滇东南濒危植物长梗杜鹃转录组微卫星特征分析

[目的]全面了解滇东南特有濒危植物长梗杜鹃转录组SSR位点的分布及序列特征,为长梗杜鹃的保护和合理开发利用提供遗传学资料,为同属植物及近缘种SSR标记的开发及遗传研究提供便利。[方法]利用Illumina Hiseq 4000高通量测序平台对长梗杜鹃叶片进行转录组测序,再通过MISA软件对测序所得Unigenes进行SSR位点的发掘和分析。[结果]发现含SSR的序列17 354条,共得到23 192个SSR,出现频率为31.30%,平均每3 kb出现1个SSR。二碱基和三碱基重复为长梗杜鹃SSR主要重复单元类型,分别占SSR总数的69.25%和15.07%,187种重复基元中,所占比例最高的是(AG/CT)n(62.01%),其次是(A/T)n(12.34%)、(AC/GT)n(4.52%)和(AAG/CTT)n(4.23%)。在SSR和CDS的交集基因中,共发现15 908个SSR位点,其中2 792个位于编码区,出现频率为0.076 SSR/kb,而非编码区为0.344 SSR/kb,在基因编码区中出现频率最高的是三碱基重复(1 356,48.57%)。在不同长度重复单元中,二碱基重复SSR长度变异程度最高,其次是单碱基重复。长梗杜鹃SSR的频率和长度呈显著负相关(P0.01),相关系数为-0.566。[结论]长梗杜鹃转录组SSR位点的出现频率高、分布密度大、基元类型丰富、重复次数较高、长片段较多,具有较高的多态性潜能,用于遗传分析的潜力很大,能满足该物种的保护遗传学研究。     

基于沙棘转录组序列开发EST-SSR分子标记

[目的]本研究通过对蒙古沙棘"向阳"品种的转录组序列进行SSR引物开发,为沙棘亲本分析、遗传多样性和遗传育种等研究提供支持。[方法]利用已测得的转录组序列进行分析和筛选,整理具有SSR位点的序列,进行引物设计,随机挑选179条引物进行验证。[结果]得到具有SSR位点的EST序列17 383条,其中,单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复基元分别占62.77%、21.82%和13.77%;二核苷酸重复基元类型以AT和AG为主,三核苷酸重复基元类型以AAG、ATC和ATA为主。9 291条序列设计出扩增EST-SSR位点的引物,随机合成的179对引物中,142对扩增成功,选取其中92个位点的扩增产物上机检测,40个SSR位点(43.48%)呈现多态。对扩增稳定且峰图清晰的17个多态位点的进一步分析,得到蒙古沙棘天然群体在各位点的观测杂合度(HO)为0.083 0.875,期望杂合度(HE)为0.180 0.750。[结论]本研究开发出的EST-SSR标记,为后期进行沙棘属植物遗传多样性分析、遗传图谱构建及分子育种等研究提供了重要支持。     

柿EST-SSR引物的开发及筛选

为丰富柿树SSR引物来源,利用从NCBI下载的9 474条柿属EST序列开发柿EST-SSR引物,并用于分析7个柿品种的遗传多样性。EST序列经去除低质量及冗余片段后拼接成1 390条重叠序列和4 097条无重复序列。共搜索到601条EST序列中含有540个SSR。SSR出现频率为10.96%,其中以2核苷酸为主(61.06%)。利用检出的SSR-ESTs序列设计SSR引物100对,对7个柿样品进行了PCR扩增,31对引物有扩增带,占设计引物的31%,其中14对引物有多态性,占可扩增引物的45.2%。同时发现引物68是临潼板柿的特异引物。引物68的P68-115、P68-160和P68-210处为临潼板柿的3个特异性标记位点,而引物28的P28-225是麻城秋艳的特异性标记位点。     

银杏转录组SSR位点分布及其序列特征分析

【目的】为了探究银杏叶片转录组中简单重复序列(Simple sequence repeats,SSR)的位点信息,以丰富银杏分子标记库,为日后银杏SSR分子标记的筛选和开发、SSR遗传多样性分析、遗传图谱构建和品种鉴定及种质资源保护奠定理论基础。【方法】利用Illumina HiSeq~(TM)2500高通量测序平台获得银杏叶片转录组数据,然后采用MicroSAtellite(MISA)软件对测序获得的299 373条Unigenes序列SSR位点的分布特征进行分析;再利用转录组数据开发SSR分子标记,对6份不同品种(单株)的银杏叶片材料进行扩增和筛选。【结果】通过组装得到了299 373条Unigenes序列,其总长为232 983.457 kb,其中,G+C的占比为42.82%。通过检测,共搜索到SSR位点17 821个,SSR位点的出现频率为5.95%,即平均长为13.07 kb的序列中就含有1个SSR位点,其中,有16 163条Unigenes序列含有1个以上的SSR位点;SSR位点重复类型中最主要的类型是二核苷酸和三核苷酸,分别占SSR位点总数的74.46%和23.37%,其中的AG/CT、AAG/TTC分别是二核苷酸、三核苷酸的优势重复单元,分别占SSR位点总数的31.19%和4.65%;对5种不同SSR位点重复类型的重复次数的统计结果表明,重复次数为5～11次的不同SSR位点类型占SSR位点总数的90.21%;基序长度为10～20 bp的SSR位点数占SSR位点总数的83.17%。利用6个不同品种(单株)的银杏叶片材料对所有引物进行筛选,得到了条带清晰、稳定且多态性好的引物。【结论】根据转录组测序数据中不同SSR位点的分析结果可知,转录组中SSR位点的出现频率相对较高、平均距离较短,说明转录组中SSR位点的数量和种类均较多。随着重复次数的增加,SSR位点的出现频率随之降低。重复次数和基序长度也都说明了转录组测序所得的SSR位点大部分具有多态性的潜能。试验筛选出了条带清晰、稳定且多态性好的引物,其不仅适用于后续的银杏遗传多样性分析,还可以用于银杏的遗传图谱构建和品种鉴定等方面的研究之中。     

基于高通量测序的思茅松微卫星位点的特征分析

以思茅松针叶为材料,采用Illumina Hiseq2000平台测序,得到121 882条无冗余的序列,对这些序列进行SSR位点搜索,共获得3534个SSR位点,出现频率为2.9%,分布平均距离25kb。所搜索的SSR以单核苷酸重复类型最多,其次为三核苷酸和二核苷酸,而四、五、六核苷酸重复类型较少(1%)。单核苷酸重复类型中以A/T基元较丰富(43.58%);二核苷酸中出现频率最高的是AT/TA基元(14.04%),AG/CT次之,AC/GT和CG/CG较低;三核苷酸重复类型中AAG/CTT最多,AGC/CTG和AGG/CCT次之,以CCG/CGG、ACG/CGT和ACT/AGT较少(1%);四、五、六核苷酸类型中各重复基元相差不大,均较少。SSR数量随对应的重复类型重复次数的增加而降低,也随重复区段碱基长度的增加而降低。     

杨树EST-SSR标记的开发

利用来自美洲黑杨及欧美杨的20 023条EST序列,进行EST-SSR标记开发研究.首先对这些EST序列进行序列拼接,然后在非重复序列中发现由二核苷酸至五核苷酸组成的SSR重复序列.共在10 816个非重复序列中发现1 604个序列含有SSR,占总非重复序列的14.8%.在发现的1 918个SSR重复序列中,二核苷酸重复是最丰富的重复类型,占总类型的62.3%.设计合成48对SSR引物,利用6个不同的杨树品种对其进行验证.结果约90%的引物获得扩增产物,58%的引物在6个不同杨树品种中产生多态性分离.另外,还对重复序列的数量及重复类型进行了讨论.     

毛白杨木材形成功能基因内SSR标记的开发及评价

利用直接测序法开发木材形成功能基因内一套新的核基因组SSR标记.通过对参与木材形成的16个基因在40个毛白杨基因型个体中的序列比较分析,共检测剑20个SSR多态性位点.在毛白杨自然群体中,SSR多态性位点的碱基重复呈现出二碱基、三碱基、五碱基、六碱基与七碱基形式,基元霞复次数变异范围为2～34次,其中以二碱基重复的位点较多,占总数的55.0%.在此基础上,依据SSR位点两侧的保守序列,设计20对SSR位点PCR扩增引物对.利用设计的引物检测开发的SSR位点在杨属内15个基因型个体中PCR扩增的有效性及SSR位点的保守性.PCR扩增结果显示,90.0%的SSR位点能够在杨属至少2个派内有效扩增,每对引物组合可检测到SSR多样性位点数为3～9个,平均5.3个.开发的这些SSR位点在功能基因内小同区域的分布频率不同.     

基于转录组序列的楠木SSR分子标记开发

【目的】通过对楠木转录组数据的分析,开发楠木SSR分子标记技术,为楠木遗传多样性分析和资源保护提供保障。【方法】将楠木高通量转录组测序获得的67 331条Unigene进行简单重复序列(SSR)位点挖掘和分析,并结合引物验证,初步证明其可行性。【结果】通过软件分析,共获得9 405个SSR位点,出现频率为13.97%,涉及序列数量为6 667条,发生频率为9.90%。SSR序列中包括166种重复基元类型,其中,单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸为优势重复类型,SSR位点数分别为3 890(41.36%),2 885(30.68%),2 489(26.46%)。SSR位点重复次数差别较大,其中重复10次比例最高,SSR位点数为1 621(17.24%),其次是5次(1 549,16.47%)和6次(1 495,15.90%)。主导重复基元类型为A/T(40.67%),AG/CT(27.59%),AAG/CTT(11.29%)。运用多态性分析的方式初步验证了SSR位点在楠木标记中的可行性。同时,利用Primer 3.0进行引物设计,随机筛选18对进行验证,9对引物可以扩增出预期大小的条带。【结论】通过对楠木高通量转录组序列的SSR信息的研究,获得6 667条SSR序列,主导重复类型为A/T,AG/CT和AAG/CTT。同时随机挑选18对引物对SSR分子标记方法进行验证。本文对楠木SSR标记的研究将有助于楠木基因挖掘、分子标记育种和资源保护。     

杨树抗逆转录因子基因内SSR标记的开发

利用直接测序法开发小叶杨抗逆转录因子基因内一套新的核基因组SSR标记。通过对3个抗逆转录因子共21个成员在36个小叶杨基因型个体中的序列比较分析后共检测到31个SSR多态性位点,SSR出现的频率为1/1916bp。在小叶杨自然群体中,SSR多态性位点的碱基重复呈现出2～5碱基形式,基元重复次数变异范围为3～20次,其中以二碱基重复的位点较多,占总数的51.6%。在此基础上,依据SSR位点两侧的保守序列,设计31对SSR位点PCR扩增引物对。利用设计的引物检测所开发的SSR位点在杨属内22个基因型个体中PCR扩增的有效性及SSR位点的保守性。PCR扩增结果显示,93.5%的SSR位点能够在杨属内至少4个派内有效扩增,每对引物组合可检测到SSR多样性位点数3～12个,平均6个。基于抗逆转录因子基因内开发的SSR标记位点为分子标记辅助小叶杨抗逆性状育种提供工具。     

基于松属不同树种EST序列的马尾松SSR引物开发

利用松属5个树种的EST序列,分别树种查找SSR位点,采用Primer3．0软件进行引物设计。设计的5个树种的EST-SSR引物中：所占比例最高的均为三核苷酸重复,其次是六核苷酸重复,两者之和都达到了64％以上;四核苷酸重复所占比例均为最低。从设计的引物中分别不同树种各选取20对进行引物合成和通用性检测以及马尾松群体检测,结果表明：松属5个树种的EST序列开发的马尾松SSR引物,其在马尾松中的扩增成功率为60％-80％;最高的是辐射松,最低的是海岸松,平均为72％。通用性最好的为辐射松,属内的通用性为94％;属间和科间通用性也分别达到75％和44％。不同树种序列来源的EST-SSR引物,其扩增成功率在10％-30％;最高的是北美短叶松,其次是辐射松,最低的是扭叶松和火炬松;平均为17％。     

Analysis of SSR loci and development of SSR primers in Eucalyptus

In this study,28,691 genome sequences and16,566 expressed sequence tags(ESTs) of Eucalyptus were derived from the Gen Bank database.A total of 2292 SSR loci were sought out from 1785 effective sequences.Through analyses of SSR loci information,the SSR motif length was negatively correlated with the abundance of the SSRs.In the EST sequences of Eucalyptus,triplet repeat motifs were the most abundant,and dinucleotide repeats motifs had the highest frequencies.Subsequently,395 pairs of primers were designed based on the SSR loci.Using optimized SSR-PCR conditions,340 pairs of primers were successfully screened,with a success rate of 86.1%.By construction of a maximum likelihood phylogenetic tree of six eucalypt species,represented by five species of the genus Eucalyptus and one of the genus Corymbia,the genetic relationships of Eucalyptus urophylla and E.camaldulensis suggested by this tree was found to differ from that suggested by traditional morphological taxonomy.The results provide insights for evaluating geneticdiversity of Eucalyptus and analysis of Eucalyptus phylogenetics using SSR markers.     

Analysis of EST-SSRs in silver birch(Betula pendula Roth.)

Simple sequence repeats(SSRs) defined as sequence repeat units between 1 and 6 bp occur abundantly in both coding and non-coding regions in eukaryotic genomes and these repeats can affect gene expression. In this study, ESTs(expressed sequence tags) of Betula pendula(silver birch) were analyzed for in silico mining of ESTSSRs, protein annotation, open reading frames(ORFs),designing primers, and identifying codon repetitions. In B.pendula, the frequency of ESTs containing SSRs was 7.8 %with an average of 1SSR/4. 78 kb of EST sequences. A total of 188 SSRs was identified by using MISA software and dinucleotide SSR motifs(65.9 %) were found to be the most abundant type of repeat motif followed by tri-(27.1 %),tetra-(4.8 %), and penta-(2.2 %) motifs. Based on ORF analysis, 175 of 178 sequences were predicted as ORFs and the most frequent SSRs were detected in 50 UTR(58.43 %),followed by in ORF(31.46 %) and in 30UTR(8.43 %). 102 of 178 ESTs were annotated as ribosomal protein, transport protein, membrane protein, carrier protein, binding protein,and transferase protein. For a total of 102 SSRs(57.3 %)with significant matches, a set of 102 primers(100 %) with forward and reverse strands was designed by using Primer 3 software. Serine(Ser, 19.6 %) was predominant in putative encoded amino acids and most of amino acids showed nonpolar(35.3 %) nature. Our data provide resources for B.pendula and can be useful for in silico comparative analyses of Betulaceae species, including SSR mining.     

Analysis of SSR loci and development of SSR primers in <Emphasis Type="Italic">Eucalyptus</Emphasis>

In this study, 28,691 genome sequences and 16,566 expressed sequence tags (ESTs) of Eucalyptus were derived from the GenBank database. A total of 2292 SSR loci were sought out from 1785 effective sequences. Through analyses of SSR loci information, the SSR motif length was negatively correlated with the abundance of the SSRs. In the EST sequences of Eucalyptus, triplet repeat motifs were the most abundant, and dinucleotide repeats motifs had the highest frequencies. Subsequently, 395 pairs of primers were designed based on the SSR loci. Using optimized SSR-PCR conditions, 340 pairs of primers were successfully screened, with a success rate of 86.1%. By construction of a maximum likelihood phylogenetic tree of six eucalypt species, represented by five species of the genus Eucalyptus and one of the genus Corymbia, the genetic relationships of Eucalyptus urophylla and E. camaldulensis suggested by this tree was found to differ from that suggested by traditional morphological taxonomy. The results provide insights for evaluating genetic diversity of Eucalyptus and analysis of Eucalyptus phylogenetics using SSR markers.     

湖北麻城杜鹃古群落遗传多样性研究

湖北麻城杜鹃是迄今发现的我国最大的古杜鹃原始群落,它不但具有重要的经济观赏价值,而且具有重要的研究价值。利用ISSR分子标记技术对湖北麻城龟山景区的杜鹃古群落遗传多样性进行了初步分析。14个多态引物共检测到182个位点,其中多态位点144个,多态位点百分率为79.12%;平均有效等位基因数为1.470 8个,平均Nei's基因多样性为0.289 3,平均Shannon信息指数为0.447 5,表明该景区杜鹃的遗传多样性较高。     

基于桤木属转录组测序的SSR分子标记的开发

[目的]基于转录组数据开发适用于桤木属树种的SSR标记,揭示其在转录组序列中的分布类型及特征,为桤木属树种分子标记辅助育种提供有利工具。[方法]利用Micro SAtellite(MISA)软件对所有转录组序列进行SSRs搜索,并对SSR位点的数量、分布特征进行统计分析。设计100对SSR引物,采用琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳分离检测方法对3种不同倍性桤木属植物(12份材料)进行遗传多样性检测,确定引物多态性及通用性。[结果]85 769条Unigenes序列中发现8 678个SSR位点,分布在8 298条Unigenes中发生频率为9.67%,转录组序列中平均每14.04 kb长度就有一个SSR位点分布。其中,二核苷酸重复类型数量最多,占65.87%。根据转录组Unigenes序列,利用Primer 3软件共设计出4 531对符合要求的引物,挑选出的100对SSR引物中,获得18对多态性高、稳定性好的SSR引物。[结论]本研究可扩增出多态性位点的引物重复单元以二、三核苷酸重复为主。基于桤木属转录组序列的SSR标记开发是可行的,开发的引物为桤木属遗传多样性分析、分子育种、遗传图谱构建和功能基因的挖掘提供了丰富的候选分子标记。     

Analysis of EST-SSRs in silver birch (<Emphasis Type="Italic">Betula pendula</Emphasis> Roth.)

Simple sequence repeats (SSRs) defined as sequence repeat units between 1 and 6 bp occur abundantly in both coding and non-coding regions in eukaryotic genomes and these repeats can affect gene expression. In this study, ESTs (expressed sequence tags) of Betula pendula (silver birch) were analyzed for in silico mining of EST-SSRs, protein annotation, open reading frames (ORFs), designing primers, and identifying codon repetitions. In B. pendula, the frequency of ESTs containing SSRs was 7.8 % with an average of 1SSR/4. 78 kb of EST sequences. A total of 188 SSRs was identified by using MISA software and di-nucleotide SSR motifs (65.9 %) were found to be the most abundant type of repeat motif followed by tri- (27.1 %), tetra- (4.8 %), and penta- (2.2 %) motifs. Based on ORF analysis, 175 of 178 sequences were predicted as ORFs and the most frequent SSRs were detected in 5′ UTR (58.43 %), followed by in ORF (31.46 %) and in 3′ UTR (8.43 %). 102 of 178 ESTs were annotated as ribosomal protein, transport protein, membrane protein, carrier protein, binding protein, and transferase protein. For a total of 102 SSRs (57.3 %) with significant matches, a set of 102 primers (100 %) with forward and reverse strands was designed by using Primer3 software. Serine (Ser, 19.6 %) was predominant in putative encoded amino acids and most of amino acids showed nonpolar (35.3 %) nature. Our data provide resources for B. pendula and can be useful for in silico comparative analyses of Betulaceae species, including SSR mining.     

基于牡丹EST信息的滇牡丹SSR标记开发

对NCBI(美国国立生物技术信息中心)中牡丹的ESTs(expressed sequence tags)的序列进行分析,结果表明:在所分析的2 204条序列中,仅324条分布有SSRs(simple sequence repeats),占全部ESTs序列的14.70%;SSR的出现频率为15.20%,共计335个,其中,二核苷酸重复比例84.18%,三核苷酸重复比例为15.22%,四和六核苷酸重复比例为0.30%。在此基础上,利用软件(serafer 1.3)设计了51对备选SSR引物,以6个滇牡丹不同花色类群DNA为模板对引物进行筛选,其中,10对引物有扩增产物;用这些引物进一步在10个类群50个DNA模板进行多态性测试,结果显示:上述10对SSR引物均有多态性,且同一类群内不同模板DNA间也存在多态性。本研究结果证明:基于牡丹EST信息建立SSR标记是一种有效而可行的方法,有助于滇牡丹遗传多样性分析及基因组学方面的研究。     

杜仲基因组微卫星特征及SSR标记开发

为全面解读杜仲的遗传背景,本研究在基因组测序(数据未公布)的基础上,通过MISA软件搜索杜仲基因组(26 947/854 758 160 bp)中的完整型(1～7核苷酸重复)及复合型SSR序列,共查找出25 694个Scaffolds含有488592个SSR位点,占总Scaffolds的95.3％.从SSR位点分布密度上讲,平均每1 749 bp出现1个微卫星,其中单核苷酸重复单元的SSR含量最多,约占总数的54.34％,其次为二核苷酸(20.47％),而复合模式、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和七核苷酸重复分别占20.29％、23.89％、0.77％、0.13％、0.10％和0.01％,并发现SSR中均以含A、T的重复类型占主导地位.根据SSR位点设计并合成引物290对,162对SSR引物扩增出清晰的目的条带,其中16对引物多态性高、稳定性好,在8份杜仲资源中共检测到84个等位基因,平均每个SSR位点检测到5.25个等位基因.本研究对于进一步利用SSR分子标记分析杜仲遗传多样性、遗传图谱构建、杜仲雌雄株早期鉴定等具有较高的应用价值.     

日本落叶松EST-SSR标记开发及二代优树遗传多样性分析

利用SSR标记研究选自第1代育种试验林、拟纳入二代育种群体的264株日本落叶松二代优树的遗传变异情况。利用1620条落叶松EST序列进行EST-SSR标记的开发,共发现58条序列中含有67个SSR位点,占全部EST序列的3.58%。获得7个多态性EST-SSR标记,其中5个在朝鲜落叶松、长白落叶松、兴安落叶松和华北落叶松中均可扩增出预期目标片段,且具有多态性,表明这些标记在落叶松属内的通用性良好。利用6个EST-SSR标记和4个gSSR标记对日本落叶松二代优树群体开展遗传多样性分析,每个位点的平均等位基因数为4.6个,有效等位基因平均数为3.1个。群体观察和期望杂合度均值分别为0.5902和0.5702;Nei's基因多样度和Shannon多样性指数分别为0.5691和1.0966;全部单株间遗传相似系数0.1725～0.9667。说明该二代优树群体的遗传多样性较高,具有构建二代育种群体的潜力。