应用基因工程创造抗黄矮病毒转基因小麦新种质

应用花粉管通道法和基因枪法将大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系外壳蛋白基因导入小麦栽培品种，获得了抗大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系的转基因小麦株系（文献检索证明世界上无任何其它抗病毒转基因小麦报道）。转基因植株经ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测，证明ＣＰ基因可稳定遗传到Ｔ３代；经Ｗｅｓｔｅｒｎ测定，证明ＣＰ基因在转基因小麦中已经得到表达；经带毒蚜温室和田间人工接种试验，获得了一些抗病性明显的后代，并得到了ＥＬＩＳＡ验证     

花粉管通道法介导的抗大麦黄矮病毒转基因小麦研究

构建了大麦黄矮病毒GPV株系串联结构复制酶基因植物表达载体pPPI29,通过花粉管通道法转化了CA8686小麦,对T₀代种子进行了分子检测,获得6株转基因小麦,转化率达到0.45%;对获得的T0代转基因小麦进行了田间抗病性鉴定,结果表明4株转基因小麦对GPV株系表现为高抗,可以推迟发病23 d。     

应用农杆菌介导法获得转大麦黄矮病毒GPV株系复制酶基因ORF1的小麦植株

 以生产用4种基因型小麦为材料,利用农杆菌介导法将大麦黄矮病毒GPV株系复制酶基因ORF1分别转化愈龄40d的幼胚愈伤组织,经过G418筛选后,共再生出15株抗性植株,拓宽了小麦农杆菌转化的受体基因型。PCR及Southern杂交分析证实大麦黄矮病毒复制酶基因ORF1已经整合到小麦基因组中,共获得14株转基因植株。抗病性初步检测结果显示,转基因植株对GPV株系具有抗性。研究结果还表明,对于不同的基因型小麦进行转化时,需选择适合本基因型的菌株。     

河北省春小麦黄矮病的主要介体和病毒株系研究

１９９２￣１９９５年的研究结果表明,河北省春麦区麦长管蚜是传播小麦黄矮病毒的优势种群,占张家口坝上、坝下及承德麦蚜发生总量的９４．７５％￣１００％。有翅蚜迁入麦田的时期和数量是影响春麦黄矮病发生程度的重要因素。张家口坝上小麦黄矮病毒株系以麦二叉蚜、麦长管蚜株系（ＧＡＶ）占绝对优势,张家口坝下及承德地区的株系种类较为复杂,除以ＧＡＶ株系为主外,存在禾缢管蚜、麦长管蚜、麦二叉蚜株系（ＰＡＧＶ）及麦二叉     

应用农杆菌介导法获得转大麦黄矮病毒GPV株系复制酶基因ORF2小麦植株

以生产用5种基因型小麦为材料,利用农杆菌介导法将大麦黄矮病毒GPV株系复制酶基因ORF2转化愈龄40d的幼胚愈伤组织,经过G418筛选后,共再生出9株抗性植株,拓宽了小麦农杆菌转化的受体基因型。PCR及Southern杂交分析证实大麦黄矮病毒复制酶基因ORF2已经整合到小麦基因组中。初步抗病性检测结果显示转基因植株对GPV株系具有抗性。研究结果还表明,受体基因型、外植体的生理状态对农杆菌侵染起着至关重要的作用。     

应用基因枪法获得抗大麦黄矮病毒转基因小麦

 以我国特有的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白(CP)基因为材料,设计合成了分别含有Act启动子或Emu启动子的植物表达载体pPPI2、pPPI3和pPPI5。采用基因枪法分别转化小麦幼胚和愈伤组织。诱导成苗后进行PCR检测,T₀代阳性率为18%。对转基因苗的后代进行进一步检测,部分转基因苗阳性株至T₃代PCR检测阳性率为100%,PCR结果CP探针杂交呈阳性反应,序列测定结果与GPV CP基因序列一致,表明GPV CP基因已整合到小麦基因组中。室内抗病性鉴定结果,虽然转基因植株全部发病,但对大麦黄矮病毒GPV株系具有一定的延迟发病作用。     

1992－1993年BYDV株系监测研究

１９９２－１９９３年ＢＹＤＶ株系监测研究周广和，杜志强，钱幼亭（中国农科院植保所北京１０００９４）监测大麦黄矮病毒（ＢＹＤＶ）株系类型及其分布、主流株系及其年度间差异，是大麦黄矮病（ＢＹＤ）流行学研究的重要内容，也是鉴定筛选麦类种质资源抗耐病性，培育...     

应用酶联免疫吸附监测1994～1995年BYDV株系

１９９４～１９９５年从我国南北主要冬、春麦区黄矮病发病田块采集ＢＹＤＶ标样，进行酶联免疫测定。１９９４年测定标样１５９株，其中ＧＡＶ株系１１２株，占测定总数的７０．４４％；ＰＡＶ株系８株，占测定总数的５．０３％；与ＰＡＶ抗体和ＭＡＶ抗体都不发生免疫反应的共３９株，占２４．５３％。１９９５年测定了１８７株ＢＹＤＶ标样，ＧＡＶ株系８４株，占４４．９２％；ＰＡＶ株系１８株，占９．６３％；ＰＡＶ与ＧＡＶ混合感染９株，占４．８１％；阴性反应的７６株，占４０．６４％     

黄瓜花叶病毒运动蛋白基因及其缺失突变体在大肠杆菌中的表达和表达产物的纯化

利用ＣＭＶＦｎｙ 株系ＲＮＡ３ 全长ｃＤＮＡ 克隆, 构建了运动蛋白（ＭＰ） 基因５′端缺失突变体和３′端缺失突变体的原核表达载体。ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 分析表明, 经ＩＰＴＧ 诱导, ＭＰ 基因及其２ 种缺失突变体均能在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ中高效表达。利用分离包含体的方法, 提纯了全长的及Ｃ 端缺失的ＭＰ。光密度扫描分析表明, 提纯产物的纯度达９６ ．６ ％ 。     

关于小麦黄矮病研究中的几个问题

六十年代以来,小麦黄矮病是我国北方麦区发生流行的主要病毒病。这种病毒病的毒源为大麦黄矮病毒(BYDV),我们在研究黄矮病毒的株系和发生流行过程中,注意到了下述的几个问题:     

大麦黄矮病毒GPV株系外壳蛋白基因在E.coli中的表达及抗血清制备

 病毒外壳蛋白基因经适当引物逆转录成cDNA后,应用聚合酶链反应(PCR)扩增,得到大麦黄矮病毒(BYDV)GPV株系的外壳蛋白(CP)基因。将此基因克隆至表达载体pMal,转化E.coli TB1,诱导表达了携带外壳蛋白的融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白量的7%,此融合蛋白的分子量约为60kD,经亲和层析纯化后免疫家兔,获得BYDV-GPVCP的抗血清。     

晋南冬麦区大麦黄矮病毒流行株系监测及防治策略探讨

连续5年(1996～2000年)采集晋南冬麦区小麦黄矮病标样,采用生物学和血清学(酶联免疫吸附法)相结合的诊断方法对该地区的大麦黄矮病毒流行株系进行了鉴别。结果表明,该小麦黄矮病流行区近五年以GAV株系为主流株系,兼有少量GPV、PAV和混合株系存在。同时对小麦抗黄矮病新品种“临抗1号”进行了GPV和GAV两种株系的抗性测定,明确了该品种兼抗GPV和GAV两种株系。根据小麦黄矮病发生现状,提出了一套以选育推广抗耐病品种为主,以药剂防治为辅的综合防治措施。以期为当地小麦生产服务。     

多枝赖草及其转育后代对大麦黄矮病毒PAV和GAV株系的抗性研究

 本文针对大麦黄矮病毒(BYDV) PAV和GAV株系,采用生物学和血清学(ELISA)相结合的鉴定方法,对多枝赖草以及它与普通小麦杂交获得的二体附加系Line24等材料进行抗性测定。首次证明了多枝赖草对我国BYDV-PAV和GAV株系免疫或高抗,而普通小麦-多枝赖草二体附加系Line24以及2个易位系高耐这2种株系。     

三种ELISA方法检测苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎沟病毒的比较

苹果褪绿叶斑病毒（ＡＣＬＳＶ）和苹果茎沟病毒（ＡＳＧＶ）是感染苹果和其它一些果树的重要病毒。作者应用ＰＡＳ－ＥＬＩＳＡ法成功地检测了苹果组培苗中的这两种病毒。为了简化操作步骤,试验了ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ和改良ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ法,并与ＰＡＳ－ＥＬＩＳＡ的检测结果比较。试验结果表明,ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ能检测出ＡＳＧＶ,却不能检测出ＡＣＬＳＶ,与此同时,这两种病毒均可用改良ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ检测。ＤＡＳ     

转基因甜瓜植株的获得及其抗病性

甜瓜（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）子叶外植体能被含双元载体的根瘤农杆菌菌不妨功体内含１个ＮＰＴ－Ⅱ基因（新霉素磷酸基转移酶Ⅱ基因）,以供选择卡妹妹纱抗性的转化甜 １个ＷＭＶ－２ ＣＰ基因（西瓜花叶病毒２号外壳蛋白基因）。卡那霉素抗性植株经ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交试验表明,外源的ＷＭＶ－２ ＣＰ基因确已通过农杆菌介导的转化途径导入甜瓜细胞。目前转基因甜瓜已开花结果。攻毒试验表明,与对照相比,转基因     

大麦黄矮病毒侵染玉米幼苗的初步研究

用大麦黄矮病毒（ＢＹＤＶ）的混合毒原及分离的４种株系,分别在温室和田间接种不同玉米品种幼苗。结果表明：ＢＹＤＶ的ＲＰＶ（缢管蚜株系）和ＲＭＶ（缢管长管蚜株系）侵染玉米幼苗,其症状以细条点症为主,很少产生红叶症。在温室内潜育期为２９～３４ｄ,田间潜育期较短,为１７～２１ｄ。ＢＹＤＶ侵染玉米可造成轻度矮化,且不同玉米品种苗期对ＢＹＤＶ的抗性也存在差异。     

大麦黄矮病毒GPV株系ORF4基因在大肠杆菌中的表达及特异抗血清的制备

 根据已报道的大麦黄矮病毒GPV株系(BYDV-GPV)相关基因序列设计合成引物,利用RT-PCR方法获得ORF4基因,并将其克隆到原核表达载体pET-5a中。经IPTG诱导、SDS-PAGE分析,结果表明:ORF4基因在大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中获得了高效表达,分子量为17 kDa。以回收的表达产物为抗原免疫家兔,制备了BYDV-GPV 17kDa蛋白的特异性抗血清。Western blot检测结果,制备的抗血清可用于检测BYDV-GPV侵染后在燕麦体内表达的17 kDa蛋白。     

灰斑古毒蛾核型多角体病毒结构多肽及核酸的研究

多角体蛋白结构多肽分析结果表明，ＯｅＮＰＶ多角体中可能有碱性蛋白酶存在；纯化病毒粒子ＳＤＳ－ＰＡＧＥ胶板用考马斯亮蓝和银染法分别检出１８和２２种多肽，分子量范围１．０８×１０４～１２．２×１０４Ｄ，其中５种主要多肽；核衣壳检出５条多肽，主要多肽分子量为３１０００±６５０Ｄ；ＰＡＳ法未检出ＯｅＮ－ＰＶ各结构多肽中有糖蛋白存在；ＯｅＮＰＶ－ＤＮＡ经ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄⅢ、ＢａｍＨＩ单酶解分别产生９、１２、１０个片段，经ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄⅢ双酶解产生２０个片段，求得ＯｅＮＰＶ－ＤＮＡ的平均分子量为６５．８×１０６Ｄ，ＯｅＮ－ＰＶ－ＤＮＡ大多呈缠绕卷曲线形分子，少数为环状分子，平均长度１９．７μｍ。     

杆状病毒表达猪传染性胃肠炎病毒钉状蛋白在血清学诊断上的应用

用从猪传染性胃炎病毒（ＴＧＥＶ）强毒Ｍｉｌｌｅｒ株（Ｍ５Ｃ）克隆建立的一株的重组杆状病毒（Ｒ２－２）表达的重组ＴＧＥＶ钉状糖蛋白（Ｓｐｉｋｅ，Ｓ）建立了一种阻断酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）来检测猪群中抗ＴＧＥＶ抗体。实验表明，用重组病毒Ｒ２－２接种昆虫传代细胞系Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ｓｆ９），所表达的重组蛋白量在接种后第７２小明达到最高值；该重组蛋白能与抗ＴＧＥＶ Ｓ蛋白Ａ     

三种外检植物病毒的灭活处理

番茄环斑病毒（ＴｍＲＳＶ），烟草环斑病毒（ＴＲＳＶ），南芥菜花叶病毒（ＡｒＭＶ）的病汁液和ＰＥＧ粗提纯液，经适宜温度或甲醛处理，均丧失侵染性而有抗原性。ＴｍＲＳＶＰＥＧ粗提纯液经６０℃（水浴）处理１０分钟或２８℃７天，ＴＲＳＶ粗提纯液置２５℃一个月，Ａｒ－ＭＶ在４０℃７天条件下均可做为阳性对照的灭活处理的最佳方案。可保存抗原性在７～１２月以上。为了防止危险性检疫病毒的侵入，对入境种苗进行检疫，需建立快速、准确、标准化检疫程序，而在血清学快速诊断试验中，提供阳性对照，对提高判断准确率是必要的。因此，为了解决在诊断试剂中提供阳性对照但又不能使其检疫性病毒人为扩散这一重要问题，我们在研究三种外检病毒（ＴｍＲＳＶ，ＴＲＳＶ，ＡｒＭＶ）的检验技术的同时，又进行了一些灭活试验，用化学和物理方法钝化病毒，使其失去侵染性而保持抗原性，并应用于酶联诊断试剂盒中，本文报道了初步试验结果