枯草芽孢杆菌酸性内切葡聚糖酶的分离纯化及酶学性质

将来源于藏猪粪便的枯草芽孢杆菌BY-4菌株接种于含4%麸皮的产酶培养基中,37℃、220r/min培养48h,发酵上清液经HiTrap Phenyl HP疏水作用层析、HiPrep 16/60Sephacryl S-100凝胶过滤层析分离纯化得到一个内切葡聚糖酶组分,纯化倍数为15.5,回收率为25.0%。经SDS-PAGE、酶谱分析鉴定,两步分离纯化后为电泳纯的纤维素酶,相对分子量约为55 000。酶学性质研究表明,该酶的最适反应pH为4.5,最适反应温度为60℃。Mg2+、Zn2+对该酶有一定的激活作用,而Mn2+、Co2+、Ag+对该酶产生了抑制作用。     

体外酶解菜籽粕最适条件的研究

本实验以菜籽粕为底物,研究纤维素酶和木聚糖酶体外酶解菜籽粕的最适反应条件。分别在温度为35℃、37℃、39℃、41℃,以及p H为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的条件下,研究纤维素酶和木聚糖酶降解菜籽粕的最适反应情况。结果表明,纤维素酶降解菜籽粕的最适温度为37℃、最适p H为6.0;木聚糖酶降解菜籽粕的最适温度为39℃、最适p H为5.0。比较而言,纤维素酶对菜籽粕的降解效果优于木聚糖酶。     

大麦芽阿魏酸酯酶的分离纯化及其部分酶学性质的测定

本试验采用硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE-52离子交换层析对大麦芽中的阿魏酸酯酶(FAE)进行了分离纯化,并测定了其部分酶学性质。结果显示,分离纯化后获得了阿魏酸酯酶纯品,纯化倍数达34倍;经SDS-PAGE电泳显示为单一条带,并测定其相对分子质量约为29.3 ku;最适反应温度为50℃;最适pH为5.5,但阿魏酸酯酶在60℃以下,pH 4.5~7.5之间有较好的稳定性;Zn2+、Cu2+、Fe3+对酶活有很强的抑制作用,Na+和EDTA对酶有一定的激活作用。     

桦剥管菌纤维素和半纤维素降解相关酶性质研究

为了研究桦剥管菌木材纤维素降解机制,试验分别于23℃和28℃培养桦剥管菌,用菌落直径比较生长速度;以白桦木屑、云杉木屑和麦麸为底物诱导培养,以不加木屑的马铃薯液体培养基为对照,测定12 d内桦剥管菌在纤维素外切酶和纤维素内切酶两种纤维素酶活变化;以云杉木屑、白桦木屑、玉米秸秆和麦麸为诱导物,测定15~21 d内木聚糖酶和甘露聚糖酶两种半纤维素酶活变化;检测8种不同金属离子以及金属离子抑制剂EDTA对两种半纤维素酶活性的影响;并对白桦木屑诱导桦剥管菌产半纤维素酶的酶学性质进行了初探。结果表明:桦剥管菌菌丝更适合在28℃培养;纤维素外切酶和纤维素内切酶的最适底物分别为白桦木屑和云杉木屑,木聚糖酶和甘露聚糖酶最适底物分别为麦麸和玉米秸秆;两种半纤维素酶的最适反应温度均为50℃,最适反应pH值分别为5.0和6.0;8种金属离子中,仅Co2+对两种半纤维酶活性均有促进作用,EDTA对两种酶活性均具有较强抑制作用。     

产纤维素酶枯草芽孢杆菌Kpg酶学性质研究及对麸皮纤维素含量的影响

对枯草芽孢杆菌B.subtilis Kpg所产纤维素酶的酶学性质进行研究,确定该纤维素酶的最佳温度和最适pH,并进行固体发酵麸皮试验,验证Kpg纤维素酶的实践效果。试验以3,5-二硝基水杨酸酶活测定法为基础,通过改变纤维素酶的反应温度和pH环境,确定最适反应温度和最适pH环境。为研究其实际降解能力,将枯草芽孢杆菌Kpg添加到麸皮中,在37℃环境中发酵6d。结果显示,枯草芽孢杆菌Kpg纤维素酶的最适反应温度为60℃,此时纤维素酶活性最大为108.45U/mL;反应液最适pH值为6.0,此时纤维素酶活性为97.72U/mL;在两者最适条件共同作用下,纤维素酶活性为113.58U/mL。发酵试验结果显示,枯草芽孢杆菌Kpg能够显著降低麸皮中的纤维素含量(P0.05),同时显著提高发酵麸皮中的真蛋白含量(P0.05)。枯草芽孢杆菌Kpg表现出的酶学性质符合发酵微生物选育的标准和特征,为生物饲料的开发和应用提供数据参考。     

莆田黑猪精液中NAGase酶学特性研究

试验对以莆田黑猪精液为材料分离纯化得到的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)进行了理化特性研究。经硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G100分子筛层析获得PAGE电泳纯化的NAGase酶制剂。以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-GlcNAc)为底物,研究酶催化水解的相关性质。分离纯化获得的酶制剂比活力为1561.42 U/mg,分子质量为58 ku,只有1个亚基,等电点pI为9.13。酶的最适pH为5.6,最适温度为45 ℃,酶在pH 3.6～7.8之间稳定,当pH>8时迅速失活,在50 ℃以下处理30 min酶活力保存稳定,高于50 ℃时,酶活力迅速降低。酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,米氏常数K_m为0.82 mmol/L,最大反应速度V_m为39.23 μmol/(L·min)。催化pNP-GlcNAc反应的活化能为27.30 kJ/mol。金属离子中Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺对酶活力无明显影响,Zn²⁺、Cu²⁺、Pb²⁺对酶有抑制作用。     

饲用细菌纤维素酶的发酵条件优化与性质研究

对从四川卧龙中国保护大熊猫研究中心提供的野外放归大熊猫“祥祥”的粪样中分离到的产纤维素酶菌株JF-1116进行摇瓶产酶培养。试验结果表明,以0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为碳源,1%蛋白胨为氮源,3%麸皮为添加物,在28℃,20%装液量,摇床振荡培养24h后,其发酵液滤纸酶活(FPA)可达111.5U/mL。通过对其粗酶液的性质进行测定,该菌所产纤维素酶粗酶液中的FPA、CMCase和β-葡萄糖苷酶的最适产酶温度分别为50、50、55℃。其中CMCase在pH值4.2～5.4酶活较高,其最适反应pH值为4.8,经50℃处理1h后,可保持原活力的93.5%。     

产纤维素酶芽孢杆菌的诱变和酶学性质研究

为提高芽孢杆菌产纤维素酶的活性,以实验室保存的产纤维素酶枯草芽孢杆菌作为出发菌株,利用紫外线对其进行诱变处理,采用刚果红染色法初筛和3,5-二硝基水杨酸法进行复筛,并对其酶学性质进行初步研究.结果表明:诱变后突变株的纤维素酶活力较出发菌株提高4.476倍.该纤维素酶的最适pH为6.0,且在pH 5.0～7.0酶活力较稳定;该酶的最适酶促反应温度为60 ℃,在无底物保护且水浴30 min的条件下,酶活力在30～65 ℃保持稳定;此外,金属离子K+和Ba2+对酶活力有激活作用,相对酶活分别为108.11％和105.43％,而金属离子Ca2+和Cu2+对酶活性有抑制作用,二者的相对酶活分别为93.80％和89.08 ％.     

不同纤维素酶的酶学性质比较研究

在pH4.8,温度40℃的条件下,测定不同纤维素酶A、B和C的CMCase活力和FPase活力,其中A、B和C的CMCase活力分别为30.088、25.541和3.542u/g,FPase活力分别为6.558、6.703和1.513u/g。同时比较了3种纤维素酶的最适pH、温度及热稳定性,结果表明,酶A、B和C的CMCase最适pH相同,均为4.8;酶A和B的FPase最适pH也相同,为4.8;而酶C为5.4。酶A、B和C的CMCase最适温度均为50℃;酶A和B的FPase最适温度为50℃,而酶C为60℃。热稳定性酶C最好。     

2个枯草芽孢杆菌源纤维素酶基因的克隆、融合表达及其酶学性质分析

本试验旨在构建不同纤维素酶的融合表达系统及探讨融合纤维素酶的酶学性质。利用PCR技术从实验室前期分离的枯草芽孢杆菌中分别扩增2个纤维素酶基因Cel42和Cel22,设计一段柔性接头(GSGGGS),通过酶切连接将2个纤维素酶基因构建在一个开放阅读框(ORF)内,插入到pET32a(+)中构建重组表达载体pET32a(+)-Cel42-Cel22,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,并对其酶学性质进行研究。结果表明:本试验成功克隆了2个纤维素酶基因Cel42和Cel22,并构建了重组表达系统BL21(DE3)/pET32a(+)-Cel42-Cel22,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)估计其分子质量约为101 ku,粗酶液中葡聚糖内切酶活性为57.62 U/mL,葡聚糖外切酶活性为32.57 U/mL。试验所得融合纤维素酶Cel42-Cel22的最适反应温度为50℃,最适反应pH为6.0,温度在30~70℃范围内时可维持70%以上的纤维素酶活性,pH在4.0~9.0范围内时可保持75%以上的纤维素酶活性,除Mn~(2+)外的其他金属离子对纤维素酶的活性均具有一定的抑制作用,其中Hg~(2+)和Cu~(2+)对的抑制作用较明显。由此可见,本试验在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出了融合纤维素酶Cel42-Cel22,且该酶具有一定的活性,可适应较宽广的温度和pH范围,对金属离子敏感。     

纤维素酶活力测定条件研究

用DNS法测定纤维素酶活力,分析测定条件对测定结果的影响。在不同的条件下测定酶活力会得到不同的纤维素酶活力测定值。其中,酶液用量、酶解反应时间、温度对测定结果影响较大,酶液的稀释度、DNS显色时间对测定结果也有一定影响。测定纤维素酶活力的最适条件为:酶解反应时间为30min,最适温度40℃,DNS用量2.5ml,显色时间5min。     

康氏木霉诱变前后纤维素酶组分的分离提纯

康氏木霉NN-15B_7株是康氏木霉854-B_2株经多次理化因素诱变,最后搭载卫星在太空条件作用下筛选出来的变异株.为比较诱变前后两个菌株所产纤维素酶的异同,本实验采用系列分离的方法,首先对其酶组分进行了分离提纯.粗酶粉经Scphadex G75凝胶过滤、DEAE-Scphadex A50离子交换层析和SP-Scphadex C50离子交换层析,分离得到了纯的C_1酶和Cx酶.经鉴定,C_1酶中含有微量Cx酶活力,PAG圆盘电泳只显示1条区带;Cx酶中均测不出C_1酶和β—葡萄糖苷酶活力,PAG圆盘电泳显示4条区带.诱变前后两株纤维素酶的组分分布未见差异.     

嗜酸乳杆菌突变株产共轭亚油酸异构酶的纯化研究

以嗜酸乳杆菌NCFM和Lakcid作为出发菌株,通过紫外诱变及化学诱变筛选得到突变株.代谢亚油酸生成共轭亚油酸(CLA),研究转化过程中的关键性酶-亚油酸异构酶的酶学性质,采用硫酸铵沉淀、透析等对该酶进行纯化,用SDS-PAGE测得该酶的亚基分子量为60.5 ku;并得出该酶的最适温度是44℃,最适pH是6.0左右,金属离子Fe2+、K+对异构酶的反应有促进作用,Zn2+等对反应都起抑制作用.     

猪SIgA分泌片的分离纯化及其多克隆抗体的制备

为制备抗分泌片多克隆抗体,采用分子筛凝胶层析、离子交换层析和硫酸铵盐析法从猪初乳中分离纯化分泌片和SIgA。SDS—PAGE鉴定表明,纯化的SIgA呈现分泌片、重链和轻链三条带,大小约为70ku;凝胶薄层扫描分析SIgA和分泌片纯度分别为90％和89％;琼脂扩散鉴定表明,SIgA和分泌片与抗分泌片单克隆抗体发生了特异反应。以纯化分泌片为抗原,制备抗分泌片多克隆抗体,琼脂扩散检测多抗的效价为1：32。高纯度分泌片的提取及高效价抗分泌片多抗的制备为粘膜负．疫研究奠定了物质基础。     

黑豆多酚氧化酶的分离纯化及其酶学特性研究

试验用磷酸缓冲液提取黑豆粉中的多酚氧化酶,经30%～80%饱和硫酸铵分级沉淀、透析脱盐、DE-52阴离子交换层析对黑豆多酚氧化酶进行分离纯化。酶学特性研究结果表明,在30 min以内,酶活与反应时间基本呈线性关系。在磷酸盐缓冲液中黑豆多酚氧化酶的最适pH为6.8,最适反应温度为50℃,最适底物浓度为0.1%。在供试浓度范围内,高浓度Cu2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Na+、Ca2+及抗坏血酸、EDTA、Na2SO3均是黑豆多酚氧化酶的抑制剂。     

马巴贝斯虫Be82基因截短片段的克隆与表达

本实验在人工合成马巴贝斯虫Be82／236-381A基因的基础上,通过PCR扩增、酶切、串联的连接方法构建了3个Be82／236-381基因截短片段,并连接克隆于pGEX-4T-1中进行了重组蛋白表达。经PCR鉴定,3个重组表达的Be82／236-381基因截短片段的大小分别为192bp、306bp和420bp,与国外发表的基因序列进行比对,其核苷酸的同源性分别为100％、97．3％和96．6％。经SDS．PAGE电泳鉴定,3种融合表达蛋白分子量分别为33ku、37ku和42ku。经ELISA检测,3种融合表达的蛋白均能与马巴贝斯虫阳性血清发生特异性反应。     

高产纤维素酶菌株的筛选、鉴定及产酶特性研究

为了从腐殖质土壤中筛选得到高产纤维素酶菌株,本试验进行了产纤维素酶菌株的筛选、鉴定及其产酶特性研究。首先用羧甲基纤维素钠(CMA-Na)培养基初步分离产纤维素酶菌株,再经过酶活复筛得到一株高产纤维素酶菌株B17。经过形态学和16S rDNA测序鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),并对其发酵产酶条件和酶学性质进行初步研究。试验结果表明,菌株B17的最佳发酵条件为:培养时间3 d、发酵温度35℃、初始pH为6.0,该条件下测得CMC酶活达85.48 U/mL、FPA酶活达59.85 U/mL。酶学性质研究表明:菌株所产纤维素酶最适反应条件为温度50℃、pH为6.0,且具在30～60℃、pH为4.0～7.0范围均具有较高酶活。以上结果表明,本研究所得菌株B17具有较高的开发价值,可应用于农作物秸秆饲料的生产。     

高产纤维素酶菌株的筛选、鉴定及产酶特性研究

为了从腐殖质土壤中筛选得到高产纤维素酶菌株,本试验进行了产纤维素酶菌株的筛选、鉴定及其产酶特性研究。首先用羧甲基纤维素钠(CMA-Na)培养基初步分离产纤维素酶菌株,再经过酶活复筛得到一株高产纤维素酶菌株B17。经过形态学和16S rDNA测序鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),并对其发酵产酶条件和酶学性质进行初步研究。试验结果表明,菌株B17的最佳发酵条件为:培养时间3 d、发酵温度35℃、初始pH为6.0,该条件下测得CMC酶活达85.48 U/mL、FPA酶活达59.85 U/mL。酶学性质研究表明:菌株所产纤维素酶最适反应条件为温度50℃、pH为6.0,且具在30～60℃、pH为4.0～7.0范围均具有较高酶活。以上结果表明,本研究所得菌株B17具有较高的开发价值,可应用于农作物秸秆饲料的生产。     

1株高效低温纤维素分解菌的分离鉴定及产酶条件优化

<正>我国拥有丰富的纤维素资源,但因大量农业废弃物不能及时有效利用造成了资源的浪费,同时也污染了环境[1-2]。而纤维素酶的广泛应用为充分利用纤维素提供广阔途径。大多数中温菌在低于20℃时已基本无代谢外源物质活性,普通纤维素酶的最适作用温度多为45℃⁶5℃,而低温纤维素酶的最适作用温度在20℃左右[3]。耐冷菌能在低温条件下氧化外源物质,有助于在保证催化效率的同时降低反应温度和缩短反应时间,     

产纤维素酶真菌的筛选与鉴定

为从秸秆中分离出能够降解纤维的菌株,试验采取秸秆样品接种马铃薯琼脂培养基,在室温环境下培养,取分离菌接种纤维素刚果红琼脂培养基,筛选能形成较大降解圈的细菌,并进行形态学和分子生物学鉴定,测定其纤维素酶性质。结果表明,经分子生物学鉴定,筛选菌为黑曲霉菌,该菌在室温环境能够生长,菌株降解圈直径(H)与菌落直径(C)的比值(H/C)为7.64。筛选菌在20 ℃环境下培养5 d酶活达到最高值,为42.18 U/mL。纤维素酶最适pH为7.0,最适反应温度为20 ℃,在20~40 ℃或pH 6.0~8.0环境下作用1 h,相对酶活力仍保持在90%以上。综上所述,本试验分离的黑曲霉菌株是低温产纤维素酶菌株,产酶能力较强,具有潜在的开发价值。