广灵驴成纤维细胞系的建立及其相关生物学特性研究

试验旨在建立广灵驴成纤维细胞库,以期在细胞水平上对广灵驴进行保护。本研究以1月龄广灵驴耳缘皮肤组织为试验材料,采用组织块贴壁法进行成纤维细胞培养,建立了广灵驴耳缘皮肤组织成纤维细胞系,并对其相关生物学特性进行了鉴定。结果发现,试验所建立的广灵驴成纤维细胞系大多数细胞呈长梭形,部分细胞呈三角状或星型。在培养过程中,广灵驴原代成纤维细胞在贴壁4 d时开始有细胞从组织边缘游离出来,贴壁14 d后,细胞汇合率达到80%,可以进行第一次传代培养;细胞生长态势良好,生长曲线呈典型的S型曲线;细胞冻存复苏后活率有所下降,但生长状态良好。细胞分裂中期染色体数2n=62,说明成功建立了广灵驴成纤维细胞系。通过本方法建立的广灵驴成纤维细胞系为后续广灵驴的相关研究奠定了基础。     

广灵驴成纤维细胞系的建立及其相关生物学特性研究

试验旨在建立广灵驴成纤维细胞库,以期在细胞水平上对广灵驴进行保护。本研究以1月龄广灵驴耳缘皮肤组织为试验材料,采用组织块贴壁法进行成纤维细胞培养,建立了广灵驴耳缘皮肤组织成纤维细胞系,并对其相关生物学特性进行了鉴定。结果发现,试验所建立的广灵驴成纤维细胞系大多数细胞呈长梭形,部分细胞呈三角状或星型。在培养过程中,广灵驴原代成纤维细胞在贴壁4d时开始有细胞从组织边缘游离出来,贴壁14d后,细胞汇合率达到80%,可以进行第一次传代培养;细胞生长态势良好,生长曲线呈典型的S型曲线;细胞冻存复苏后活率有所下降,但生长状态良好。细胞分裂中期染色体数2n=62,说明成功建立了广灵驴成纤维细胞系。通过本方法建立的广灵驴成纤维细胞系为后续广灵驴的相关研究奠定了基础。     

腺病毒载体转染水貂耳缘成纤维细胞的研究

试验旨在探究利用携带标记基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的腺病毒载体转染入水貂耳缘成纤维细胞的可行性及感染效率。首先利用组织贴壁法分离培养水貂原代耳缘成纤维细胞并进行传代,然后包装病毒Ad-EGFP并使用TCID_(50)法进行滴度检测,设置两组不同浓度梯度的病毒液感染水貂耳缘成纤维细胞,感染复数(MOI)值分别为0/100/300/500/700/900和0/10/30/50/70/90,通过在显微镜下观察阳性细胞占总细胞数的比值估计转染效率(%)。结果表明,组织贴壁法培养水貂耳皮肤组织11 d可长满原代细胞,传代细胞在3～4 d融合度可达80%左右,包装Ad-EGFP病毒滴度为1.99×10~(11) PFU/mL,用其感染水貂成纤维细胞最佳MOI值为30,瞬时转染效率可达90%以上。综上,利用腺病毒载体转染水貂成纤维细胞具有可行性,是一种高效的转染方式,为后续水貂基因组编辑前期验证试验奠定基础。     

腺病毒载体转染水貂耳缘成纤维细胞的研究

试验旨在探究利用携带标记基因增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的腺病毒载体转染入水貂耳缘成纤维细胞的可行性及感染效率。首先利用组织贴壁法分离培养水貂原代耳缘成纤维细胞并进行传代,然后包装病毒Ad-EGFP并使用TCID₅₀法进行滴度检测,设置两组不同浓度梯度的病毒液感染水貂耳缘成纤维细胞,感染复数（MOI）值分别为0/100/300/500/700/900和0/10/30/50/70/90,通过在显微镜下观察阳性细胞占总细胞数的比值估计转染效率（%）。结果表明,组织贴壁法培养水貂耳皮肤组织11 d可长满原代细胞,传代细胞在3~4 d融合度可达80%左右,包装Ad-EGFP病毒滴度为1.99×10¹¹ PFU/mL,用其感染水貂成纤维细胞最佳MOI值为30,瞬时转染效率可达90%以上。综上,利用腺病毒载体转染水貂成纤维细胞具有可行性,是一种高效的转染方式,为后续水貂基因组编辑前期验证试验奠定基础。     

猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞培养方法的研究

为了研究猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞的分离培养体系,根据取样组织的不同,筛选出最佳的培养方法,试验以猪胎儿和耳皮肤为试验材料,用4种不同的培养分离方法,即胰酶热消化法、胰酶冷热结合消化法、胰酶室温消化法和组织块培养法,分离培养猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞,对比培养效果,筛选出最佳的培养方法。结果表明:胰酶室温消化法分离的猪胎儿成纤维细胞存活率显著高于胰酶热消化法和胰酶冷热结合消化法(P<0.05),细胞贴壁效果好,且操作简单;猪耳皮肤成纤维细胞原代培养中,胰酶热消化法和胰酶室温消化法分离的细胞数量少,组织块培养法所需的组织量少,且较胰酶冷热结合消化法操作简单。试验中培养的细胞呈典型的成纤维细胞形态,生长曲线呈"S"型,经冻存复苏后生长状态良好,说明胰酶室温消化法是猪胎儿成纤维细胞较好的培养方法,胰酶热消化法和胰酶室温消化法是猪耳皮肤成纤维细胞原代培养的理想培养方法。     

东北野猪耳皮成纤维细胞系的建立及生物学特征

研究了东北野猪耳皮组织成纤维细胞的分离、培养、纯化方法和生长特性,并对培养细胞进行了污染检测及冷冻保存和复苏培养观察.结果显示:原代培养在接种5d组织块边缘开始游离出单个细胞,到10d细胞生长旺盛;用酶消化法和差速贴壁法得到纯化的东北野猪成纤维细胞;冷冻前和复苏后的细胞活率分别为96.7％和92.7％,差异不显著(P＞0.05);分离纯化的东北野猪成纤维细胞生长曲线正常;支原体和病毒检测呈阴性;成功建立东北野猪成纤维细胞系.     

金华猪耳缘组织成纤维细胞的体外培养及生物学特性研究

试验以金华猪耳缘皮肤组织为材料,采用组织块贴壁法进行耳缘组织分离、培养、传代,并进行细胞形态观察、细胞冻存前和复苏后存活率测定、生长曲线绘制等生物学特性研究。结果表明:金华猪耳缘组织成纤维细胞呈典型的成纤维细胞形态;细胞冻存前和复苏后存活率分别为95.6%和93.8%;生长曲线呈"s"型。通过试验建立了稳定的金华猪耳缘组织成纤维细胞培养方法,说明组织块贴壁方法是获得成纤维细胞的简单有效方法,获得的细胞可在体外至少传代10代以上,能为体细胞克隆、转基因和异种器官移植等相关研究提供核细胞来源。     

天祝白牦牛5种组织成纤维细胞的制备及培养特性研究

为建立天祝白牦牛肌肉、胚胎、肾脏、耳、肝脏等5种组织成纤维细胞体外制备、分离、培养成纤维细胞的方法,采用组织块法和酶消化法制备这5种组织成纤维细胞。结果显示:用组织块法成功制备了耳组织成纤维细胞,组织块直径较小的成活率较高且生长速度较快。用消化法成功制备5种组织成纤维细胞,复苏后较冻存前细胞存活率有所下降,但均保持在90%以上,复苏后细胞的存活率:胚胎>耳>肌肉>肾脏>肝脏。5种组织成纤维细胞在离体培养条件下的生长曲线均呈"S"型,生长速度:肌肉>胚胎>肾脏>耳>肝脏。结果表明:用消化法成功地从天祝白牦牛5种组织中体外制备、分离和培养了成纤维细胞,用组织块法成功地体外制备了耳组织成纤维细胞。     

4℃保存的小鼠胎体皮肤成纤维细胞继代培养及冻存

为了探讨利用死亡动物皮肤组织获取成纤维细胞的方法,研究将小鼠胎体或皮肤分别在4℃的mPBS液中保存24~120 h,然后通过原代培养、冷冻复苏和继代培养,观察了皮肤成纤维细胞的生长增殖能力。结果表明:与新鲜皮肤(对照组)原代培养成纤维细胞达到85%以上汇合需要8 d相比,4℃保存24~120 h后的皮肤(试验组)需要的时间延长(9~21 d),但仍能贴壁生长并达到85%以上汇合,且皮肤保存法优于胎体保存法;各试验组经3~4 d继二代培养即可达到85%汇合(对照组为3 d);冷冻复苏的各试验组原代培养细胞,经继二代培养即可在3~4 d内达到85%以上汇合。说明动物死亡后,若及时采集其皮肤并在4℃的mPBS液中保存一段时间,经原代培养和继代培养,或经原代培养、冷冻复苏和继代培养,可获得具有正常继代能力的成纤维细胞。     

早胜牛胚胎和耳缘成纤维细胞分离培养与鉴定

为了建立早胜牛胚胎和耳缘成纤维细胞体外分离培养体系,采用植块法和酶消化法制备这两种组织成纤维细胞。结果显示,用植块法制备了耳缘成纤维细胞,组织块直径较小的成活率较高且生长速度较快;用酶消化法制备了胚胎和耳缘两种组织成纤维细胞,复苏后细胞的存活率:胚胎(96.8%)＞耳(94.7%)。2种组织成纤维细胞生长曲线均呈"S"型,胚胎组织(倍增时间29.7 h)生长速度快于耳组织(倍增时间31.2 h)。用免疫组织化学染色鉴定证实,分离培养的成纤维细胞中间丝被染成棕黄色,波形蛋白呈阳性反应。     

陆川猪耳部成纤维细胞的体外培养

本研究建立陆川猪耳部成纤维细胞的体外培养体系,采用组织块培养法可以获得陆川猪耳部成纤维细胞。用0.25%胰蛋白酶＋0.02%EDTA消化液消化细胞、用含有10%FBS的DMEM对细胞进行培养,能很好的支持陆川猪耳部成纤维细胞的生长。传3代后,观察到培养的细胞形态逐渐均一,为典型的成纤维细胞,绝大部分呈梭形或不规则三角形...     

绵羊耳成纤维细胞的体外培养

用组织块法和冷消化法对绵羊耳成纤维细胞在含血清培养液(RPMI—1640)中进行原代和传代培养，探讨动物体细胞培养模式，并对正常细胞形态进行观察。结果表明组织块法和冷消化法培养可获得比较均一、稳定的细胞群，细胞呈典型的成纤维形态，并成功进行传代培养，建立了绵羊耳成纤维细胞系。     

马身猪耳缘组织成纤维细胞的体外培养与鉴定

为研究马身猪体细胞的生物学特性,试验以3日龄马身猪耳缘组织为材料,采用组织块贴壁法建立马身猪耳缘组织成纤维细胞系,并对体外获得的细胞系进行生物学特性检测。结果表明,获得的马身猪耳缘组织成纤维细胞系符合成纤维细胞的基本特征,细胞贴壁生长,呈典型的梭形、星形和多边形,细胞汇合成单层的时间为10~13 d,生长曲线呈S型,中期染色体二倍体（2n=38）占主体,约占细胞总数的84%,符合细胞建系的要求;脂质体（Lipofectamine^TM 2000）转染绿色荧光蛋白质粒（pEGFP-C1）的转染效率为25%。马身猪耳缘组织成纤维细胞系的成功建立为地方猪种遗传资源的保护开辟了新的方法。     

In vitro Culture and Identification of Ear Marginal Fibroblast Cell Lines Derived from Mashen Pigs

In order to study the biological characteristics of somatic cells of Mashen pig, the ear marginal fibroblast cell lines of Mashen pig were established from 3 days old Mashen pig by direct explant method,and the biological characteristics of cell lines were detected. The results showed that the cell lines obtained from Mashen pig were in conformity with basic properties of typical fibroblasts, the shape of adherent cells were typical spindle, star and polygon, the time of grew into monolayer cells was 10 to 13 d, the growth curve was typical S shaped. The frequency of metaphase chromosome number (2n=38) was about 84% of the total number of cells, and it had met the establishment standard of fibroblast cell line. The transfection efficiency of green fluorescent protein(pEGFP-C1)transfected by lipofectamine-mediated method was 25%. The successful establishment of the fibroblast cell lines of Mashen pig had opened up a new method for the conservation of genetic resources.     

奶牛耳成纤维细胞的分离培养及培养条件的研究

本试验研究了奶牛耳成纤维细胞的体外培养,培养液、消化液、胰岛素和血清饥饿对细胞的影响。采用组织块贴壁法培养。了奶牛耳成纤维细胞,采用0．25％胰酶差别消化获得了纯化的奶牛耳成纤维细胞。用三种不同的培养液即DMEM（低糖）、DMEM（高糖）、DMEM／F12,对细胞进行培养,结果细胞群体倍增时间均在2．3-2．5d,DMEM（高糖）的培养效果稍好。用三种不同的消化液（0．25％胰蛋白酶,0.02％EDTA,0．25％胰蛋白酶＋0．02％EDTA）对传代钿跑进行消化．结果表明0．25％胰蛋白酶＋0D2％EDTA所用时间短,消化后培养细胞贴壁率高。在培养液中添加姨岛素能促进细胞的生长。对指数生长期的细胞进行血清饥饿后,细胞仍保持着较高的活力。     

莆田黑猪猪耳皮肤成纤维细胞系的建立

为获得可用于体细胞核移植中需要的供核细胞,利用组织块法培养莆田黑猪猪耳皮肤成纤维细胞,并对莆田黑猪猪耳皮肤成纤维细胞进行传代及冷冻.通过试验,获得能在体外正常传代培养的细胞系,为莆田黑猪克隆研究提供供核细胞来源.     

Establishment and characterization of a canine sebaceous epithelial cell line derived from an eyelid mass

Little is known about the pathological roles of sebaceous glands in canine skin diseases, as most examinations have been conducted with cultured human sebaceous epithelial cell lines. To our knowledge, there is no available canine sebaceous epithelial cell line. The purpose of this study was to establish a canine sebaceous epithelial cell line and characterize it. An eyelid mass in a dog was surgically resected for treatment, and it was histologically diagnosed as sebaceous epithelioma. Collected tissue was conducted for culture, and the growing epithelial-like cells were passaged. The cells showed continuous proliferation for over 6 months. After 40 passages, the cells were named CMG-1. Lipid droplets in the cytoplasm of CMG-1 cells were confirmed by Oil Red O staining. As reported in studies with human sebaceous epithelial cell lines, lipogenesis in CMG-1 cells was promoted by linoleic acid, whereas transforming growth factor-β (TGF-β) suppressed it. Additionally, real-time PCR revealed that the expression levels of chemokines and cytokines, including CC chemokine ligand (CCL)-2, CCL-20, CXCL-10, Tumor necrosis factor-α (TNF-α), Interleukin (IL)-1α, IL-1β, and IL-8, were significantly increased in CMG-1 cells following treatment with lipopolysaccharide. In conclusion, we successfully established a new canine sebaceous epithelial cell line. Our data indicated that lipogenesis and inflammatory responses were quantitatively evaluable in this cell line. CMG-1 cells could be useful for the pathological analysis of sebaceous gland diseases in dogs.     

食蟹猴-猪异种体细胞核移植的初步研究

采用食蟹猴耳部成纤维细胞作为核供体利用电融合法构建猴-猪异种核移植胚胎,研究其核重编机制并寻找适宜的培养基,初步建立食蟹猴-猪异种核移植体系。结果显示:(1)重构胚胎激活后3 h,供体核的大小基本不发生变化,但在激活后6 h大部分形成膨大的类原核。(2)食蟹猴-猪异种核移植胚胎融合率为74.2%,有70.5%的重构胚胎发生卵裂,29%的卵裂胚胎发育到桑椹胚阶段。(3)在NCSU-23+10%FCS和TCM199+10%FCS培养基中,重构胚突破4-细胞阻滞发育到8-细胞以上的比例分别为23.5%和17.0%,在NCSU-23培养基中的为19.9%,但是只有在NCSU23+10%FCS和TCM199+10%FCS培养基中重构胚胎发育到囊胚阶段(1.4%vs1.1%),尽管差异不显著。本研究首次建立了食蟹猴-猪异种体细胞克隆体系。     

人胰岛素原基因转染绵羊成纤维细胞及细胞株的建立

从动物耳皮肤组织采样 ,采用将组织块剪碎后直接贴附于培养瓶底部的方法进行原代培养 ,该方法使原代细胞出现率及可传代率均达到 10 0 %。根据上皮样细胞和成纤维样细胞贴壁紧实程度的不同 ,用 0 .0 5 %的胰蛋白酶-EDTA对其进行消化 ,可将两种不同类型的细胞进行分离和纯化。通过脂质体介导 ,以BLG -hINS(含乳球蛋白调控基因的人胰岛素原基因 )基因作为目的基因、GFP(绿色荧光蛋白 )基因作为标记基因共转染绵羊成纤维细胞 ,经G - 4 18筛选后 ,得到转染细胞。对转染的细胞分别用单细胞显微操作法和有限稀释法进行细胞克隆 ,两种方法均可得到克隆细胞。选形态正常、生长均匀的 5个细胞克隆进行PCR检测 ,结果 5个克隆均转有GFP基因 ,其中两个转有BLG -hINS基因。高代培养细胞、转染细胞和克隆细胞经核型分析后 ,染色体数目均为 2 7对 ,表明绵羊耳的成纤维细胞建立细胞株后 ,可以作为外源基因转染的有效供体细胞。     

猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离培养及传代

对猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离、培养和传代进行了系统研究。结果显示，猪的卵丘细胞生长形成单层需要5～6d；运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞单层的生长时间分别为10～11d和8～9d。猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞均可以建立并获得稳定的细胞系，这些方法的应用可为猪体细胞核移植研究提供丰富的供体细胞。