猪血管内皮细胞体外培养方法的建立

实验研究了猪血管内皮细胞体外培养方法并对培养的细胞进行了鉴定。获得了传代培养的猪血管内皮细胞。结果表明：用Ⅰ型胶原酶和胰酶消化分离，均可获得接种量的原代培养物，但Ⅰ型胶原酶消化效果更好；原代或早期传代培养物中有时混入的成纤维细胞可用柠檬酸胰酶有效清除。在不用贴附基质和内皮细胞生长因子(ECGF)的条件下，向生长液中加入胰岛素可成功的培养内皮细胞。该细胞在体外培养时贴壁生长，单层细胞呈“铺路石”状排列，细胞间存在接触抑制；第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色阳性，证明培养的细胞为血管内皮细胞。     

猪脐静脉血管内皮细胞的分离及体外培养研究

为建立一种操作简单并且能获得大量猪血管内皮细胞的分离培养方法,本研究采集新生健康长白猪脐带,取其脐静脉血管,灌注0.1%的Ⅰ型胶原酶,于37℃水浴消化10 min后收集内皮细胞,培养于含20%胎牛血清的M199培养基中,长满单层后用胰酶消化传代培养。并对培养的细胞形态学、相关抗原和其他特征以及对病毒的易感性进行鉴定。结果表明,Ⅰ型胶原酶消化后可获得大量内皮细胞,细胞培养后的形态学观察显示细胞贴壁生长良好,呈典型的铺路石状排列;第Ⅷ因子相关抗原和细胞摄取乙酰化低密度脂蛋白均呈阳性,内皮细胞比率可高达100%。传3代后的生长曲线显示细胞传代后延迟期小于1 d,对数生长期约3 d,第5 d进入平台期,第7 d开始脱落死亡。病毒感染试验表明所获得的内皮细胞对猪瘟病毒高度易感,病毒生长与常用的PK-15没有区别。上述研究结果表明本研究建立的血管内皮细胞分离培养方法简便有效,为大量制备原代血管内皮细胞提供了可靠的方法。     

从小鼠类ES细胞分化群中分离培养一类衍生细胞及其培养特性

将小鼠囊胚在饲养层、无类LIF因子的培养基中培养出类ES细胞团,将该类ES细胞团传至第三代,暂停传代,继续培养,则4～5 d后该细胞团会向周围分化出一种圆而发亮的衍生细胞,该衍生细胞会不断地向周围生长,约20 d后该衍生细胞铺满培养皿底.将该衍生细胞传至铺有饲养层的培养瓶中继续传代至第七代,再将其传代至无饲养层的培养瓶中,约12 d后,其在无饲养层的培养瓶中长满瓶底.以后随着传代数的增加,该细胞长满瓶底所需时间越来越短,最后稳定在2～3 d.对传代至第30代的细胞进行生长曲线测定,并以不同的基础培养基、不同的血清浓度、不同的胰岛素浓度等条件培养该细胞,结果发现：该衍生细胞分别在DMEM高糖、DMEM低糖、DMEM-F12、PRMI1640等为基础的培养基中都能生长,但以DMEM-F12为最优.在血清浓度分别为10%、14%、18%的DMEM高糖培养基中培养显示：该细胞在高浓度血清的培养基中具有生长更好的趋势.在胰岛素浓度分别为0、0.25、0.5、1 μg/ml的DMEM高糖培养基中培养显示：该细胞在无胰岛素的培养基中无法正常生长,在0.5 μg/ml胰岛素浓度的培养基中生长最佳.     

桑树悬浮细胞生长规律及其生理特性的研究

以桑品种大10为材料,探讨了3种液体培养基B5、N6、MS中的细胞密度变化及悬浮培养细胞的生长规律,并筛选出最适液体培养基。B5液体培养基较适合桑品种大10细胞的悬浮培养;在液体振荡培养条件下,桑树细胞的生长周期为14 d,接种后1~4 d为延迟期,5~10 d为快速生长期,11~14 d为减慢期,14 d以后进入下降期。悬浮细胞分裂指数在快速生长末期达到最大值5.19%,延迟期的细胞活力最强,之后细胞活力开始下降。     

接种猪瘟兔化弱毒株的永生化猪血管内皮细胞传代情况研究

在传至70代的永生化猪血管内皮细胞接种猪瘟兔化弱毒,72 h后收取细胞上清液并对处理的细胞进行传代培养,分别检测第70、75、80、90、100、105代接毒细胞中病毒,观察各代细胞的生长情况。结果表明,接种猪瘟兔化弱毒后20代(第90代永生化猪血管内皮细胞)的细胞与正常的形态相似,但传至接毒后35代(第105代永生化猪血管内皮细胞)时,细胞稍有拉长现象。各代次细胞中都有猪瘟兔化弱毒的检出。本研究为永生化猪血管内皮细胞生产猪瘟兔化弱毒疫苗奠定了基础。     

人大血管内皮细胞培养条件的完善

本研究的目的是确定支持人大血管内皮细胞增殖的最适培养条件，以人隐静脉内皮细胞（HSVEC）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）为研究对象，研究了基础培养基（14种），胎牛血清（FBS）和有丝分裂原（3种）的影响与细胞增殖的关系。另外还测定了几种胞外基质（ECM）包被的培养皿的效果。结果表明，促进细胞增殖最有效的培养基为MCDB131，与更常用的M119培养基相比，MCDB131可使细胞增殖提高2.3倍，与不加血甭的培养基相比，培养基中加入20?S可使细胞增殖提高7.5倍，肝素（50μg/mL)和内皮细胞生长补充物（ECGS）（50μg/mL)能显著提高细胞增殖，上皮细胞生长因子（EGF）不能提高细胞增殖，与生长在用纤维粘连蛋白，层粘连蛋白，明胶或胶原Ⅰ和Ⅳ包被的培养板上的细胞相比，生长在未包被的培养板上的内皮细胞在增殖和形态方面无统计学差异。HSVEC和HUVEC增殖最大的培养条件为MCDB131培养基中加入2mmol/L谷氨酰胺，20?S，50μg/mL肝素和50μg/mLECGS，ECM包被培养皿无增殖作用。     

猪脐静脉血管内皮细胞分离培养和鉴定

为了建立成熟的猪脐静脉血管内皮细胞(SUVECs)分离培养和鉴定体系,采用1%的I型胶原酶灌注法分离细胞,计数板计数,以10%1640培养基于37℃、5%CO2条件下培养;待融合80%左右胰蛋白酶消化1:2传代,利用倒置显微镜观察细胞生长状态及形态;采用血管性血友病因子(VWF)和血小板-内皮细胞粘附分子(PECAM-1/CD31)进行免疫荧光细胞鉴定;利用ICELLigence细胞功能分析仪测定细胞活力和生长曲线。研究从30头新生仔猪脐带(8~15cm)中分离到超过107个细胞,VWF和CD31双重检测阳性,分离得到的SUVECs超过90%,细胞生长状态良好,呈小三角形、椭圆形、梭形、多边形单层生长,界限清晰,融合后呈铺路石状,增殖能力强,符合血管内皮细胞的基本特征,可培养超过15代,为进一步研究猪胎盘血管发生及其对母猪生产性能影响提供可靠细胞模型。     

一种新型植酸酶对保育猪和肥育猪的生长性能、骨胳灰分及矿物质消化率的影响

为了比较两种植酸酶（Phyzyme和Natuphos）的效果，进行了4个试验，评价它们对生产性能、腓骨灰分、Ca和P的消化率的影响。在前3个试验中，选择832只猪进行试验，包括保育猪288只，初始体重为8．1kg；生长猪288只，初始体重为24．2kg；肥育猪256只，初始体重为57．8kg，分别进行为期28d，42d和60d的试验。     

猪脑微血管内细胞的原代分离培养与鉴定

探讨获取纯度较高的原代猪脑微血管内皮细胞的分离和培养方法。采用1月龄的三元杂交猪,通过两次酶消化、BSA和Percoll非连续梯度离心获得较纯的脑微血管段后,接种于涂布有鼠尾胶的培养瓶进行原代培养;相差显微镜观察细胞并进行纯化和传代,采用Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测法对培养的细胞进行鉴定。结果表明,培养24 h即可见细胞从贴壁的脑微血管段周围爬出,细胞呈短梭形,集落呈典型的"鹅卵石样",区域性单层生长,6~7 d内皮细胞开始融合,血管内皮细胞特异性标志物Ⅷ因子相关抗原表达阳性。说明本试验成功的培养出了纯度较高的脑微血管内皮细胞,为后续的体外血脑屏障模型的建立奠定了基础。     

德国牧羊犬成纤维细胞培养及其生长特性研究

试验旨在探讨犬耳部和腹部皮肤成纤维细胞体外培养和纯化方法,为下一步犬体细胞核移植提供基础。结果表明,在组织块培养后的4 d,耳组织周围开始有细胞出现,8~10 d呈优势生长,2周后可长满细胞瓶。腹部皮肤组织则要6~7 d方可见有细胞沿组织块周围爬出,10 d左右可以在组织块周围形成成片细胞,20 d左右可以长满整个细胞瓶。腹部皮肤成纤维细胞建系初期生长速度低于耳成纤维细胞,但传代至第4代时,两种细胞的生长曲线基本相同。     

PK-15细胞培养条件的优化

PK-15细胞，又称猪肾传代细胞，主要用于病毒的培养，尤其是猪圆环病毒对此细胞特别敏感。本试验通过研究细胞的复苏方法、培养基种类、细胞接种密度和消化液浓度与PK-15细胞生长的关系，观察培养过程中的限制性因素对PK-15细胞生长的影响。为获得状态良好的高密度的PK-15细胞培养提供依据，结果表明，用换液法复苏PK-15细胞成活率高，用0.05%胰蛋白酶：0.02% EDTA消化细胞，接种密度2×105cells／mL-2.5×105cells／mL，用DMEM-LG培养基培养，细胞生长快，形态好。     

猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离培养及传代

对猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离、培养和传代进行了系统研究。结果显示，猪的卵丘细胞生长形成单层需要5～6d；运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞单层的生长时间分别为10～11d和8～9d。猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞均可以建立并获得稳定的细胞系，这些方法的应用可为猪体细胞核移植研究提供丰富的供体细胞。     

显微操作组织贴块法培养大鼠血管内皮细胞

为了探讨显微操作组织贴块法培养大鼠动脉血管内皮细胞的效果,试验用倒置相差显微镜观察细胞形态和生长特征,用免疫细胞化学法检验内皮细胞Ⅷ因子进行血管内皮细胞鉴定。结果表明:72h后内皮细胞从组织块边缘游出,12d后细胞开始融合成片,内皮细胞阳性率为97%。说明应用显微操作组织贴块法培养能获得高纯度血管内皮细胞。     

处于酸性环境中的肉鸡胫骨生长板软骨细胞发育周期时相

本文采用离体细胞培养技术，观察了环境酸碱度对肉鸡生长板软骨细胞发育周期时相的影响。将生长板软骨分别用０．２５％胰蛋白酶和０．２％Ⅱ型胶原酶消化以分离软骨细胞，用含有２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基，３７℃培养，培养基ｐＨ值用１Ｎ盐酸调成ｐＨ７．４、７．２、７．０三组，每３天更换１次培养基。每日用倒置显微镜观察细胞形态变化及生长规律，到第９天时取培养细胞用流式细胞术做周期时相分析。同时取正常鸡及患ＴＤ病鸡生长板软骨细胞做周期时相分析。结果表明，酸性环境使生长板软骨细胞生长发育迟缓，Ｓ期与Ｇ２期细胞减少，Ｇ２期ＤＮＡ含量与Ｇ１期ＤＮＡ含量之比成不整倍性。ＴＤ病患鸡生长板软骨细胞之Ｓ期与Ｇ２期细胞数极度减少，与正常鸡生长板软骨细胞差异明显，酸性环境下生长板软骨细胞发育周期时相的变化与ＴＤ病患鸡生长板软骨细胞变化的结果相一致。     

猪囊胚体外持续发育培养体系主要影响因素的研究

本研究旨在探索猪囊胚体外持续发育的关键影响因素，为构建支持猪胚胎体外发育至三胚层分化阶段的培养体系奠定基础。采用孤雌激活后6 d的猪囊胚进行体外持续培养，通过检测分析发育至8 d的猪孤雌囊胚的形态学特征和基因表达情况，系统评价PZM-3、Advanced DMEM/F12和KnockOutTMDMEM/F12基础培养体系，以及胎牛血清（Fetal Bovine Serum,FBS）、血清替代物（Knockout Serum Replacement,KSR）、L-谷氨酰胺（L-Glutamine）和胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇（Insulin-Transferrin-Selenium-X,ITS-X）等成份对猪囊胚体外持续发育的作用，建立猪囊胚体外持续发育培养体系；通过TUNEL和免疫荧光方法检测该体系对猪囊胚的影响。结果表明：AKGI(Advanced DMEM/F12组合添加5%KSR、4 mmol/L L-Glutamine和1×ITS-X)为猪囊胚体外持续发育最适培养体系，可增加囊胚直径和囊胚细胞数（P<0.05），降低凋亡细胞比例（P<0.01），增加内细胞团（I...     

山羊支原体山羊肺炎亚种培养基的筛选及生长曲线测定

为筛选出山羊支原体山羊肺炎亚种的适宜培养基,将山羊支原体山羊肺炎亚种分离株M1601分别接种Thiaucourt肉汤、MEM-KM2和TSA 3种不同的培养基,测定其在3种不同培养基中生长滴度、生长速度,并测定了M1601在最适培养基中在不同培养阶段的生长滴度。结果表明,添加2g/L丙酮酸钠和150mL/L马血清的Thiaucourt肉汤培养基最适宜山羊支原体山羊肺炎亚种的生长,生长滴度可达109 CCU/mL,在培养6h后开始进入对数生长期,培养60h后进入稳定期,培养72h时后进入衰亡期。此试验结果为山羊支原体山羊肺炎亚种培养特性研究提供了参考数据。     

鲜绿车前草对夏季肥育猪生长性能的影响

为研究夏季高温猪肥育期饲喂鲜绿车前草对生长性能的影响,采用单因子随机区组试验设计,选取320头平均体重(59.78±1.38)kg杜长大肥育猪,随机分为4组,每组10个重复,每个重复8头猪。肥育猪基础饲粮按60~90 kg营养需求结合夏季高温实际生产情况配制。对照组饲喂猪肥育期基础饲粮,4%车前草组采取96%基础饲粮+4%车前草(按风干量计)饲喂方式,8%车前草组采取92%基础饲粮+8%车前草(按风干量计)饲喂方式,12%车前草组采取88%基础饲粮+12%车前草(按风干量计)饲喂方式。预试期7 d,正试期50 d。结果显示,在夏季高温条件下,猪肥育期增重以添加8%车前草组效果最好,与4%车前草组和12%车前草组相比分别显著和极显著增加5.96%和11.06%,极显著高于对照组12.53%;日采食量,8%车前草组显著高于其他组(P0.05),其与对照组相比显著提高8.68%(P0.05);料重比,8%车前草组最低,饲料转化率最佳,分别极显著低于对照组和12%车前草组3.47%和2.86%,比4%车前草组低1.29%,但差异不显著。试验表明,在夏季高温情况下,猪肥育阶段添加鲜绿车前草替代基础饲粮比例达到8%(风干量计)时,猪的采食量、料重比和增重性能显著或极显著改善,并达到最佳生长水平,综合效益最好。     

微生物发酵饲料对育肥猪生长性能及肉质的影响

为了研究乳酸菌发酵饲料对育肥猪生长性能、肉品质的影响及其机理,选择体重约80 kg的杜×长×大三元杂交生长育肥猪320头,随机分为对照组和试验组,每组8个重复,每个重复20头猪,对照组饲喂基础饲粮,试验组饲粮中5%的原料经乳酸菌发酵处理后再与其他原料混合;试验预试期3 d,正试期4周,在第4周结束时,每组随机抽取6头猪进行屠宰,测定屠宰性能和肉质。结果显示:与对照组相比,饲喂发酵饲料对肥育猪的干物质采食量、平均日增重和料重影响差异不显著(P0.05),猪血清中的生长激素和胰岛素样生长因子-I水平组间差异也不显著(P=0.11);试验组育肥猪的背最长肌pH_(45 min)和肉色评分显著增加(P0.05),背最长肌肉剪切力显著降低(P0.05);试验组血清谷胱甘肽还原酶活性有升高趋势(P=0.08)。结果表明:肥育猪饲料中添加5%发酵饲料原料可改善猪肉品质。     

ST贴壁细胞悬浮驯化及应用

为将ST贴壁细胞通过自主驯化,使其能在ST-S细胞无血清培养基中悬浮生长且能稳定传代,在摇瓶中实现高密度生长,并应用于猪伪狂犬病毒(PRV)悬浮培养,经ST-A低血清培养基适应培养,对一株贴壁的ST细胞进行了无血清的全悬浮驯化,并将PRV在悬浮细胞中连续盲传培养。结果显示:ST悬浮细胞能在无血清培养基中传代,培养48 h至第3代后,所能达到的最终细胞密度为3.00×10^(6 )cells/mL以上;PRV连续培养至第5代,毒价可达到109.0 TCID50/mL。结果表明,用专用培养基可使ST贴壁细胞实现悬浮驯化,并可应用于PRV悬浮培养。本研究为获得高密度ST悬浮细胞和提高PRV增殖效率奠定了技术基础。