为外植体,6-BA含量为4.5mg/L时,不定芽的再生频率最高.同时探索了影响根癌农杆菌介导转化甘蓝型油菜子叶柄的各种因素,并将Bt毒蛋白基因导入甘蓝型油菜品种湘油13号,获得了转基因植株,Southernblot分子检测证明,Bt毒蛋白基因已整合到油菜基因组中.     

十字花科黑腐病菌hrpW基因导入油菜之研究初报

为了研究十字花科植物黑腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,简称Xcc)hrpW基因的功能及Xcc的致病机理,实验以甘蓝型油菜为试验材料,以5～6d无菌苗的带柄子叶为外植体,建立了高效稳定的带柄子叶再生体系,同时探索了影响根癌农杆菌介导转化甘蓝型油菜子叶柄的各种因素;并用农杆菌介导法将hrpW基因导入甘蓝型油菜中,经PCR检测法分析,证明hrpW基因已整合到油菜基因组中。hrpW基因编码HarpinXcc(十字花科植物黑腐病菌Harpin蛋白),该转基因植株的获得,为进一步研究十字花科植物黑腐病菌的致病机理提供了材料,也为选育高效抗病油菜种质奠定了基础。