黄瓜液泡膜H+-PPass基因CuPPase的cDNA克隆、序列分析与表达

 利用GenBank 登录的植物液泡膜焦磷酸酶氨基酸保守区序列设计简并引物,利用RT-PCR 和RACE-PCR 技术从黄瓜叶片中获得了一个液泡膜H⁺-PPase 基因,命名为CuPPase,GenBank 注册号为GQ223786。CuPPase 蛋白与南瓜、绿豆同源性最高,分别为94%,92%。生物信息学分析表明,该基因全长2 650 bp,开放阅读框（ORF）2 307 bp,编码768 个氨基酸;CuPPase 蛋白大小约80 kD,理论pI值为5.32。该基因有14 个强的跨膜螺旋结构,PlantCare 分析结果显示该基因序列具有脱落酸诱导、生长素诱导、赤霉素诱导、水杨酸诱导、低温诱导、干旱诱导的顺式作用元件。RT-PCR 表明,CuPPase 在叶和根中表达较高,茎中表达较低。CuPPase表达受盐胁迫以及高温、低温胁迫诱导,但与处理时间有密切关系,其表达均表现先升高后降低的趋势。     

脐橙CsNAC基因的克隆及其在果实贮藏过程中的表达分析

从脐橙(Citrus sinensis Osbeck)果皮褐变相关基因的cDNA抑制差减文库中,筛选了一个与NAC基因家族同源的EST序列,通过RACE技术成功克隆了CsNAC基因全长cDNA序列共1 203 bp,并对其进行了序列分析。结果表明,CsNAC包含一个918 bp的开放阅读框(ORF),编码305个氨基酸,预测的蛋白质分子量为35.2 kDa,等电点为6.72;CsNAC蛋白N端具有一个高度保守的NAC结构域;进化树分析表明CsNAC属于NAC蛋白家族的ATAF亚家族,可能参与胁迫反应。荧光定量PCR表达分析结果表明,CsNAC在果实贮藏过程中,随着果皮褐变的发生,与对照相比褐变果皮中的表达水平明显增强。说明CsNAC基因与脐橙果实的果皮褐变具有密切关系。     

黄瓜3–磷酸甘油醛脱氢酶基因CsGAPDH的克隆及其涝胁迫响应分析

 以黄瓜耐涝品系‘早二N’根组织总RNA为模板,运用RT-PCR结合RACE技术,获得了黄瓜3–磷酸甘油醛脱氢酶基因（CsGAPDH）的cDNA全长序列,基因编码区共1 011 bp,编码336个氨基酸（GenBank登录号HQ156465）。系统进化分析表明：CsGAPDH基因与胡萝卜、葡萄、大豆等双子叶植物同源基因的核苷酸序列相似性均在88%以上,与单子叶植物水稻和玉米同源基因的相似性达86.8%和86%。qRT-PCR表达分析结果表明：CsGAPDH基因快速响应涝胁迫,在涝胁迫2 h,该基因在根中表达量达到对照水平的12倍,在涝胁迫12 h达到表达高峰,随后表达量呈现逐渐下降趋势;CsGAPDH基因在‘早二N’的根、茎、叶中均有表达,根和叶中原始表达量高于茎,在涝胁迫4 h后均诱导表达,根中诱导表达量上调幅度最大,为初始表达量的4倍。CsGAPDH属于黄瓜涝胁迫响应基因,在缓解涝胁迫伤害过程中可能具有重要的调控作用。     

黄瓜3-磷酸甘油醛脱氢酶基因CsGAPDH的克隆及其涝胁迫响应分析

以黄瓜耐涝品系‘早二N’根组织总RNA为模板,运用RT-PCR结合RACE技术,获得了黄瓜3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（CsGAPDH）的cDNA全长序列,基因编码区共1011bp,编码336个氨基酸（GenBank登录号HQ156465）。系统进化分析表明：CsGAPDH基因与胡萝卜、葡萄、大豆等双子叶植物同源基因的核苷酸序列相似性均在88%以上,与单子叶植物水稻和玉米同源基因的相似性达86.8%和86%。qRT-PCR表达分析结果表明：CsGAPDH基因快速响应涝胁迫,在涝胁迫2h,该基因在根中表达量达到对照水平的12倍,在涝胁迫12h达到表达高峰,随后表达量呈现逐渐下降趋势;CsGAPDH基因在‘早二N’的根、茎、叶中均有表达,根和叶中原始表达量高于茎,在涝胁迫4h后均诱导表达,根中诱导表达量上调幅度最大,为初始表达量的4倍。CsGAPDH属于黄瓜涝胁迫响应基因,在缓解涝胁迫伤害过程中可能具有重要的调控作用。     

黄瓜转录因子CsCBF3 的克隆及表达分析

利用RT-PCR 技术从黄瓜中克隆了植物低温信号转导途径中的关键转录因子C-repeat-Binding
Factor3，将其命名为CsCBF3，GenBank 登录号为JQ900769。CsCBF3 基因开放阅读框全长为615 bp，
编码204 个氨基酸。进化树分析表明，CsCBF3 隶属于CBF 基因家族，与葡萄CBF3 蛋白亲缘关系最近，
而与黑麦草、水稻CBF3 蛋白亲缘关系较远。生物信息学分析结果表明，CsCBF3 编码的蛋白包含保守的
AP2 DNA 结合域，N 端的核定位信号区和C 端的酸性氨基酸富集区，且该蛋白中的一些磷酸化位点及二
级结构在与DNA 互作过程中发挥重要作用。荧光定量PCR 检测结果显示低温可诱导CsCBF3 的表达，且
其表达量在迅速达到峰值后又降低，说明CsCBF3 是一个快速响应基因，推测其在黄瓜耐冷过程中起着重
要的作用。     

低氮胁迫下黄瓜钙依赖蛋白激酶基因的克隆及表达分析

在低氮胁迫下，以黄瓜品种津研4 号叶片为供试材料，以cDNA 为模板，依据黄瓜基因组数
据库中Csa002986 基因编码区全序列，应用Primer Premier 5.0 软件设计引物，克隆得到黄瓜钙依赖蛋白
激酶基因（calcium-dependent protein kinase，CDPK）。该基因全长1 584 bp，编码527 个氨基酸。预测
该基因编码的蛋白是一个稳定的亲水蛋白，无跨膜结构，无信号肽，存在蛋白激酶结合区、EF 手型钙结
合区、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点、N 酰基化位点等多个位点。CDPK 基因在不同氮浓度处理下黄瓜
各部位表达分析结果显示，在无氮条件下，CDPK 基因在茎尖表达量最高，其次为叶和茎；在低氮条件下，
CDPK 基因在茎中表达量最高，其次为茎尖和叶；在正常及高氮条件下，CDPK 基因在茎尖表达量最高，
其次为茎和叶。CDPK 基因在叶中的表达模式分析结果显示，在无氮及低氮胁迫下CDPK 基因表达量增加，
随着氮浓度的降低，CDPK 基因的表达量增加并明显高于对照；在高氮胁迫条件下，CDPK 基因的表达量
低于对照。     

蜡梅胚胎晚期丰富蛋白基因CpLEA的克隆及表达分析

从蜡梅 （Chimonanthus praecox）花cDNA文库中获得了1个胚胎晚期丰富蛋白（LEA）基因的cDNA全长序列,命名为CpLEA（GenBank登录号：JF412788）,该基因cDNA含有一个273 bp编码91个氨基酸的开放阅读框,从蜡梅基因组DNA中扩增该基因发现,该基因含有两个大小分别为35 bp和707 bp的内含子。生物信息学分析显示,CpLEA的编码蛋白含有4个胚胎晚期丰富蛋白第3族LEA蛋白特有的11个氨基酸的基元重复序列,进化树分析表明该编码蛋白与榛子的LEA蛋白亲缘关系最近。通过原核表达获得了与预期大小一致的融合蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在蜡梅成熟种子中表达量最高,在根中几乎不表达;在盛开期花的各个部位中又以雌蕊中的表达量最高;在花发育早期表达量较高,随后下降并保持相对稳定,在衰败期突增并达到最高;检测该基因在脱落酸（ABA 50 μmol · L^-1）、低温（4 ℃）、高温（42 ℃）、干旱（30% PEG6000）和高盐（NaCl 1 mol · L^-1）5种外源非生物胁迫因子作用下的表达特性。结果表明,该基因能够被ABA、低温、高温、PEG 和NaCl诱导表达,并在随后的时间内呈现出不同的表达模式。表明CpLEA可能在蜡梅花发育和多种非生物胁迫响应中发挥作用。     

柿花发育相关的MADS2box基因克隆与表达

以雌花型柿(Diospyros kaki) ‘阳丰’花为试材, 克隆得到一个与其花发育相关的MADS2box基因, 命名为DkMADS1, GenBank登录号为DQ412058。该基因cDNA全长1 193 bp, ORF为747 bp, 编码一个含有249个氨基酸的蛋白。DkMADS1 具保守的MADS区及半保守的K区, 与其它植物中的MADS2box蛋白有很高同源性。RT-PCR表达分析表明, 该基因在‘阳丰’花的萼片、花瓣、子房和‘禅寺丸’的雄蕊中均有表达。     

甜瓜CmGnT基因的克隆及非生物胁迫下的表达分析

为了探究非生物胁迫下甜瓜N–乙酰氨基葡萄糖基转移酶基因(CmGnT)的作用机制,根据甜瓜cDNA序列设计引物,利用RT-PCR技术克隆得到CmGnT。生物信息学分析表明,CmGnT的cDNA全长为2 193 bp,开放阅读框(ORF)为1 179 bp,编码392个氨基酸。CmGnT蛋白分子量约为46 kD,理论等电点(pI)为7.93。蛋白结构分析表明,CmGnT含有β–1,4–N–乙酰氨基葡萄糖转移酶结构域,属于糖基转移酶17家族。该基因编码的蛋白有1个强的跨膜螺旋结构。进化树分析表明,CmGnT氨基酸序列与黄瓜CsGnT(登录号:XP_004135275.1)亲缘关系最近,同源性为99.74%,与西瓜Cs Gn T的同源性为97.70%。实时荧光定量PCR分析结果表明,在NaCl、PEG、H_2O_2和ABA等非生物胁迫下的甜瓜叶片中CmGnT都显著上调表达,表明CmGnT受非生物胁迫诱导,推测其在甜瓜响09应非生物胁迫过程中起到重要作用。     

甜瓜中甜菜碱醛脱氢酶基因CmBADH的克隆及非生物胁迫下的表达分析

 以甜瓜（Cucumis melo L.）‘TS-2’为材料,根据GenBank 登录的植物甜菜碱醛脱氢酶氨基 酸保守序列设计兼并引物,利用RT-PCR 和3′、5′RACE 技术从甜瓜叶片中克隆到1 个甜菜碱醛脱氢酶基 因,命名为CmBADH,在GenBank 中的注册号为：JN091961.1。生物信息学分析表明,该基因全长1 856 bp, 编码503 个氨基酸,BADH 蛋白大小约54 kD,理论pI 为5.182。甜瓜BADH 蛋白与麻疯树同源性最高, 为82.96%。该基因编码蛋白有4 个强的跨膜螺旋结构。PlantCare 分析结果显示该基因序列具有茉莉酸甲 酯、防御与胁迫、玉米醇蛋白代谢途径、低温、光响应、分生组织表达、生理周期调控等顺式作用元件 和干旱诱导的MYB 结合位点。实时荧光定量PCR 表明,CmBADH 受盐、干旱、低温、高温诱导,其表 达均呈现先上升后下降的趋势;CmBADH 还随外源ABA 诱导时间的延长呈现上升表达的趋势。     

不同浓度NO3- 胁迫下黄瓜幼苗根系分生区细胞内Ca2+分布变化的差异

 以‘新泰密刺’黄瓜为试材, 采用焦锑酸钙沉淀的电镜细胞化学方法, 研究不同浓度NO₃^- 胁迫下黄瓜幼苗根系分生区细胞内Ca²⁺的分布变化, 以期为探讨不同浓度NO₃^- 胁迫下细胞Ca²⁺行为特征与黄瓜对NO₃^- 适应性之间的关系。结果表明, 对照生长条件下(14 mmol·L^-1 NO₃^- ) , 黄瓜根系分生区细胞内Ca²⁺主要出现在细胞膜和小液泡内, 线粒体、细胞质和细胞核及核仁内也有少量的较小颗粒钙沉淀。而其它浓度NO₃^- 胁迫下, 其根系分生区细胞Ca²⁺定位分布变化明显。在56和140 mmol·L ^-1NO₃^- 浓度下, Ca²⁺有向细胞基质分布的趋势, 其细胞间隙、细胞质和线粒体中亦出现大量钙沉淀颗粒。且不同处理浓度下, 线粒体和小液泡数量及结构变化较大。而当NO₃^- 浓度达182 mmol·L ^-1时, 根系分生区各细胞器内钙沉淀颗粒明显减少, 此时Ca²⁺的变化是各细胞器及膜系统遭严重破坏的结果。综上可知, 黄瓜幼苗可通过根系分生区液泡内Ca²⁺向细胞基质分布变化, 来增加对高浓度NO₃^- 胁迫的抗性。     

Molecular cloning and characterization of a cucumber MAP kinase gene in response to excess NO3 and other abiotic stresses

Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) play important roles in the transduction of extracellular signals to the intracellular targets in all eukaryotes. Here, a cucumber cDNA designated CsNMAPK, encoding a mitogen-activated protein kinase was isolated using RT-PCR, 3′ and 5′ RACE. The full-length cDNA sequence contains 1636 bp and an open reading frame (ORF) of 1113 bp, which encodes 370 amino acid residues. According to the phylogenetic analysis, CsNMAPK belongs to subgroup I MAPK in plants. Northern blot analysis revealed that CsNMAPK expressed differently in response to excess NO₃⁻. And the CsNMAPK expression kinetics between a salt-resistant cultivar (Xintaimici) and a salt-sensitive cultivar (Shennongchunwu) was slightly different under 182 mmol L⁻¹ NO₃⁻ treatment. The mRNA levels also increased after 24 h treatments with H₂O₂ and salicylic acid (SA), but decreased with abscisic acid (ABA) and low-temperature. However, there was no significant induction of CsNMAPK gene after 24 h drought and high-temperature treatments. Our results suggested that a MAP kinase cascade may function in excess NO₃⁻ and other abiotic stresses in cucumber.     

猕猴桃成熟果实中脂氧合酶基因的克隆

采用ＰＣＲ扩增方法,从成熟猕猴桃果实组织中克隆到一个８２４ｂｐ的脂氧合酶（ＬＯＸ）基因片段（ｐＫＬＣ１）,该片段含有２７５个氨基酸组成的开放阅读框架,它与拟南芥菜、黄瓜、豌豆、土豆、水稻、大豆、烟草和番茄的核苷酸同源性为５９．０％～７４．６％,氨基酸同源性为６３．１％～７６．３％。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交表明,ｐＫＬＣ１片段为一低拷贝数基因家族所编码。     

龙眼14-3-3基因的克隆与原核表达

 以龙眼(Dimocarpus longan Lour. ) 为试材, 应用同源克隆和RACE方法从花芽中获得了调控 蛋白14-3-3的全长cDNA序列, GenBank登录号为FJ479618 (GI: 218202931) 。该cDNA全长1 121 bp, 包括一个783 bp的开放阅读框, 编码261个氨基酸, 序列比较分析显示14-3-3 cDNA具有较高的保守性。半定量RT-PCR分析结果表明, 14-3-3 mRNA在龙眼叶芽、叶片、花芽和成熟的花中都有表达, 但在花芽中表达量最大。构建了pET14-3-3原核表达系统, 将14-3-3全长cDNA在大肠杆菌中表达, 获得一个分子量约为34 kD的可溶性融合蛋白, 经Western blotting验证, 该蛋白为14-3-3蛋白。     

甜瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因CmGAS1的表达与功能分析

甜瓜（Cucumis melo L.）是棉子糖系列寡糖（Raffinose Family Oligosaccharides,RFOs）转运型植物。肌醇半乳糖苷合成酶（GAS）是催化RFOs合成的关键酶。甜瓜CmGAS1基因（GenBank登录号为AY077642.1）的cDNA全长为1 903 bp,开放阅读框（ORF）为996 bp,编码331个氨基酸。CmGAS1蛋白分子量约为38 kD,理论等电点（pI）为4.81。氨基酸序列比对和系统进化树分析表明,CmGAS1氨基酸序列与黄瓜（AAO84915.1）亲缘关系最近,同源性为98.79%,与西瓜（Cla009222）同源性为97.58%。荧光定量结果表明,甜瓜叶片从幼叶（库）至成熟叶（源）CmGAS1的表达显著升高,第5节位叶片达到最大值。去掉50%叶片植株与对照相比,完全展开功能叶片的CmGAS1表达量明显升高。应用CmGAS1特异性启动子构建CmGAS1的过表达载体,并采用农杆菌介导进行甜瓜遗传转化,获得了PCR阳性转化植株,转化植株完全展开功能叶片的净光合速率以及叶片中的蔗糖、棉子糖、水苏糖含量与野生型相比均有所提高。推测CmGAS1在甜瓜叶片棉子糖系列寡糖合成过程中起重要作用。     

Molecular cloning and expression analysis of the gene encoding sedoheptulose-1, 7-bisphosphatase from Cucumis sativus

Sedoheptulose-1, 7-bisphosphatase (SBPase; EC 3.1.3.37) is a key enzyme in the photosynthetic carbon reduction cycle (Calvin cycle). In the present study, a full-length cDNA encoding SBPase (designated as CsSBP, GenBank accession no. FJ911553) was isolated from cucumber (Cucumis sativus L. cv. ‘Jinyou 3’) grown in solar-greenhouse by RT-PCR and RACE. The cDNA contained 1452 nucleotides with a complete open reading frame (ORF) of 1167 nucleotides, which was deduced for encoding a peptide of 388 amino acids whose molecular mass was inferred to be 42 kDa with its isoelectric point at 6.17. Sequence comparison analysis showed that the deduced amino acid of SBPase from cucumber leaves had high homology to that from other species. Expression analysis by real-time PCR and Western blot revealed that CsSBP mRNA and protein was most abundant in leaves, detectable in stems and fruits, but invisible in roots. A similar difference was found in SBPase activity among leaves, stems, fruits and roots. CsSBP expression at the mRNA and protein level was the highest in mid-position leaves (4th–8th apical expanded leaves) of plants, medium in base position leaves (12th), and the lowest in upper position leaves (1st). However, SBPase activity decreased successively as leaf position declined. The net photosynthetic rate (Pn) of mid-position leaves was also found to be the highest, but that of base-position leaves was lower than upper-position leaves. The diurnal variations of gene expression and SBPase activity in optimal functional leaf (6th leaf) was a single-peak pattern curve, which was similar to that of Pn, and the peak appeared at 12:00. These data indicate that CsSBP expresses only in green tissues of cucumber plants and there are close positive correlations between SBPase activity and gene expression at the mRNA and protein levels, and between SBPase activity and Pn in leaves of cucumber plants.     

野蔷薇（Rosa multiflora）抗白粉病基因RmMlo的克隆与表达分析

以野蔷薇（Rosa multiflora）为试材,采用RT-PCR和RACE方法从叶片中获得了一个Mlo同源基因的cDNA全长,命名为RmMlo,GenBank登录号为JF310747。序列分析结果表明,RmMlo基因cDNA全长为1993bp,包含49bp的5′非编码区、243bp的3′非编码区和一个长度为1700b...     

红肉脐橙番茄红素β-环化酶基因的克隆及在大肠杆菌中的功能表达

以'红肉脐橙'（Citrus sinensis Osbeck 'Cara Cara'）果实中分离的mRNA为模板,经RT-PCR扩增到约1.6 kb的番茄红素 β-环化酶（lycopene β-cyclase,Lcyb）cDNA片段。序列分析表明,该cDNA长1654 bp,包含两个转录本Lcyb1和Lcyb2,最大开放读码框均为1512 bp,可编码504个氨基酸。通过PCR方法获得红肉脐橙Lcyb1和Lcyb2 cDNA编码区全长,构建了Lcyb1和Lcyb2的原核表达载体pET-CitLcyb1和pET-CitLcyb2,并通过颜色互补试验证实表达的融合蛋白6×His-Lcyb1和6×His-Lcyb2均可将番茄红素转化为β-胡萝卜素。     

阔叶猕猴桃果实GalDH cDNA 克隆及其在大肠杆菌中的表达

 以猕猴桃属植物中果实维生素C含量最高的阔叶猕猴桃(Actinidia latifolia Merr. ) 果实为试 材, 经RT2PCR扩增获得约110 kb的L - 半乳糖脱氢酶cDNA片段。生物信息学分析表明, 该cDNA片段长为997 bp, 最大开放阅读框为960 bp, 可编码319 个氨基酸残基, 命名为A lGalDH, GenBank登录号为EU525846, 核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物GalDH核苷酸、氨基酸序列间的同源性分别在76%和70%以上, 且具有醛酮还原酶的保守结构域。构建了其原核表达载体pET-A lGalDH并转化大肠杆菌BL21, 经0.1 mmol·L ^{- 1} IPTG诱导, 获得具有较高活性的表达融合蛋白6 ×His-AlGalDH。经Ni-His亲和磁珠分离纯化, 获得单一的融合目的蛋白条带, 测定其酶活为120 pmol·min^{- 1} ·mg^{- 1}。