miR-142-3p对奶山羊乳腺上皮细胞泌乳功能的影响

为确定miR-142-3p对奶山羊乳腺上皮细胞泌乳功能的调节作用,试验选取泌乳期奶山羊乳腺上皮细胞为研究材料,利用脂质体转染技术抑制miR-142-3p的表达,采用实时荧光定量PCR、Western blotting、试剂盒等检测miR-142-3p基因沉寂后其对奶山羊乳腺上皮细胞泌乳功能的影响。结果显示,miR-142-3p基因沉寂后,奶山羊乳腺上皮细胞增殖能力增强,β-酪蛋白及甘油三酯分泌增加。由此可知,miR-142-3p通过抑制靶基因作用,影响奶山羊乳腺上皮细胞增殖、分泌β-酪蛋白及甘油三酯等泌乳功能。     

抑制miR-142-3p对奶山羊化学诱导乳腺上皮细胞泌乳功能的影响

【目的】探索miR-142-3p对奶山羊化学诱导乳腺上皮细胞(chemical induced mammary epithelial cells, CiMECs)体外泌乳功能的调节作用,旨在为促进转基因乳腺生物反应器的发展以及“培养皿奶”的商业化生产奠定基础和提供新的思路。【方法】选取奶山羊耳缘成纤维细胞(GEFs)为研究材料,经单一小分子化合物TGFβR-1/ALK5的抑制剂(RepSox)诱导8 d后,分别从细胞的形态变化、特异性标记物免疫荧光染色以及油红O染色对其进行鉴定。之后运用脂质体转染技术在诱导成功的奶山羊CiMECs中分别转染miR-142-3p的抑制物(miR-142-3p inhibitor)及抑制物对照(inhibitor-NC),不转染的细胞作为空白对照(BC),转染24 h后,采用实时荧光定量PCR检测miR-142-3p的表达水平,CCK-8法检测细胞的增殖率,Western blotting检测β-酪蛋白(β-casein)的表达量,甘油三酯酶法测定甘油三酯的含量。【结果】GEFs诱导8 d后形成岛屿状多核仁样的上皮样聚集;免疫荧光染色结果显示,诱导后的GE...     

大豆异黄酮对奶牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳性能的影响

通过体外细胞培养方法研究大豆异黄酮对奶牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳性能的影响。取对数生长期的奶牛乳腺上皮细胞,用无血清培养基培养24 h,使细胞同步化后分组试验。试验分空白对照组(0 mg/L大豆异黄酮)和添加不同浓度大豆异黄酮(1、10、100、1000 mg/L)组,培养48 h后,采用CASY 细胞计数仪检测细胞增殖能力与活力,高效液相色谱检测β-酪蛋白和乳糖,甘油三酯检测试剂盒检测甘油三酯的分泌情况。结果表明,与对照组相比,10、100、1000 mg/L大豆异黄酮组奶牛乳腺上皮细胞的增殖能力与活力显著增强(P<0.05);细胞分泌β-酪蛋白、乳糖和甘油三酯的能力也显著提高(P<0.05)。因此,添加10、100、1000 mg/L大豆异黄酮均能促进奶牛乳腺上皮细胞增殖及提高其泌乳性能,且呈一定的浓度依赖性。     

miR-92a对奶山羊乳腺上皮细胞增殖及凋亡的调控分析

miRNAs是对哺乳动物乳腺组织发育及泌乳机能进行调控的重要因子。本研究依据已有的关中奶山羊乳腺组织miRNA表达谱,选择不同泌乳时期差异表达的miR-92a为研究对象,探究miR-92a对山羊乳腺上皮细胞（GMEC）增殖及凋亡的调控作用,并挖掘其潜在的调控基因。采用荧光定量PCR、MTT检测、EdU检测及流式细胞术,检测miR-92a在不同泌乳时期乳腺组织的表达情况,并在细胞水平检测miR-92a对乳腺上皮细胞增殖、凋亡及细胞周期的调控作用。利用RNA-seq技术,分析过表达miR-92a乳腺上皮细胞中的差异表达基因。qRT-PCR结果显示,miR-92a在奶山羊泌乳初期乳腺组织中表达量极显著高于泌乳中期（P<0.01）,表明miR-92a可能对奶山羊泌乳性状有重要的调控作用。GMEC过表达miR-92a后,试验结果显示：与NC对照组比较,miR-92a过表达组的EdU阳性细胞数极显著减少（P<0.01）,S期的细胞数显著下降、G1期的细胞数显著增加,同时miR-92a组的凋亡细胞数目显著增加（P<0.05）。采用RNA-seq,构建了miR-92a过表达mRNA文库,发现下调基因54个,上调基因160个。GO terms及KEGG通路分析显示差异表达基因调控乳腺上皮细胞多种生物学功能。以上结果表明miR-92a促进GMEC凋亡、抑制其增殖,测序结果进一步证明miR-92a对奶山羊乳腺发育及泌乳性能具有潜在的调控作用。     

miR-495-3p对山羊卵巢颗粒细胞功能的影响

旨在探究miR-495-3p对山羊卵巢颗粒细胞功能的影响及作用机制.本研究选取健康的3～4月龄大足黑山羊母羊,收集卵巢颗粒细胞,利用miR-495-3p模拟物(mimics)和抑制物(inhibitor)构建过表达和抑制模型,通过流式细胞术检测细胞凋亡和周期,ELISA分析颗粒细胞的雌二醇(E2)和孕酮(P4)分泌,采...     

miR-142-3p对人乳腺上皮细胞MCF-10A增殖及乳蛋白合成的影响

MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约为22 nt的非编码的调控性小RNA,在诸多生命活动中发挥重要作用,如参与调控细胞的增殖、分化、凋亡及肿瘤的发生发展。本试验应用脂质体转染技术抑制miR-142-3p在人乳腺上皮细胞的表达。试验采用实时荧光定量PCR、Western blotting、细胞增殖分析等技术,探索miR-142-3p对人乳腺上皮细胞增殖及乳蛋白合成的影响。结果显示,miR-142-3p沉默后,催乳素受体(prolactin receptor,PRLR)蛋白表达增强,同时,相关通路蛋白AKT、mTOR、STAT5、cyclinD1表达量均增加,细胞增殖能力增强。结果表明,在人乳腺上皮细胞中,miR-142-3p的沉默使PRLR蛋白表达量升高,通过调控AKT、mTOR、STAT5、cyclinD1相关通路蛋白而促进乳蛋白质的合成和乳腺上皮细胞的增殖。     

Effect of miR-142-3p on Cell Proliferation of Human Mammary Epithelial Cells MCF-10A and Synthesis of Milk Protein

MicroRNAs (miRNAs) are a group of small,non-coding RNA molecules about 22 nucleotides to regulate a wide variety of important biological processes,including cell proliferation,differentiation,apoptosis as well as the progression of tumors.Liposome transfection was used to detect the expression of miR-142-3p in human mammary epithelial cells,the effects of miR-142-3p on the cell proliferation,apoptosis and milk protein synthesis were detected by Real-time PCR,Western blotting,cell proliferation analysis.The results indicated that after miR-142-3p being silenced,prolactin receptor (PRLR) protein was increased,at the same time the expressions of related pathways protein AKT,mTOR,STAT5 and cyclinD1 were increased,the ability of cell proliferation was increased.The results suggested that in human mammary epithelial cells,the silence of miR-142-3p could increase the expression of PRLR protein,miR-142-3p could promote the synthesis of milk protein and increase the proliferation of mammary epithelial cells by regulating related pathways proteins AKT,mTOR,STAT5 and cyclinD1.     

蛋氨酸对体外培养奶牛乳腺上皮细胞泌乳能力的影响

研究蛋氨酸与乳蛋白合成及乳腺泌乳能力的关系。建立体外培养的奶牛乳腺上皮细胞模型,采用高效液相色谱法、实时荧光定量PCR、细胞活力分析仪、甘油三酯试剂盒检测不同浓度蛋氨酸(0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6mmol/L)对体外培养24h的奶牛乳腺上皮细胞泌乳的影响。结果表明,蛋氨酸在1.2mmol/L时对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞增殖的促进作用最明显,乳糖分泌量最高,β-酪蛋白mRNA表达量最高且甘油三酯合成最多(P<0.01)。     

miR-495-3p对山羊骨骼肌细胞增殖分化的影响

【目的】 研究miR-495-3p对山羊骨骼肌细胞增殖分化的影响及其在不同组织中的表达情况,为探究miRNA在肌肉发育中的调控机制提供理论基础。【方法】 利用生物信息学方法预测miR-495-3p的靶基因;实时荧光定量PCR检测miR-495-3p及其靶基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌等组织中的表达水平。构建miR-495-3p的过表达(miR-495-3p mimic、miR-495-3p mimic NC)及抑制物(miR-495-3p inhibitor、miR-495-3p inhibitor NC),在山羊骨骼肌细胞汇合度达60%~70%时进行转染,并用含2%马血清的培养基进行诱导分化,用CCK-8检测细胞增殖活力,实时荧光定量PCR检测过表达和干扰效率及增殖分化相关基因配对盒基因(paired-box 7,Pax7)、细胞蛋白周期E(Cyclin E)、肌细胞生成素(myogenin,myoG)、生肌因子5(recombinant myogenic factor 5,Myf5)的表达;构建miR-495-3p靶基因的野生型和突变型载体并转染至293T细胞,用双荧光素酶测定miR-495-3p与其靶基因的结合情况。【结果】 生物信息学预测结果表明,miR-495-3p的靶基因为心肌肌动蛋白α1(alpha cardiacactin 1,ACTC1),且miR-495-3p和ACTC1在1和10月龄山羊背最长肌中表达量均差异极显著(P<0.01)。miR-495-3p和ACTC1在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌6种组织中均有表达,在背最长肌中表达量较高。细胞转染结果表明,miR-495-3p mimic极显著促进miR-495-3p的表达(P<0.01),miR-495-3p inhibitor极显著抑制miR-495-3p的表达(P<0.01),说明miR-495-3p mimic和miR-495-3p inhibitor可用于后续试验。实时荧光定量PCR结果表明,过表达miR-495-3p促进骨骼肌细胞分化相关标志基因MyoG、Myf5的表达,抑制miR-495-3p则降低MyoG、Myf5基因的表达;过表达、干扰miR-495-3p对Pax7、Cyclin E基因的表达及细胞增殖活力均无显著影响(P>0.05)。双荧光素酶报告结果表明,miR-495-3p与ACTC1基因存在靶向关系。【结论】 miR-495-3p对山羊骨骼肌细胞的增殖无显著影响,但可通过靶向ACTC1基因促进山羊骨骼肌细胞分化。     

王不留行增乳活性单体对奶牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳性能的影响

应用CASY细胞分析仪及HPLC分别检测王不留行邻苯二甲酸二丁酯对乳腺上皮细胞增殖、细胞活力及乳腺上皮细胞分泌β-酪蛋白、乳糖的影响,研究王不留行增乳活性单体邻苯二甲酸二丁酯对奶牛泌乳中期乳腺上皮细胞增殖和泌乳性能的影响。试验结果表明,王不留行增乳活性单体成份邻苯二甲酸二丁酯对奶牛乳腺上皮细胞的增殖和细胞活力提高均显著(P0.05);能显著提高乳腺上皮细胞β-酪蛋白的表达(P0.05),也能提高乳糖的分泌(P0.05,P0.05)。因此,王不留行增乳活性单体邻苯二甲酸二丁酯可显著提高乳腺上皮细胞的增殖和泌乳能力。     

中草药添加剂对奶牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳性能影响

为探讨中草药添加剂对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响,选取3种与泌乳功能相关的中药（甲珠、通草、蒲公英）,应用CASY细胞分析仪及HPLC分别检测其对奶牛乳腺上皮细胞增殖、细胞活力及乳腺上皮细胞分泌β-酪蛋白、乳糖的影响。试验结果表明,通草对乳腺上皮细胞泌乳性能影响不显著（P〉0.05）;甲珠和蒲公英对奶牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白和乳糖分泌有显著的促进作用（P〈0.05）,并呈一定的剂量依赖效应,综合考虑确定蒲公英30 mg/mL为其最佳作用浓度。     

miR-138对小鼠乳腺发育及泌乳功能的影响

microRNAs(miRNAs)在各种类型细胞增殖、分化和凋亡中发挥了重要作用。miR-138参与乳腺发育周期过程中细胞增殖分化的调控。试验以小鼠为动物模型,尾静脉注射miR-138基因抑制剂,应用幼鼠体重称重法,检测miR-138抑制后乳腺泌乳量变化;应用电子显微镜等技术观测乳腺组织形态变化,抑制miR-138后,小鼠乳腺上皮细胞增加,乳汁分泌量增加;抑制miR-138后,观察小鼠乳腺组织超微结构可发现,乳腺细胞的代谢活动增强;收集尾静脉注射miR-138 抑制剂的小鼠乳汁,检测发现其乳糖、乳中酪蛋白含量均有所增高。研究认为,miR-138可刺激乳腺上皮细胞增殖,增加乳腺发育泌乳过程中乳的分泌,并且调控乳汁中重要成分含量。     

Identification of IGF2BP1-related lncRNA-miRNA-mRNA network in goat skeletal muscle satellite cells

Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1 (IGF2BP1) plays essential roles in the proliferation of skeletal muscle satellite cells (MuSCs). Increasing evidence has shown that IGF2BP1 regulates the expression of noncoding RNAs and mRNAs. However, the related molecular network remains to be fully understood. Therefore, we performed RNA sequencing and analyzed the microRNAs (miRNAs), long noncoding RNAs (lncRNAs), and mRNAs differentially expressed in goat MuSCs treated with IGF2BP1 overexpressing and empty vectors. A total of 36 miRNAs, 59 lncRNAs, and 44 mRNAs were differentially expressed caused by IGF2BP1. Expectedly, they were enriched in muscle development-related Rap1, PI3K-AKT, and FoxO signaling pathways. Finally, we constructed a lncRNA-miRNA-mRNA interaction network containing 30 lncRNAs, 15 miRNAs, and 34 mRNAs, in which several miRNAs, including miR-133a-3p, miR-204-5p, miR-125a-3p, miR-145-3p, and miR-423-5p, relate with cell growth and participate in muscle development. Overall, we constructed an IGF2BP1-related network, which provides new insight into the myogenic proliferation of goat.     

microRNA-425-5p对3T3-L1前体脂肪细胞增殖、分化的影响

为了探究miR-425-5p对小鼠3T3-L1前体脂肪细胞增殖、分化的影响效应,本试验采用实时荧光定量PCR检测miR-425-5p组织和细胞表达水平;运用CCK8、EdU、油红染色、甘油三酯含量分析等分别检测miR-425-5p对前体脂肪细胞增殖、分化的影响;利用生物信息学软件和双荧光素酶报告试验分别预测、验证miR-425-5p调控前体脂肪细胞分化的靶基因。结果表明,miR-425-5p在肥胖小鼠脂肪组织中低表达,在前体脂肪细胞增殖、分化过程中动态表达;与阴性对照相比,过表达miR-425-5p可促进前体脂肪细胞增殖,抑制脂肪细胞分化标志基因(PPARγ、C/EBPα、FAS等)表达,减少脂滴和甘油三酯积累;抑制miR-425-5p表达可抑制前体脂肪细胞增殖,阻止前体脂肪细胞诱导分化。在前体脂肪细胞分化过程中,过表达或抑制miR-425-5p可分别抑制或促进IGF1基因表达;与阴性对照相比,过表达miR-425-5p可抑制IGF1基因3′-UTR荧光活性,而突变miR-425-5p种子序列与IGF1基因3′-UTR的绑定位点可解除该抑制效果。综上所述,miR-425-5p可促进3T3-L1前体脂肪细胞增殖,并可直接靶向IGF1负向调控其分化。     

奶山羊CIDEa基因的克隆、序列分析与组织表达

为获得奶山羊CIDEa基因序列并检测其在乳腺组织中的表达,采用RT-PCR技术从奶山羊乳腺组织扩增CIDEa基因序列,利用生物信息学软件对其进行预测分析,并采用荧光定量PCR检测CIDEa在干奶期和不同泌乳时期乳腺组织中的表达。结果表明:通过克隆测序得到奶山羊CIDEa基因CDS区660 bp,编码219个氨基酸,与GenBank公布的绵羊、牛、人和猪的核苷酸序列同源性分别为99%、96%、85%、85%。奶山羊CIDEa蛋白属于碱性、不稳定亲水蛋白,不存在跨膜结构和信号肽;蛋白主要定位在细胞质、线粒体和细胞核。CIDEa蛋白结构主要由α螺旋、β折叠和不规则卷曲组成。奶山羊CIDEa在泌乳前期、盛期和中期乳腺组织中表达量均显著高于干奶期(P<0.05)。说明CIDEa可能参与奶山羊乳腺的泌乳过程,为进一步研究其在奶山羊乳腺组织中的功能及对乳品质的调控作用奠定基础。     

Polymorphism of caprine milk alphas1-casein in relation to performance of four Polish goat breeds

Polymorphism of goat milk alphas1-casein was determined and potential relations between genetic variants of this protein fraction and goat performance were evaluated. The investigations were performed on 598 goats assigned to of 4 breed groups (White improved 254 units, Coloured improved--124, White non-improved--146 and Coloured non-improved--74). For each goat, alphas1-casein polymorphism was determined in polyacrylamide gel by the PAGE-SDS method and percentage of milk alphas1-casein and gene frequency established. There was evaluated goat performance at successive lactations. In the goat population investigated, AA, AB, BB, AE, BE and EE alphas1-casein genotypes were identified. In all four breeds, alphas1-casein genotype EE clearly predominated (27.2-39.2%), recognized as "medium" and its share was higher in the groups of non-improved goats. It was conditioned by high frequency of gene E alphas1-casein (0.419-0.622). Generally, EE genotype percentage was higher in the non-improved goat groups. The improved goats, though, obtained higher productivity in each of the lactation studied. Analysis of relationships between alphas1-casein genetic variants and goats performance confirmed a significant influence on milk, protein and fat yields only in the Coloured improved goat group. There was revealed a more general tendency indicating a significant impact of "strong" alphas1-casein genotypes on a concentration of basic milk components, i.e. fat and protein, especially casein. In a group of goats producing milk of the highest casein content (over 2.4%) and protein (over 3.0%), the animals showing "strong" alphas1-casein variants dominated (85 and 70 %).     

干扰CREB基因对奶山羊乳腺上皮细胞脂质合成相关基因表达及甘油三酯合成的影响

旨在筛选奶山羊cAMP应答元件结合蛋白CREB（cAMP response element binding protein）基因的siRNA,揭示干扰该基因后对乳腺上皮细胞中乳脂合成相关基因表达及甘油三酯合成的影响。本研究通过qRT-PCR方法从西农萨能奶山羊乳腺组织中扩增CREB基因完整的CDS区,进行序列分析和不同泌乳时期表达水平分析,合成靶向CREB基因的siRNA,利用荧光定量PCR筛选有效siRNA,并检测脂质合成相关基因的表达,采用试剂盒检测细胞内甘油三酯含量。结果表明：1）克隆得到全长为984 bp的奶山羊CREB基因的CDS区（GenBank登录号：MK158073）,并对其进行生物信息学分析。2）该基因在奶山羊泌乳盛期乳腺组织的表达量为干奶期的1.93倍（P<0.05）。3）成功筛选到靶向CREB基因的有效siRNA,干扰效率为72%（P<0.01）;并将其在奶山羊乳腺上皮细胞进行转染,通过qRT-PCR检测脂质合成相关基因的表达,与对照组相比,干扰CREB基因后显著抑制了FASN、ACACA、SCD1、FABP3、LPL、CPT1B、GPAM和DGAT2基因表达量（P<0.05）,并显著增加了HSL基因表达量（P<0.05）;且细胞内甘油三酯含量被显著下调（P<0.05）。综上所述,CREB基因在奶山羊原代乳腺上皮细胞中很可能通过调控脂质代谢相关基因的表达及甘油三酯含量对山羊的乳脂合成过程发挥重要作用。