江苏省及周边地区猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)分子流行病学调查

为了解中国江苏省及周边地区猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的分子流行病学以及毒株的遗传变异情况,本研究运用PCR技术对来源于不同地区、不同猪场且PCV2检测为阳性的样品进行全基因组序列的扩增和测序,共获得18株PCV2全基因序列,并对所得到的毒株进行遗传变异分析。结果表明,18株毒株与国内外的参考毒株同源性为93.5%~99.7%,而ORF2核苷酸及其推导的氨基酸序列同源性分别为87.1%~99.9%和84.2%~99.6%,说明毒株存在一定程度的变异。系统进化树分析结果显示18株毒株中有5株PCV2a,7株PCV2b,6株PCV2d,其中20150429YC全长为1 766 bp,与(HM038031.1 PCV2d等)参考毒株的同源性为100.0%,未发现PCV2c。同时,Cap蛋白的抗原表位和抗原性也发生了变化。说明,目前江苏省及周边地区猪群中PCV2感染较为普遍,PCV2的流行毒株以PCV2b基因型为主,PCV2d次之。     

三株猪2型圆环病毒甘肃分离株的全基因组序列分析

根据GenBank中发表的猪2型圆环病毒(PCV2)全基因组序列,设计合成了2对引物,采用PCR方法对来自甘肃不同猪场的3份病料中的PCV2进行基因的扩增、克隆和测序,得到全基因组长度为1 768 bp的PCV2Ww株(登录号DQ322701)以及全基因组长度为1 767 bp的PCV2 LZ株和TS株(登录号DQ363860和DQ355153).应用DNAstar软件序列分析可得,3个分离株全基因组与国内外参考毒株核苷酸序列同源性在94.8%~99.4%,3个分离株之间的核苷酸序列同源性为96.4%~99.4%;PCV2分离株与PCV1分离株核苷酸序列同源性为69.0%~70.0%;ORF1和ORF2所编码的氨基酸序列与国内外PCV2毒株比较,同源性也很高,分别为99.0%~99.4%和92.7%~98.7%.进化树分析表明,PCV2分离毒株在进化上存在地域上的相关性.     

浙江地区猪圆环病毒2型检测及遗传变异分析

为了掌握浙江地区猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)流行病学特点和遗传变异情况,应用PCR检测方法,对2018年浙江地区猪场采集的临床疑似病料进行PCV2检测,并对部分阳性病料进行全基因扩增、克隆、序列测定和ORF2遗传进化树分析。结果显示:329份临床疑似样品中,PCV2阳性率27.4%(90/329),其中宁波地区阳性率最高,为52%;保育猪和肥育猪阳性率最高,分别为38.8%(64/165)和68.8%(11/16)。选取7份病料进行全基因组扩增,每个毒株随机挑选3个或4个阳性克隆进行序列测定,共得到22个毒株进行遗传变异分析。22株病株同源性为93.3%~99.8%,与16个参考毒株同源性为93.5%~99.8%。根据遗传进化树分析,22个毒株分别处于3个分支,其中6株PCV2a,6株PCV2b,10株PCV2d,说明目前浙江地区PCV2d是优势毒株。ORF2遗传进化树分析显示,ORF2核苷酸同源性较全基因组核苷酸同源性低, 3个分支分别处于PCV2b、PCV2d和PCV2e,预示浙江地区流行毒株可能在向PCV2e转变。本研究掌握了PCV2在浙江地区的流行动态,为浙江省PCV2疫苗株的选择和疫苗研发提供了理论依据。     

广西PRRSV、PCV、CSF的混合感染及PRRSV分子病原学研究

为了弄清2007年发生于广西一些县市猪场的高致病性猪繁殖与呼吸综合征和其他疾病的混合感染情况,从广西7个县市发生高致病性猪繁殖与呼吸综合征的猪场采集病料,进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒(PCV)及猪瘟病毒(CSF)检测,并对检测的PRRSV进行分子病原学分析。结果显示,经PCR检测,86份样品中有60份为PRRSV阳性,36份为PCV阳性,2份为CSF阳性,说明发生于广西猪群的PRRSV与PCV共感染情况比较严重。通过PRRSVORF5基因序列比较分析发现,来自广西7个县市不同猪场的PRRSV高度同源,核苷酸序列同源性为98.5%~99.8%,推导编码的氨基酸序列同源性为98.0%~100.0%;与VR2332和LV株的核苷酸序列同源性分别为88.7%~89.7%和62.2%~63.1%,氨基酸序列同源性分别为88.6%~89.6%和60.5%~61.3%,表明7个县市不同毒株的ORF5基因区域变异不大,均属美洲型。     

猪圆环病毒3型河北株全基因组序列特征和遗传进化分析

【目的】扩增猪圆环病毒3型(PCV3)全基因组序列,对其进行序列特征及遗传进化分析.【方法】以PCV3阳性样品为模板,利用两对引物扩增全基因组片段并测序,通过DNA Star和MEGA-X软件进行遗传进化分析.【结果】发现1株新PCV3毒株(GenBank登录号:MK105924),PCV3 Cap蛋白为3b亚型,与河北省9株PCV3 Cap蛋白的同源性在97.8%～99.8%;所获得的PCV3与PCV1和PCV2全基因组序列的同源性均小于50%,遗传进化树分析3种PCV处于不同的分支,表明其属于不同的基因型;与国内外其他43株PCV3全基因组序列的同源性在98.7%～99.3%,其中与俄罗斯PCV3毒株(GenBank登录号:MG679916)的同源性最高,为99.3%,表明不同PCV3毒株之间的全基因组序列的同源性很高,尚未发现明显的变异;与GenBank上已发表的全部国内外174株PCV3的全基因组序列进行遗传进化树分析,发现全球PCV3及其亚型的分布有地域的差异.【结论】获得1株新PCV3毒株,其与PCV1、PCV2属于不同的基因型;不同PCV3毒株之间存在着较高的同源性;全球PCV3及其亚型的分布与地域有一定的关系.     

京津冀地区猪圆环病毒3型的全基因组克隆与分析

【目的】监测近期在京津冀地区流行的猪圆环病毒3型毒株及其基因变异情况。【方法】以近期京津冀地区猪圆环病毒3型阳性临床样品为模板，用PCR技术扩增猪圆环病毒3型全基因组片段，随后进行基因克隆、序列测定和序列分析。【结果】PCR扩增、序列测定和BLAST比对结果显示获得4株大小都为2 000个核苷酸的猪圆环病毒3型全基因组序列。基于全基因组核苷酸分析结果显示，这4株猪圆环病毒3型与选取的国内外15株猪圆环病毒3型的同源性均达98.4%以上，系统发育树显示上述PCV3毒株所处的分支虽有所不同但却都非常近，表明不同猪圆环病毒3型毒株之间的全基因组核苷酸有非常高的同源性和保守性。基于开放阅读框2基因核苷酸的系统发育树显示上述猪圆环病毒3型毒株被分成3个分支，所得4株猪圆环病毒3型分别归属于基因型a与c,并呈现出一定的地域差异。【结论】获得了京津冀地区4株猪圆环病毒3型全基因组序列，虽然它们具有很高的全基因组核苷酸同源性与保守性，但却分属于2种基因型，并呈现出一定的地域差异。     

猪圆环病毒1型和2型四川分离株全基因克隆分析

参照Genbank收录猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)1、2型序列,设计两对特异性引物,分别扩增猪圆环病毒1型和2型四川分离株(PCV1-YA1株和PCV2-SC株)全基因组,获得了预期目标大小一致扩增产物,分别将其克隆于PMD18-T载体,分别命名为PMD18-T-PCV1-YA与PMD18-T-PCV2-SC。经酶切鉴定和序列测定证实,成功克隆了PCV1-YA1株1759bp和PCV2-SC株1767 bp的全基因组序列。所得序列与GenBank中的国内外其它PCV1和PCV2毒株进行比较分析,其同源性分别达到98.8%~99.9%与93.6%~98.6%;而PCV1-YA1株和PCV2-SC株之间的同源性则仅为69.2%,进一步分析两个毒株的主要阅读框架,毒株间ORF1核苷酸序列及推导的氨基酸同源性均为85.3%,而ORF2的核苷酸序列及推导的氨基酸同源性分别为66%和65.2%。推导显示两毒株之间ORF1编码产物疏水性区域分布有相似之处,而ORF2编码产物的跨膜区存在差异。     

广东省猪圆环病毒2型毒株分离 及全基因序列分析

为了解广东省猪圆环病毒2 型(PCV2）的流行、变异及进化情况,对2013 年广东省多个猪场发生PCV2 感染的病猪血清进行PCV2 病毒分离,参考GanBank 上已发表的PCV2 全基因序列,设计3 对引物,用PCR 方法扩 增其全基因序列,测序并进行序列分析。结果分离到9 株PCV2 毒株,全基因序列长度都为1 767 bp。同源性分析表 明,9 株PCV2 分离株核苷酸同源性为93.6%~99.4%,与2012 年分离株同源性为94.5%~99.7%,与2011 年分离株同 源性为94.2%~99.7%,与GenBank 中其他PCV2 分离株的同源性为93.2%~99.7%。9 株PCV2 的ORF2 核苷酸及其推 导的氨基酸序列同源性分别为89.0%~99.9%和86.4%~100%,存在一定的变异。基因型分析表明,有5 株属于 PCV2d,3 株属于PCV2b,1 株属于PCV2a。对2011要2013 年分离的PCV2 基因组特征进行分析,发现PCV2 核苷酸序 列比较稳定,与世界其他分离株也具有较高的同源性。     

5株PCV2四川株全基因组的克隆与遗传进化分析

【目的】了解目前四川省猪圆环病毒2型(PCV2)的分子流行病学特征和遗传变异情况,探讨PCV2感染的控制对策。【方法】根据GenBank中发表的PCV2基因组序列设计2对特异性引物,对2012-2014年临床送检的PCV2感染病例材料中的5株PCV2全基因组序列进行扩增测序,并利用DNAStar等生物信息分析软件对获得的PCV2基因组序列进行分子特性与遗传演变分析。【结果】5株PCV2四川株全基因组序列长度都为1 767bp,均具有滚环复制起点(ORC)典型结构。序列比对和进化分析显示,5株PCV2四川株的基因序列同源性很高,基因组核苷酸序列及ORF1、ORF2和ORF3基因序列同源性分别为98.4%~99.9%,97.5%~99.6%,99.4%~100%和96.2%~100%,ORF1、ORF2和ORF3基因推导氨基酸序列同源性分别为98.4%~99%,99.6%和91.5%~100%;与47条参比PCV2毒株核苷酸序列的同源性比较发现,5株PCV2与国内一些新出现的PCV2毒株亲缘关系较近,且均属于PCV2d基因型毒株。【结论】5株PCV2四川株之间尽管存在着不同程度的基因变异,但遗传进化相对较稳定。     

云南省猪圆环病毒 2 型遗传进化分析

【目的】调查猪圆环病毒 2 型（PCV2）在云南猪群和牛群中的流行情况,明确云南 PCV2 毒株的遗传变异、分子进化趋势。【方法】采用 PCR 方法对云南省 11 个地区 783 份猪、牛的血液、粪便等样品进行PCV2 病原学检测,对 6 份 PCV2 阳性样品进行全基因组扩增、克隆与序列测定,利用 DNAStar 软件比对分析全基因和 ORF2 氨基酸序列,使用 MEGA 软件绘制遗传进化树。【结果】检测样品的 PCV2 阳性率为 48.73%;共测得 6 株 PCV2 全基因组序列,其中 5 株为 1 767 bp, 1 株为 1 768 bp;经遗传发育分析可知,有 PCV2a 亚型 2 株、PCV2b 亚型 2 株、PCV2d 亚型 2 株;6 株 PCV2 毒株同源性在 94.6%~99.9% 之间,与 GenBank 数据库中 20 条参考株同源性在 91.4%~99.8% 之间;6 株 PCV2 亚型的 ORF2 都有其典型的氨基酸位点,PCV2a 毒株在第 80（V80L）氨基酸位点突变为与 PCV2（b/d）一致,PCV2b 毒株在 59（R59K）、63（K63R）、190（A190T）等氨基酸位点突变与 PCV2d 一致。【结论】PCV2 在云南猪群中普遍存在,以 PCV2a、PCV2b 和 PCV2d 这 3 个基因亚型共存为主,且 PCV2（a/b）有向 PCV2d 突变的趋势,荷斯坦奶牛尚未感染 PCV2。