云南金花茶转录组SSR的分布及其序列特征

分析云南金花茶转录组中的SSR位点信息及其序列分布特征,为SSR引物的大量开发奠定前期基础。利用MISA软件分析了云南金花茶转录组数据155 011条Unigenes的SSR位点信息,在云南金花茶转录组中共检测到30 435个SSR位点,出现频率为19.63%,平均3.46 kb就出现1个SSR位点。而重复基元类型从二核苷酸到六核苷酸均有出现,其中二核苷酸重复基元为主要类型,占SSR总数的71.44%;其次是三核苷酸,占SSR总数的25.48%;四核苷酸到六核苷酸仅占3.08%。AG/TC与CT/GA是二核苷酸的优势重复基元,分别占总基元的26.75%与25.17%;CTT/GAA与AGA/TCT是三核苷酸的优势重复基元,分别占总数的2.64%与2.23%。根据云南金花茶转录组测序结果,云南金花茶转录组的SSR位点出现的频率较高,具有丰富的基元类型,并且有较高的重复次数,具有较高的多态性潜力。随机选出50对设计的SSR引物用于检测,其中有14对引物能扩增出清晰且单一的谱带。对云南金花茶转录组数据中SSR位点信息进行分析,可为其SSR引物的设计与筛选、SSR遗传多样性分析以及种质资源的保护提供理论依据。     

利用高通量测序分析青藏高原地区青杨的SSR和SNP特征

利用Illumina HiSeq^TM 2000平台对采自青海玉树的青杨进行高通量测序,SSR分析共获得7 067条SSR序列,复合型SSR共525条,发生频率0.149,平均跨度4 531.87 bp。SSR重复类型中,单核苷酸重复类型最多(33.96%);三核苷酸重复类型次之(31.00%);二核苷酸重复类型位居第三(27.69%);四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重复类型SSR含量很少(<8%)。二核苷酸重复类型中,AG重复类型所占比例最高,GA次之,CT、TC则紧随其后;三核苷酸重复类型中,AAG重复类型所占比例最高,GAA次之,TTC、AGA、GAG、CAG、TCT、TGG等重复类型数量相近。SNP分析发现,L1A中含SNP 162 343个,L2A中含SNP 229 115个。SNP 类型中,转换类型明显高于颠换类型,L1A中转换类型占61.06%,颠换类型占38.94%,L2A中转换类型占61.27%,颠换类型占38.73%。转换类型中,C-T发生频率最高,分别为30.75%、30.66%,A-G发生频率与C-T相差不大,分别为30.31%、30.62%。L1A和L2A 中SNPs类型及其发生频率变化趋势基本一致,L2A中与L1A中相对应的同一SNPs类型的数量之比约为2∶ 1。分析表明,在青杨的遗传多样性中,SNP标记较SSR标记更为可靠。     

基于转录组序列的楠木SSR分子标记开发

【目的】通过对楠木转录组数据的分析,开发楠木SSR分子标记技术,为楠木遗传多样性分析和资源保护提供保障。【方法】将楠木高通量转录组测序获得的67 331条Unigene进行简单重复序列(SSR)位点挖掘和分析,并结合引物验证,初步证明其可行性。【结果】通过软件分析,共获得9 405个SSR位点,出现频率为13.97%,涉及序列数量为6 667条,发生频率为9.90%。SSR序列中包括166种重复基元类型,其中,单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸为优势重复类型,SSR位点数分别为3 890(41.36%),2 885(30.68%),2 489(26.46%)。SSR位点重复次数差别较大,其中重复10次比例最高,SSR位点数为1 621(17.24%),其次是5次(1 549,16.47%)和6次(1 495,15.90%)。主导重复基元类型为A/T(40.67%),AG/CT(27.59%),AAG/CTT(11.29%)。运用多态性分析的方式初步验证了SSR位点在楠木标记中的可行性。同时,利用Primer 3.0进行引物设计,随机筛选18对进行验证,9对引物可以扩增出预期大小的条带。【结论】通过对楠木高通量转录组序列的SSR信息的研究,获得6 667条SSR序列,主导重复类型为A/T,AG/CT和AAG/CTT。同时随机挑选18对引物对SSR分子标记方法进行验证。本文对楠木SSR标记的研究将有助于楠木基因挖掘、分子标记育种和资源保护。     

杜仲基因组微卫星特征及SSR标记开发

为全面解读杜仲的遗传背景,本研究在基因组测序(数据未公布)的基础上,通过MISA软件搜索杜仲基因组(26 947/854 758 160 bp)中的完整型(1～7核苷酸重复)及复合型SSR序列,共查找出25 694个Scaffolds含有488592个SSR位点,占总Scaffolds的95.3％.从SSR位点分布密度上讲,平均每1 749 bp出现1个微卫星,其中单核苷酸重复单元的SSR含量最多,约占总数的54.34％,其次为二核苷酸(20.47％),而复合模式、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和七核苷酸重复分别占20.29％、23.89％、0.77％、0.13％、0.10％和0.01％,并发现SSR中均以含A、T的重复类型占主导地位.根据SSR位点设计并合成引物290对,162对SSR引物扩增出清晰的目的条带,其中16对引物多态性高、稳定性好,在8份杜仲资源中共检测到84个等位基因,平均每个SSR位点检测到5.25个等位基因.本研究对于进一步利用SSR分子标记分析杜仲遗传多样性、遗传图谱构建、杜仲雌雄株早期鉴定等具有较高的应用价值.     

基于沙棘转录组序列开发EST-SSR分子标记

[目的]本研究通过对蒙古沙棘"向阳"品种的转录组序列进行SSR引物开发,为沙棘亲本分析、遗传多样性和遗传育种等研究提供支持。[方法]利用已测得的转录组序列进行分析和筛选,整理具有SSR位点的序列,进行引物设计,随机挑选179条引物进行验证。[结果]得到具有SSR位点的EST序列17 383条,其中,单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复基元分别占62.77%、21.82%和13.77%;二核苷酸重复基元类型以AT和AG为主,三核苷酸重复基元类型以AAG、ATC和ATA为主。9 291条序列设计出扩增EST-SSR位点的引物,随机合成的179对引物中,142对扩增成功,选取其中92个位点的扩增产物上机检测,40个SSR位点(43.48%)呈现多态。对扩增稳定且峰图清晰的17个多态位点的进一步分析,得到蒙古沙棘天然群体在各位点的观测杂合度(HO)为0.083 0.875,期望杂合度(HE)为0.180 0.750。[结论]本研究开发出的EST-SSR标记,为后期进行沙棘属植物遗传多样性分析、遗传图谱构建及分子育种等研究提供了重要支持。     

银杏转录组SSR位点分布及其序列特征分析

【目的】为了探究银杏叶片转录组中简单重复序列(Simple sequence repeats,SSR)的位点信息,以丰富银杏分子标记库,为日后银杏SSR分子标记的筛选和开发、SSR遗传多样性分析、遗传图谱构建和品种鉴定及种质资源保护奠定理论基础。【方法】利用Illumina HiSeq~(TM)2500高通量测序平台获得银杏叶片转录组数据,然后采用MicroSAtellite(MISA)软件对测序获得的299 373条Unigenes序列SSR位点的分布特征进行分析;再利用转录组数据开发SSR分子标记,对6份不同品种(单株)的银杏叶片材料进行扩增和筛选。【结果】通过组装得到了299 373条Unigenes序列,其总长为232 983.457 kb,其中,G+C的占比为42.82%。通过检测,共搜索到SSR位点17 821个,SSR位点的出现频率为5.95%,即平均长为13.07 kb的序列中就含有1个SSR位点,其中,有16 163条Unigenes序列含有1个以上的SSR位点;SSR位点重复类型中最主要的类型是二核苷酸和三核苷酸,分别占SSR位点总数的74.46%和23.37%,其中的AG/CT、AAG/TTC分别是二核苷酸、三核苷酸的优势重复单元,分别占SSR位点总数的31.19%和4.65%;对5种不同SSR位点重复类型的重复次数的统计结果表明,重复次数为5～11次的不同SSR位点类型占SSR位点总数的90.21%;基序长度为10～20 bp的SSR位点数占SSR位点总数的83.17%。利用6个不同品种(单株)的银杏叶片材料对所有引物进行筛选,得到了条带清晰、稳定且多态性好的引物。【结论】根据转录组测序数据中不同SSR位点的分析结果可知,转录组中SSR位点的出现频率相对较高、平均距离较短,说明转录组中SSR位点的数量和种类均较多。随着重复次数的增加,SSR位点的出现频率随之降低。重复次数和基序长度也都说明了转录组测序所得的SSR位点大部分具有多态性的潜能。试验筛选出了条带清晰、稳定且多态性好的引物,其不仅适用于后续的银杏遗传多样性分析,还可以用于银杏的遗传图谱构建和品种鉴定等方面的研究之中。     

杉木不完整型EST-SSR特征分析

SSR可以分为完整型(不间断单一型)和不完整型(包含不间断复合型、间断单一型、间断复合型)。本研究旨在分析杉木(Cunninghamia lanceolata)不完整型EST-SSR特征。结果表明:转录组搜索出5 999个不间断单一型EST-SSR,占全部EST-SSR的97.78%,不完整型所包含3种类型EST-SSR的数量接近,SSR数量之和为136个,仅占转录组全部EST-SSR的2.22%。在杉木136个不完整型EST-SSR中,共有单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、六核苷酸等5种基元重复类型。不间断复合型EST-SSR中基元重复类型的组合数最多,出现了7种组合,间断复合型出现5种组合,间断单一型出现3种组合。     

基于RNA-seq数据开发梨网蝽SSR引物研究

以梨网蝽为材料,从其转录组中筛选功能微卫星序列(EST-SSR),并进行SSR位点的信息分析,开发梨网蝽SSR引物,旨在为深入探究梨网蝽的分子结构奠定理论基础。对梨网蝽转录组中16 449条基因数据库的数据进行搜索,共找到6 641个SSR位点,分布在4 420条基因数据库中,发生频率(含有SSR位点的基因数据库与基因数据库总数之比)为26.87%。在对其各组分数量分析中,发现梨网蝽转录组中SSR的主要重复类型是单核苷酸重复,占SSR总数的40.41%;其次是三核苷酸重复,占SSR总数的22.76%。本试验共设计80对梨网蝽EST-SSR引物,其中9对引物可以扩增得到预期的条带。     

基于桤木属转录组测序的SSR分子标记的开发

[目的]基于转录组数据开发适用于桤木属树种的SSR标记,揭示其在转录组序列中的分布类型及特征,为桤木属树种分子标记辅助育种提供有利工具。[方法]利用Micro SAtellite(MISA)软件对所有转录组序列进行SSRs搜索,并对SSR位点的数量、分布特征进行统计分析。设计100对SSR引物,采用琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳分离检测方法对3种不同倍性桤木属植物(12份材料)进行遗传多样性检测,确定引物多态性及通用性。[结果]85 769条Unigenes序列中发现8 678个SSR位点,分布在8 298条Unigenes中发生频率为9.67%,转录组序列中平均每14.04 kb长度就有一个SSR位点分布。其中,二核苷酸重复类型数量最多,占65.87%。根据转录组Unigenes序列,利用Primer 3软件共设计出4 531对符合要求的引物,挑选出的100对SSR引物中,获得18对多态性高、稳定性好的SSR引物。[结论]本研究可扩增出多态性位点的引物重复单元以二、三核苷酸重复为主。基于桤木属转录组序列的SSR标记开发是可行的,开发的引物为桤木属遗传多样性分析、分子育种、遗传图谱构建和功能基因的挖掘提供了丰富的候选分子标记。     

日本落叶松EST-SSR标记挖掘及特征分析

基于日本落叶松转录组测序(RNA-seq)结果,利用SSRIT工具查找SSR位点,检测到1 788个EST-SSR位点,平均长度是17.5 bp。进一步统计分析发现在落叶松中重复类型SSR位点出现次数最多的是六、三核苷酸,其余依次是五、二、四核苷酸重复类型;同时检测到656种重复基元类型,种类丰富。用Primer Premier 5.0设计500对引物,随机合成102对,以红豆杉科、柏科、松科材料为模板进行检测,结果显示在红豆杉科和柏科里的扩增率分别为95%、50%;在松科不同属的通用性为落叶松属99.01%、黄杉属67.4%、雪松属63.8%、冷杉属67.4%、云杉属70.2%和松属75.7%。利用101对SSR引物对7种不同落叶松品种亲缘关系进行了分析,获得79个多态性位点,在遗传相似系数0.69处将其区分为4个类群。     

滇东南濒危植物长梗杜鹃转录组微卫星特征分析

[目的]全面了解滇东南特有濒危植物长梗杜鹃转录组SSR位点的分布及序列特征,为长梗杜鹃的保护和合理开发利用提供遗传学资料,为同属植物及近缘种SSR标记的开发及遗传研究提供便利。[方法]利用Illumina Hiseq 4000高通量测序平台对长梗杜鹃叶片进行转录组测序,再通过MISA软件对测序所得Unigenes进行SSR位点的发掘和分析。[结果]发现含SSR的序列17 354条,共得到23 192个SSR,出现频率为31.30%,平均每3 kb出现1个SSR。二碱基和三碱基重复为长梗杜鹃SSR主要重复单元类型,分别占SSR总数的69.25%和15.07%,187种重复基元中,所占比例最高的是(AG/CT)n(62.01%),其次是(A/T)n(12.34%)、(AC/GT)n(4.52%)和(AAG/CTT)n(4.23%)。在SSR和CDS的交集基因中,共发现15 908个SSR位点,其中2 792个位于编码区,出现频率为0.076 SSR/kb,而非编码区为0.344 SSR/kb,在基因编码区中出现频率最高的是三碱基重复(1 356,48.57%)。在不同长度重复单元中,二碱基重复SSR长度变异程度最高,其次是单碱基重复。长梗杜鹃SSR的频率和长度呈显著负相关(P0.01),相关系数为-0.566。[结论]长梗杜鹃转录组SSR位点的出现频率高、分布密度大、基元类型丰富、重复次数较高、长片段较多,具有较高的多态性潜能,用于遗传分析的潜力很大,能满足该物种的保护遗传学研究。     

锥栗基因组SSR开发及农家品种的遗传多样性分析

本文对锥栗SSR富集文库进行Illumina MiSeq高通量测序,利用生物信息学对得到的序列进行SSR特征分析,开发锥栗基因组SSR并对农家品种进行了遗传多样性分析。在2051475条序列中,总共搜索到2117345个SSR,以复合形式存在的SSR数量为640155个。二核苷酸为重复单元的SSR数量最多,占总数的73.22%,之后依次为三核苷酸(12.61%)、单核苷酸(12.56%)、四核苷酸(1.33%),单碱基重复、二碱基重复和三碱基重复的优势重复单元分别为:A/T、AC/GT、AAG/CTT。对SSR的长度多态性进行了评价。以8个农家品种为材料,在100对基因组SSR引物中筛选出多态性和特异性较好的引物10对。对25个锥栗农家品种进行了遗传多样性分析观测等位基因和期望杂合度分别为6.3和0.705,有效等位基因数为3.628,Shannon信息指数为1.441,表明锥栗农家品种具有较高的遗传多样性水平。     

杜鹃花表达序列标签资源中的微卫星信息分析

从NCBI数据库下载杜鹃花表达序列标签序列1323条,去冗余后得到912条EST。采用Tandemrepeatfinder软件分析,最终在61条EST序列中找到65个SSR位点,出现频率为7．1272％。二碱基重复是杜鹃花EST内SSR的主要重复类型,占66．1538％;单碱基和三碱基重复次之,分别占据15．3846％和9．2308％。四碱基、五碱基、六碱基类型的SSR相对比较少。多达90．7692％的SSR位点为完美型微卫星重复。这些富含SSR位点的EST序列将为开发微卫星特异性引物,并用于杜鹃花群体生物多样性和遗传结构分析提供理论依据。     

基于苦楝转录组测序的SSR分子标记开发

【目的】基于转录组测序数据开发苦楝SSR标记,为苦楝种质资源的选育、评价和遗传改良提供理论基础和科学依据。【方法】利用Illumina Hi Seq~(TM)2500平台对苦楝叶片进行高通量测序,分别利用Trinity、MISA软件对转录组数据进行拼接组装、序列检索及SSR分布类型和特征分析。采用Primer 3软件设计合成100对SSR引物,分别用2%琼脂糖凝胶电泳和PAGE凝胶电泳进行初步筛选和多态性筛选。【结果】共获得Unigenes 20 077条,平均长度为1 431.82 bp,N50为1 955 bp;对Unigenes进行SSR位点的发掘和分析,发现4 116条Unigenes序列中含有5 469个SSR位点,SSR的发生频率为20.50%,平均分布距离为8.74 kb;单、二、三核苷酸重复单元分别占总SSR的50.23%、24.43%和22.11%; SSR重复单元以6～10次重复的最多,占总数的51.27%。筛选出16对多态性引物并进行PCR扩增,共检测到56个等位基因片段,平均每个位点含3.5个,平均有效等位基因数为2.31个,平均Shannon多样性指数I为0.861,平均多态性信息含量PIC为0.507。【结论】苦楝转录组SSR位点具有较高的出现频率和分布密度,基元类型和重复次数相对较高,具有高多态性的潜能,可以进行有目的的引物设计和开发。开发的16对SSR引物在苦楝上可检测到较高的多态信息含量,进一步丰富了楝科现有SSR标记数据库资源,可为楝科植物在基因组水平上的遗传多样性分析和分子辅助育种等提供参考。     

杨树EST-SSR标记的开发

利用来自美洲黑杨及欧美杨的20 023条EST序列,进行EST-SSR标记开发研究.首先对这些EST序列进行序列拼接,然后在非重复序列中发现由二核苷酸至五核苷酸组成的SSR重复序列.共在10 816个非重复序列中发现1 604个序列含有SSR,占总非重复序列的14.8%.在发现的1 918个SSR重复序列中,二核苷酸重复是最丰富的重复类型,占总类型的62.3%.设计合成48对SSR引物,利用6个不同的杨树品种对其进行验证.结果约90%的引物获得扩增产物,58%的引物在6个不同杨树品种中产生多态性分离.另外,还对重复序列的数量及重复类型进行了讨论.     

毛白杨木材形成功能基因内SSR标记的开发及评价

利用直接测序法开发木材形成功能基因内一套新的核基因组SSR标记.通过对参与木材形成的16个基因在40个毛白杨基因型个体中的序列比较分析,共检测剑20个SSR多态性位点.在毛白杨自然群体中,SSR多态性位点的碱基重复呈现出二碱基、三碱基、五碱基、六碱基与七碱基形式,基元霞复次数变异范围为2～34次,其中以二碱基重复的位点较多,占总数的55.0%.在此基础上,依据SSR位点两侧的保守序列,设计20对SSR位点PCR扩增引物对.利用设计的引物检测开发的SSR位点在杨属内15个基因型个体中PCR扩增的有效性及SSR位点的保守性.PCR扩增结果显示,90.0%的SSR位点能够在杨属至少2个派内有效扩增,每对引物组合可检测到SSR多样性位点数为3～9个,平均5.3个.开发的这些SSR位点在功能基因内小同区域的分布频率不同.     

杜仲转录组微卫星特征分析

为给杜仲SSR分子标记的选择提供参考依据,利用MISA软件对杜仲转录组序列进行了微卫星查找,共获得重复单元长度为1~6碱基的29 067个微卫星序列。分析这些微卫星序列后发现,在杜仲转录组中,长度为二核苷酸的微卫星重复单元最为丰富,占43.7%;在单碱基重复和二碱基重复这两种类型中,最主要的优势重复单元分别是A/T和AG/CT;在三碱基、四碱基、五碱基重复类型中,(AAN)n、(ANAT)n、(AANAN)n分别为其对应的优势重复单元。杜仲转录组中,微卫星的频率随着微卫星总长度的增加而降低。     

基于马尾松干旱转录组的抗旱功能SSR位点分析

[目的]了解马尾松干旱胁迫转录组序列的功能分布和SSR位点分布特征,并探索与干旱关联的SSR位点。[方法]对马尾松幼苗进行持续干旱胁迫,选取干旱10、15、25 d及正常供水对照的马尾松针叶样品,通过总RNA提取、Illumina测序、raw reads去冗、Trinity拼接获得unigenes。利用Blast比对,对Unigene序列进行GO、KOG、KEGG功能注释及分类;利用Misa软件进行SSR位点批量搜寻,primer 3. 0软件进行规模化SSR引物设计;利用GOSeq(1. 10. 0)、KOBAS(v2. 0. 12)软件对差异表达的含SSR位点Unigene进行GO、KEGG显著性富集分析。[结果]马尾松转录组194 821个Unigene中,101 806个Unigene获得注释,包含64 943个GO功能注释、35 880个KOG功能注释及30 882个KEGG注释。搜寻到6 728个SSR位点,分布于6 367个Unigene中,SSR出现频率为3. 45%;重复类型以单、三、二核苷酸为主,分别占总SSR的35. 82%、33. 03%和25. 22%;重复基序以A/T、AT/AT、AG/CT、AGC/CTG、AAG/CTT为主;基序长度以10 20 bp的短序列SSR为主;基序重复次数以5～10次重复占优势;批量设计13 338对SSR引物。422个含SSR位点Unigene具有差异表达; KEGG富集分析发现,有11个含SSR位点的差异Unigene参与了光合作用、植物激素信号传导及类胡萝卜素合成等3个与干旱响应相关的代谢途径。[结论]从较高质量的马尾松转录组中获得101 806个具有注释的Unigene;从6 367个Unigene中挖掘出6 728个SSR位点; 422个含SSR位点的差异表达Unigene中筛选出11个与干旱关联的SSR功能位点,为抗旱功能基因定位及马尾松抗旱分子机制研究奠定基础。     

柿EST-SSR引物的开发及筛选

为丰富柿树SSR引物来源,利用从NCBI下载的9 474条柿属EST序列开发柿EST-SSR引物,并用于分析7个柿品种的遗传多样性。EST序列经去除低质量及冗余片段后拼接成1 390条重叠序列和4 097条无重复序列。共搜索到601条EST序列中含有540个SSR。SSR出现频率为10.96%,其中以2核苷酸为主(61.06%)。利用检出的SSR-ESTs序列设计SSR引物100对,对7个柿样品进行了PCR扩增,31对引物有扩增带,占设计引物的31%,其中14对引物有多态性,占可扩增引物的45.2%。同时发现引物68是临潼板柿的特异引物。引物68的P68-115、P68-160和P68-210处为临潼板柿的3个特异性标记位点,而引物28的P28-225是麻城秋艳的特异性标记位点。     

杨树抗逆转录因子基因内SSR标记的开发

利用直接测序法开发小叶杨抗逆转录因子基因内一套新的核基因组SSR标记。通过对3个抗逆转录因子共21个成员在36个小叶杨基因型个体中的序列比较分析后共检测到31个SSR多态性位点,SSR出现的频率为1/1916bp。在小叶杨自然群体中,SSR多态性位点的碱基重复呈现出2～5碱基形式,基元重复次数变异范围为3～20次,其中以二碱基重复的位点较多,占总数的51.6%。在此基础上,依据SSR位点两侧的保守序列,设计31对SSR位点PCR扩增引物对。利用设计的引物检测所开发的SSR位点在杨属内22个基因型个体中PCR扩增的有效性及SSR位点的保守性。PCR扩增结果显示,93.5%的SSR位点能够在杨属内至少4个派内有效扩增,每对引物组合可检测到SSR多样性位点数3～12个,平均6个。基于抗逆转录因子基因内开发的SSR标记位点为分子标记辅助小叶杨抗逆性状育种提供工具。