暗纹东方鲀芳香化酶基因的结构及表达分析

性腺型芳香化酶基因是一种调节雌雄激素平衡的基因。为初步探究暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因在性腺发育和性别分化过程中的作用,通过RACE及荧光定量PCR技术,成功克隆出暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因的cDNA全长序列,共1786 bp,编码514个氨基酸,与红鳍东方鲀及星点东方鲀同源性最高。氨基酸序列分析显示,该基因编码的蛋白是一种稳定的亲水性蛋白,但不存在信号肽序列;性腺型芳香化酶含有38个磷酸化位点、4个N-糖基化位点、2个跨膜保守结构域;其氨基酸序列在哺乳动物和鱼类中均十分保守,且含有跨膜区、Ⅰ-螺旋区、Ozol′s肽区、芳香化酶特异性保守区和亚铁血红素结合区等功能保守区。表达分析显示,暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因主要在肌肉和卵巢中表达,其次在其他组织中也有少量表达,而且在幼鱼不同发育期卵巢中的表达量呈现出逐渐升高再降低的表达趋势,在精巢中则基本不表达。研究结果表明,性腺型芳香化酶基因很可能参与了暗纹东方鲀雌鱼性腺分化后卵巢的发育、雌性特征的维持和其他组织的发育等过程。     

芳香化酶抑制剂对暗纹东方鲀CYP19A、DMRT1基因表达及性腺分化的影响

采用组织学和分子生物学方法,研究了投喂芳香化酶抑制剂来曲唑(LE)后暗纹东方鲀(Takifugu obscures)初孵仔鱼CYP19A、DMRT1基因表达以及性腺的组织学变化,以期进一步了解P450芳香化酶(P450arom)在鱼类早期性别分化过程中的作用。RT-PCR结果显示,对照组样品CYP19A和DMRT1表达显示性二态,雌性表达CYP19A基因,雄性表达DMRT1基因。LE处理组在性别分化期间,雄性样品单一表达DMRT1,雌性样品则同时表达CYP19A和DMRT1。qRT-PCR结果显示:LE处理组雌性仔鱼CYP19A基因表达被显著抑;虽然在仔鱼出膜后22d(dph)的表达水平高于9 dph,但仅为同日对照组的2.11%。LE处理组雌性样品22 dph时DMRT1基因表达量上调,至150 dph时达对照组雄性水平。55 dph的性腺组织学结果表明,LE处理可导致暗纹东方鲀稚鱼原始卵巢退化,并向功能性精巢发育。150 dph的LE处理组性腺均为精巢,并与对照组精巢发育同步。结论认为,暗纹东方鲀性腺分化期间P450arom是卵巢形成和维持发育所必须的,抑制P450arom活性可导致雌性暗纹东方鲀发生雄性化逆转。     

暗纹东方鲀TGF-β1基因的克隆、表达特征及生长性状相关SNP位点筛选

为探究暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)TGF-β1基因与其生长性状的关联及作用,采用RACE技术克隆了暗纹东方鲀TGF-β1基因,分析了其基因结构与表达特征,并通过直接PCR扩增法对TGF-β1基因进行多片段比对,在此基础上筛选出与生长性状相关的SNP位点。研究发现TGF-β1基因cDNA全长共2 217 bp,包含5′UTR 51 bp, 3′UTR 1 014 bp, ORF 1 152 bp,编码383个氨基酸。氨基酸序列比对分析表明,暗纹东方鲀TGF-β1基因与红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)同源性最高(92.82%)。进化树分析表明,暗纹东方鲀TGF-β1基因编码氨基酸序列与红鳍东方鲀聚为一支,与鲈形目鱼类亲缘关系最近(68.46%～73.33%)。qRT-PCR检测显示,TGF-β1基因在暗纹东方鲀8种不同组织(心脏、肝脏、脑、脾脏、肾脏、肌肉、中肠和鳃)都有表达,其中肾脏表达量最高,心脏和脾脏表达量次之。通过SNP位点不同基因型与个体生长性状的相关性分析,发现TGF-β1上的SNP g. 3908 C>A位点与暗纹东方鲀多项生长性状...     

红鳍东方鲀幼鱼中性别分化相关基因的表达分析

为查明性别分化相关基因在红鳍东方鲀性别分化关键时期的表达规律,以孵化后40、60、80 d的红鳍东方鲀幼鱼为试验对象,对性腺进行组织学观察,并对采样个体进行遗传性别鉴定,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法研究amhr2、dmrt1、gsdf、cyp19a1a、foxl2、dnmt1基因在遗传型为XX(雌性)...     

暗纹东方鲀Amhr2基因外显子9的SNP7271检测及其与性别相关分析

利用传统PCR和ABI 3730测序技术对暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)Amhr2基因外显子9进行了SNP7271检测和测序分析,并对该SNP位点与暗纹东方鲀性别相关性进行了研究。结果显示,在SNP7271位点发生了G/C碱基突变,产生了CG、CC两种基因型。SNP7271和暗纹东方鲀性别存在显著相关性(P0.01)。基因型为CG的个体生理性别为雄性,基因型CC的个体生理性别为雌性。     

拟赤梢鱼卵巢早期发育与sox3基因cDNA克隆及表达分析

为初步阐明拟赤梢鱼(Pseudaspius leptocephalus)卵巢发育特征及sox3 (sry related high mobility group box 3)基因在其卵巢发育过程中的作用,本研究通过组织切片观察了拟赤梢鱼卵巢早期发育过程,利用RACE技术克隆了该鱼sox3基因cDNA全长序列,并进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR技术分析了sox3基因在拟赤梢鱼不同组织及性腺不同发育时期的表达模式。结果显示,拟赤梢鱼卵巢在孵化后45 d分化形成,160 d时由Ⅰ期进入Ⅱ期,孵化后360 d,卵巢仍处于Ⅱ期。拟赤梢鱼sox3基因cDNA全长为1 800 bp (GenBank登录号：MT952206),编码299 个氨基酸,存在保守的HMG (histidine, methionine, glycine-rich)结构域。氨基酸序列比对和系统进化树分析结果显示,拟赤梢鱼SOX3蛋白与斑马鱼(Danio rerio)和翘嘴鲌(Culter alburnus)亲缘关系最近。此外,sox3基因在拟赤梢鱼卵巢中表达量最高,其次是脑和眼睛,在精巢和其他组织中微量表达;在性腺分化过程中,sox3基因在卵巢中表达量显著高于未分化性腺和精巢,在卵巢发育阶段表达量不断升高,而在精巢中持续低水平表达。综上,本研究推测sox3基因主要参与拟赤梢鱼卵巢的分化和发育。     

双酚A对暗纹东方鲀幼鱼类固醇合成酶基因表达的影响

为研究环境激素对养殖鱼类性别分化前后的内分泌干扰效应,分别将孵化后25 d(dph)的暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)稚鱼和95 dph的幼鱼暴露于不同浓度双酚A(BPA)(0、50μg/L、200μg/L、1 000μg/L)3周和2周,用荧光定量PCR(QRT-PCR)方法检测编码性类固醇激素合成酶及相关因子的基因(STAR、CYP17a、CYP11b及CYP19a)表达。结果显示,BPA诱导了稚鱼STAR、CYP17a和CYP11b表达上调,且与浓度有正相关,而CYP19a表达在BPA 200μg/L和1 000μg/L浓度下分别暴露3周后显著下调。在幼鱼暴露组中,雌雄性腺发生不同的应答,精巢中STAR、CYP17a及CYP11b的表达出现先下调后上调,CYP19a则呈先受抑制后表达升高;在卵巢中STAR、CYP17a及CYP11b的表达先受抑制,随着时间的延长基因表达上调,CYP19a的表达受抑制。研究结果表明,BPA通过干扰性别分化初期暗纹东方鲀类固醇激素合成酶及相关因子的表达的而对性别分化产生影响;通过抑制雄性暗纹东方鲀中类固醇合成相关基因的表达而表现出内分泌干扰效应。对于雌鱼中类固醇合成相关基因的表达的影响则有波动性的变化,其作用机制仍需要进一步研究。     

两种东方鲀的GH基因单核苷酸多态性分析

根据红鳍东方鲀生长激素基因全序列,设计13对引物,结合单链构象多态性(SSCP)技术和克隆测序技术对野生红鳍东方鲀、养殖红鳍东方鲀和养殖暗纹东方鲀群体进行了遗传多样性分析.结果表明:东方鲀整个生长激素基因的6个外显子中没有多态性,在其内含子2、内含子5以及3′侧翼区发现有多处序列变异位点,包括碱基的缺失、插入和一些单核苷酸突变.这些遗传多态性的存在为从分子水平上对东方鲀的鉴定提供了一定的依据.群体遗传结构分析结果表明,红鳍东方鲀养殖群体的一些等位基因丧失,造成其遗传多样性显著下降,应及早加强对其种质的保护.     

小鼠生物法和酶联免疫法(ELISA)定量监测沿海5省养殖河豚鱼中的河豚毒素(TTX)

为进一步扩大国内养殖河豚鱼消费市场提供依据,应用小鼠生物法监测了我国辽宁、河北、山东,江苏和福建4种养殖河豚鱼(红鳍东方鲀,菊黄东方鲀,双斑东方鲀和暗纹东方鲀4种组织(皮、肉、肝脏和性腺)中河豚毒素(TTX)含量及周年变化,并用酶联免疫法(ELISA)同步检测了山东红鳍东方鲀的皮,肉和肝脏各组及个别卵巢样品。结果4种养殖河豚鱼的皮,肉和肝脏每组平均含毒量均属无毒(小鼠生物法检测结果小于0.5μg/g,ELISA检测结果小于0.8μg/g)。卵巢发现一强毒例,精巢则全部无毒。通过监测,发现养殖河豚鱼组织器官的毒力呈现一定的周年变化。ELISA法与小鼠生物试验测得的结果相符合。养殖河豚鱼皮,肉和精巢认为可以考虑科学安全的利用,肝脏须谨慎对待,由于养殖河豚鱼上市规格较小,卵巢一般无食用意义,加工过程应注意不要污染可食部分。     

暗纹东方鲀心型脂肪酸结合蛋白H-FABP基因克隆与表达分析

为深入了解心型脂肪酸结合蛋白(heart-type fatty acid-binding protein,H-FABP)的结构与功能,采用RACE技术克隆得到暗纹东方鲀H-FABP的全长cDNA序列,共772 bp,开放阅读框为402 bp,编码133个氨基酸。生物信息学分析表明,暗纹东方鲀H-FABP基因具有一个脂质转运蛋白家族保守结构域和多个蛋白激酶磷酸化位点。NJ法系统进化分析显示,暗纹东方鲀与红鳍东方鲀亲缘关系最近,其次是鲈形目。经荧光定量PCR检测,H-FABP基因在暗纹东方鲀所有被检测的组织中都有表达,其中肝脏中的表达量最高,其次为肌肉和心脏,预示H-FABP主要参与脂肪酸氧化分解过程。为探究豆油作为脂肪源的可行性,采用不同比例(0、25%、50%和75%)豆油替代鱼油的饲料投喂初始体质量为(8.31±0.20)g的暗纹东方鲀8周。结果显示,全鱼油组肝脏中H-FABP基因的表达量显著高于50%豆油组和75%豆油组,但与25%豆油组无显著性差异,且随着饲料中豆油比例的增加,暗纹东方鲀肝脏中H-FABP基因的表达量呈下降趋势。研究表明,富含n-3多不饱和脂肪酸的鱼油可以促进脂肪酸氧化分解,能预防脂肪肝。因此,为不影响暗纹东方鲀肝脏脂肪代谢,饲料中豆油替代鱼油的比例应控制在50%以下。     

红鳍东方鲀伪雌鱼卵巢发育迟滞的调控机制

伪雌鱼的培育是红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)全雄制种技术研发的关键环节之一,然而外源雌激素诱导获得的伪雌鱼表现出卵巢发育迟滞,降低了其育种价值和效率。为探讨红鳍东方鲀伪雌鱼卵巢发育迟滞的调控机制,本研究从孵化后20日龄开始,用10 μg/L 17 β-雌二醇(E2)浸泡红鳍东方鲀稚幼鱼,每天浸泡1次,每次2 h,至90日龄结束。在90、180和330日龄分别采集处理组(10 μg/L E2)遗传雄性幼鱼和对照组(0 μg/L E2)遗传雌性幼鱼,比较两组幼鱼性腺的组织学和形态学变化特征、下丘脑-垂体-性腺轴相关激素(FSH、LH、E2和17α, 20βOH-PROG)和基因(fshr、lhr、erα、erβ1、erβ2)及脂质积累相关基因(lpl和vldlr)的变化规律。结果显示: 10 μg/L E2可将遗传雄性幼鱼全部诱导为伪雌鱼,且伪雌鱼直至330日龄未二次反转为间性或者雄性,但其性腺系数、卵母细胞数量及卵黄生成前期的卵母细胞面积均显著小于对照雌鱼。此外, 90日龄伪雌鱼的lhr和pgr的表达量显著高于同期对照雌鱼,而17α, 20β-PROG的含量及fshr的表达量显著低于对照组;180日龄伪雌鱼的vldl表达量显著低于对照组;330日龄伪雌鱼的激素含量及基因表达量没有显著差异。综合分析伪雌鱼性腺发育的形态学、组织学和性腺轴相关激素及基因变化规律可见,足够浓度的外源E2能够诱导并维持伪雌鱼的卵巢特征,但E2浓度过高,一方面可能抑制fshr和vldlr基因的表达,从而影响脂质在卵黄生成早期卵母细胞中的积累,导致红鳍东方鲀伪雌鱼卵母细胞生长迟缓;另一方便,高浓度E2抑制伪雌鱼卵原细胞减数分裂的启动,是导致红鳍东方鲀伪雌鱼卵母细胞数量较少的原因之一。     

通过性腺形状和颜色鉴定红鳍东方鲀的性别

随机采集体长18~20cm、体重200~250g的红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)44尾,解剖观察并记录性腺组织外观,然后利用组织切片技术鉴定个体的性别。结果表明:性腺为细长条状且呈乳白色的个体为雄性个体,而性腺为袋状且呈淡红色的个体为雌性个体,且样本群体中的雌雄性别比例为1∶1。本研究结果为通过性腺外观形状和颜色即可准确鉴定体长为20cm左右的红鳍东方鲀的性别提供了参考依据。     

内源蛋白酶和微生物对冷藏河豚鱼质构软化的作用研究

正2016年9月,中国农业部办公厅和国家食品药品监督管理总局联合发布了《关于有条件放开养殖红鳍东方鲀和养殖暗纹东方鲀加工经营的通知》,有条件地放开养殖红鳍东方鲀和养殖暗纹东方鲀两个品种产品的加工经营,因暗纹东方鲀不可以以鲜活的形式销售,需要对河豚鱼进行贮藏     

低盐胁迫对红鳍东方鲀幼鱼肝脏的酶活性、组织结构及免疫基因表达的影响

为探讨低盐胁迫下肝脏在红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)机体免疫中的作用,在肝脏酶活性、组织结构和基因表达水平3个方面进行了研究。结果表明,低盐(盐度4‰)胁迫下红鳍东方鲀肝脏中总超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)的酶活性显著高于对照组(P0.05);肝脏组织结构中肝细胞发生肿大,形状变形;肝脏IL15和TLR3基因的表达量显著升高(P0.05),而IRF2基因的表达量却未有显著性差异(P0.05)。     

暗纹东方鲀生殖前后性腺中河鲀毒素含量变化的研究

运用荧光检测法测定了暗纹东方鲀生殖前后性腺中河鲀毒素含量变化的情况。研究结果表明：Ⅵ期卵巢中河鲀毒素含量较Ⅴ期卵巢中的含量显著降低;此法不能测出精巢中河鲀毒素的含量情况。     

暗纹东方鲀血细胞发生的观察

通过对暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)血液涂片及头肾、体肾、脾脏和肝脏四种脏器印片的光镜观察,发现血细胞的发育大致经过三个阶段,即原始阶段、幼稚阶段、成熟阶段。实验对不同发育阶段的红血细胞、淋巴细胞、单核细胞、粒细胞进行了观察和测量,并对暗纹东方鲀血细胞的发生过程做了初步探讨。实验结果表明暗纹东方鲀血细胞的发育主要在头肾和体肾,肝脏印片未观察到原始造血细胞,提示肝脏可能不是暗纹东方鲀的造血器官。     

暗纹东方鲀生殖洄游期体内毒素分布规律

暗纹东方鲀在产卵前和产卵时体内毒素含量最高；在其它发育时期，卵巢和肝脏的毒素含量要明显比其它组织和器官中的毒素含量高，肌肉和精巢为无毒。对肝脏进行加热实验表明，150℃条件下连续加热4min可基本去除毒性。对暗纹东方鲀的安全食用进行了讨论。     

暗纹东方鲀越冬养殖试验

暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)属硬骨鱼纲,辐鳍亚纲,棘鳍总目,鲀形目,鲀科,东方鲀属,其肉质洁白、细嫩,味道鲜美,享有“鱼中之王”的美誉,具有较高的经济价值。暗纹东方鲀为近海海域河川洄游鱼类,溯河性强。每年春末夏初,性成熟的亲鱼成群游入江河产卵,幼鱼在江河或通江湖泊中育肥,到翌年春季返回海里,在海里长大,到性成熟时再溯河到淡水中产卵。暗纹东方鲀为肉食性鱼类,在自然界中主食虾、蟹、螺、鱼苗、水生昆虫,是一种对盐度适应能力较强的鱼。近几年,随着暗纹东方鲀人工繁殖技术的突破和养殖技术的成熟,其养殖规模不断扩大。然而,由于…     

暗纹东方鲀线粒体细胞色素b及其侧翼tRNA基因的克隆与序列分析

以暗纹东方纯（Takifugu fasciatus）肝脏的线粒体DNA为模板，按照红鳍东方豚（Takifugu rubripes）线粒体DNA序列设计合成特异引物进行PCR扩增，克隆并测定线粒体细胞色素b（Cyt b）及其侧翼tRNA基因的全序列，结果显示，克隆的暗纹东方纯Cyt b基因（1137bp）及其5’端上游的tRNA^Glu基因和3’端下游的tRNA^Thr基因序列共1327 bp。用DNA分析软件对暗纹东方纯与GenBank中10个目13种鱼类的Cyt b序列进行比较分析，显示暗纹东方纯与这些鱼类的Cyt b基因具有较高的同源性，与同属红鳍东方纯的同源性最高，为96．1％；与同目不同科的矛尾翻车纯（Masturus lanceolatus）和翻车纯（Mola mola）的同源性分别为74．1％和74．8％。tRNA^Glu基因由69个碱基组成，tRNA^Thr基因由72个碱基组成，与红鳍东方纯相应tRNA的碱基组成完全相同。推定的这两种tRNA的二级结构都具有典型的三叶草型结构，各臂的碱基配对率高，稳定性好。根据暗纹东方纯与其他13种鱼的Cyt b基因序列同源性所建立的进化树比较，结果与传统的分类地位基本吻合。     

河鲀异钩虫病的防治方法

河鲀异钩虫病是日本养殖红鳍东方鲀危害最大的寄生虫病,我国在2002年首次确认此病在养殖红鳍东方鲀时发生,笔者于2002年在暗纹东方鲀亲鱼越冬时发现,2003年和2004年一龄暗纹东方鲀越冬时又多次发现,是目前长江口区域养殖暗纹东方鲀鱼种时发病最严重的,损失最大的一种寄生虫病。本病全年均可发生,危害各生长阶段的河纯鱼,并且常常和纤毛虫病、车轮虫病、细菌病并发。