BmNPV多角体对稳定转化细胞表达荧光蛋白的包埋现象初探

为了探索家蚕核型多角体病毒(BmNPV)多角体对外源蛋白的包埋特性,构建了含有绿色荧光蛋白基因(gfp)和红色荧光蛋白基因(DsRed)的表达载体pIZT-DsRed,用该载体转染家蚕卵巢细胞系(BmN),并以吉欧霉素(zeocin)筛选得到稳定表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的BmN细胞系。进一步以野生型BmNPV感染pIZT-DsRed转化BmN细胞,发现部分多角体可以发出绿色荧光和红色荧光,Western blot检测证明多角体中含有GFP蛋白,显示BmNPV多角体可以包埋进病毒粒子以外的其他蛋白成分,表明BmNPV多角体蛋白的包埋机制中存在非特异性识别包埋的现象。     

苜蓿尺蠖核多角体病毒对家蚕核多角体病毒在蚕体内复制的干扰

昆虫杆状病毒具有相对狭窄的宿主域.虽然苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcMNPV)和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)两者DNA序列的同源性在95%左右,但AcMNPV不能在家蚕细胞中很好的复制,对家蚕幼虫不具有致病能力,但其基因组中个别基因可在被接种该病毒的家蚕幼虫体内表达.这些基因的表达可能对共感染的优势病毒BmNPV复制所需原料蛋白及转录因子形成竞争,进而抑制BmNPV在家蚕幼虫体内的复制表达.     

家蚕核型多角体病毒ODV囊膜蛋白基因的融合表达及引导外源蛋白进入多角体的研究

为了探索家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的包涵体衍生病毒(ODV)囊膜蛋白在病毒粒子包涵入多角体过程中的作用,选择2个ODV囊膜蛋白ODV-E25和ODV-E56作为研究对象,利用能够表达多角体蛋白的BmNPV Polh+Bac-to-Bac表达系统构建了融合表达E25-EGFP和E56-EGFP的重组病毒,在家蚕卵巢培养细胞系(BmN)中进行表达和定位分析。结果表明2种融合蛋白均在BmN细胞中成功表达,并于荧光显微镜下观察到绿色荧光主要分布在细胞核中。从感染的BmN细胞中收集纯化多角体,观察到多角体也能激发出绿色荧光,用Western blot方法进一步证实多角体中含有融合蛋白。这一现象表明当囊膜蛋白基因与外源基因融合表达时,外源融合蛋白能够进入多角体内部,推测这2种ODV囊膜蛋白不仅在病毒粒子包涵入多角体的过程中起信号引导作用,并能引导外源目的蛋白进入多角体。     

宿主域扩大的苜蓿尺蠖核多角体杂交型病毒

将家蚕核型多角体病毒 (BombyxmoriNuclearPolyhedrosisVirus,BmNPV)的解链酶基因DNA和苜蓿尺蠖核型多角体病毒 (AutographacalifonicaMultipleNuclearPolyhedrosisVirus,AcMNPV)的基因组DNA共转染到秋粘虫细胞系Sf 2 1,经过累代的筛选获得既能感染家蚕细胞 ,又能感染秋粘虫细胞的宿主域扩大的杂交型病毒HyNPV。     

家蚕质型多角体病毒的血清学研究——Ⅲ、中和试验和交叉反应

<正> 家蚕质型多角体病毒(CPV)的血清学研究,有关抗原的纯化方法(1978),血清制备及对流免疫电泳检测(1970)等已分别报导过。 本文着重报告CPV抗血清与家蚕质型四方形多角体病毒(CPV_t)、六角形多角体病毒(CPV_h)、病毒性软化病病毒(FV)、核型多角体病毒(NPV)等中和效果,以及对桑     

化学诱变的BmNPV对家蚕细胞和虫体感染性的初步研究

前文报道化学诱变剂对家蚕核型多角体病毒 (BmNPV)多角体形态有明显的诱变作用 ,诱变的BmNPV基因组对某些限制性内切酶的酶切电泳谱发生变化。本文研究进一步表明 :诱变BmNPV感染家蚕Bm N细胞的病变特征与对照相比没有明显不同 ,但形成不定形超大多角体的空斑时间延迟2～ 3d;诱变BmNPV感染家蚕幼虫后 ,病蚕体内各组织病变损害的感染程度 (易感性 )与对照基本相同。研究结果提示 ,诱变的BmNPV对家蚕培养细胞、虫体组织的感染性无显著变化     

体外培养蓖麻蚕蛹精巢组织细胞对核型多角体病毒的敏感性分析

为开展核型多角体病毒与宿主互作关系的研究,建立蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricini)细胞体外扩增体系,分析其对不同核型多角体病毒的敏感性差异。采用剪切分离后的蓖麻蚕蛹精巢组织材料,将分散的细胞在TNM-FH培养基中经数月换液培养后,获得了扩增的蓖麻蚕蛹精巢细胞系(BMC1)。BMC1的倍增时间约为65h。病毒的感染性实验表明:BMC1细胞对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)比较敏感,在感染的细胞中可以明显地观察到多角体;家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的多角体蛋白基因启动子可以在BMC1细胞中表达,但难以观察到多角体形成和细胞的病变,提示BMC1可以作为BmNPV的稳定化表达受体;而蓖麻蚕核型多角体病毒(PcrNPV)单独感染BMC1细胞时,无明显病变,只有在与AcNPV混合感染时可观察到PcrNPV多角体形成。BMC1细胞对不同核型多角体病毒的敏感性具有差异,不同核型多角体病毒的感染性差异的机制有待深入解析。     

利用CRISPR/Cas9系统构建的转基因家蚕对核型多角体病毒的抑制

CRISPR/Cas9介导的基因编辑已经被证明可以通过破坏病原体的基因来有效地抑制感染。西南大学的DONG Z等学者最近构建了表达CRISPR/Cas9的家蚕转基因系和以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)为目标的sgRNA,以调节家蚕早期基因的表达。通过G,代杂交获得4个转基因杂交系:Cas9(-)/sgRNA(-),Cas9(C)/sgRNA(-),Cas9(-)/sgRNA(C)和Cas9(C)/sgRNA(C)。研究证明了Cas9(C)/sgRNA(C)转基因系有效地编辑了家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组的目标位点,并在BmNPV感染后观察到大片段缺失。研究者进一步对Cas9(C)/sgRNA(C)转基因系的抗病毒分析表明,半致死剂量(LD_(50))比正常接种包涵体后的值高出1 000倍。作者分析了Cas9(C)/sgRNA(C)转基因杂交系的经济性状和脱靶效率,与正常水平无显著差异。作者的研究表明CRISPR/Cas9介导的基因编辑可以更有效地靶向家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组,并可作为一种昆虫抗病毒的方法。     

利用转基因RNA干涉提高家蚕对BmNPV的抗性初探

基于探讨利用转基因RNA干涉技术使家蚕获得对核型多角体病毒抗性的目的,将家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的DNA聚合酶基因、蛋白激酶(PK1)基因以及bro-d和orf1629基因的部分编码片段,分别以其反向重复的形式与家蚕Actin3启动子连接,构建了基于piggyBac转座子载体的转基因表达载体,通过显微注射于家蚕卵,获得了36~107个G1蛾区,得到了20~23头转基因阳性家蚕。经Southern杂交及RT-PCR分析表明,BmNPV的4个反向重复片段都已经导入家蚕基因组中,并且可以进行转录。攻毒实验结果表明,BmNPV的DNA聚合酶基因和PK1基因反向重复片段对病毒的增殖有抑制作用,从而使家蚕对BmNPV具有一定抗性;而BmNPV的bro-d和orf1629基因反向重复片段对病毒的增殖没有抑制作用。针对特定病毒的转基因RNAi技术有望使家蚕获得对该病毒的抗性。     

苏芸金杆菌与核型多角体病毒对家蚕的联合致病作用

初步研究了苏芸金杆菌(Bacillusthuringiensis,B.t)和家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinuclearpolyhedrosisvirus,BmNPV)对家蚕的联合致病作用。结果表明,BmNPV可增强B.t的毒力,增效作用显著;3.6×104、1.2×105mL-1B.t可增强BmNPV的毒力;与单独感染相比,B.t与BmNPV联合感染可缩短LT500.1～2.1d,加速家蚕死亡。     

广西不同蚕区家蚕核型多角体病毒对家蚕致病力的研究

测定从广西不同蚕区收集到的家蚕核型多角体病毒（BmNPV）对家蚕的致病力。结果：在采集广西10个蚕区的病毒样品中，表现出不同蚕区的BmNPV致病力存在一定差异，致病力最强的是从宜州采集的BmNPV，其LD50为6．91×10^5个多角体／mL，最弱的是从象州采集的BmNPV，其LD50为5．44×10^5个多角体／mL，病毒致病力呈现一定的趋势，即广西南部BmNPV的致病力普遍高于广西北部BmNPV。广西不同蚕区家蚕核型多角体病毒致病力存在差异性，防治家蚕血液型脓病需因地制宜。     

家蚕抗质型多角体病毒(BmCPV)的研究进展

由家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedosis virus,Bm CPV)感染引发的家蚕中肠型脓病对蚕业生产的危害严重,目前对该病害的防治仍局限于消毒预防。国内外学者希望从筛选的对Bm CPV有较强抵抗力的家蚕品种中寻找抗性基因和分析抗性机制,并通过转基因技术过量表达抗性基因或经RNA干扰病毒侵染增殖关键基因等策略来提高家蚕防御Bm CPV侵染的能力。本文综述家蚕抗Bm CPV研究在上述方面取得的重要进展,并对家蚕抗Bm CPV的分子机制进行分析与讨论,为该领域展开更深入的研究提供较为系统的参考信息。     

家蚕核型多角体病毒的离体增殖

<正> 关于家蚕(Bombyx mori)核型多角体病毒(BmNPV)已是研究较为深入的一种杆状病毒。家蚕细胞系统是研究病毒与宿主相互关系,病毒的特异性,病毒基因表达的理想实验材料。最令人感兴趣的是:这一材料已发展成为表达外源基因的载体宿主系统。目前国内正积极利用该材料,从事各种研究。系统地研究BmNPV在离体细胞中的复制增殖,特别是在较大规模培养细胞水平探索病毒增殖规律方面,对于进一步开发应用这一病毒资源,拓宽其应用价值是十分重要的。本文在静止培养70毫升细胞规模下,研究了BmNPV的离体增殖及其特征。     

家蚕幼虫氟中毒和质型多角体病毒感染后血淋巴中几种维生素含量的变化

运用高效液相色谱(HPLC)技术测定了家蚕五龄幼虫氟中毒和质型多角体病毒(CPV)感染后血淋巴中几种水溶性维生素含量的变化.为研究家蚕氟中毒和CPV感染的机理提供了依据.     

家蚕新品种华·康×湘·泰对家蚕核型多角体病毒的抗性鉴定

华·康×湘·泰是湖南省蚕桑科学研究所与中国农业科学院蚕业研究所合作选育成的1对具有抗家蚕核型多角体病毒(BmNPV)突出特点的家蚕新品种。为了鉴定家蚕新品种华·康×湘·泰的原原种、杂交原种与一代杂交种(包括正反交)等各种级家蚕对BmNPV的抵抗能力,以洞·庭×碧·波的各种级家蚕为对照蚕品种,利用BmNPV多角体悬浮液对各供试蚕品种的各级蚕种2龄起蚕开展经口添毒试验。结果表明,家蚕新品种华·康×湘·泰的各种级家蚕对BmNPV多角体的半致死浓度(LC_(50))值均在1×10~9个/mL以上,而对照蚕品种洞·庭×碧·波的各种级家蚕对BmNPV多角体的LC_(50)值均只在10~6～10~7个/mL水平之间,家蚕新品种华·康×湘·泰表现出了很强的抗BmNPV能力,具有明显的优势。     

家蚕核型多角体病毒蛋白质组学的研究进展

家蚕核型多角体病毒（ BmNPV）属于杆状病毒,是一类对家蚕具有高致病性的病原体。对家蚕Bm-NPV的生物学特性以及新的BmNPV蛋白的鉴定和抗BmNPV的研究发现进行综述,并指出当前BmNPV蛋白质组学的研究阶段,为BmNPV的蛋白质组学的进步发展提供参考。     

不同饲料饲养对家蚕抗核型多角体病毒病的能力以及体内3种代谢酶活性的影响

为探讨饲料与家蚕核型多角体病发生的关系及家蚕核型多角体病发生与蚕体内代谢酶活性的关系,研究比较了用桑叶、柘叶饲养的家蚕对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的抵抗性以及与抗性相关的羧酸酯酶、碱性磷酸酯酶和乙酰胆碱酯酶活性变化。结果表明:BmNPV对柘叶饲养家蚕的感染中量(ID50)和致死中量(LD50)分别为1.319×105PID/头和1.632×105PID/头,与对桑叶饲养家蚕的ID50和LD50相比,仅为1/2和1/4左右,即柘叶饲养家蚕对BmNPV的抵抗力明显降低;不论用柘叶饲养还是用桑叶饲养的家蚕感染BmNPV后,蚕体内的羧酸酯酶活性均大幅度上升,碱性磷酸酯酶与乙酰胆碱酯酶活性均显著下降,且柘叶饲养家蚕感染BmNPV后体内的碱性磷酸酯酶和乙酰胆碱酯酶活性比桑叶饲养家蚕感染BmNPV后的酶活性更低。     

家蚕核型多角体病毒gp41基因的融合表达及功能鉴定

为了研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedro virus,BmNPV)中GP41蛋白的包装功能,从BmNPV基因组中克隆了gp41基因,并将其克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1-gfp中,构建重组转移载体pFastBac1-gp41-gfp,再利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)筛选重组杆状病毒,在家蚕BmN细胞系中进行融合表达和定位分析。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,经重组杆状病毒r-gp41-gfp感染的BmN细胞新增一条大小为65 kD左右的蛋白条带,证明该融合蛋白在BmN细胞中成功表达。用激光共聚焦显微镜观察到绿色荧光充满于细胞质中,不能形成聚集体。与野生型BmNPV混合感染的实验也表明荧光出现的位置与多角体无关,说明GP41-GFP蛋白不能附着在多角体表面,融合表达可能影响了GP41蛋白与多角体的结合。     

柞蚕核型多角体病毒对柞蚕蛹的感染性试验

苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)载体表达系统的建立,使数百种外源基因得到高效的表达.该系统的产业化开发如大量培养昆虫细胞,存在成本高、技术难度大等问题.建立柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyi nuclear polyhedrosis virus ,ApNPV)载体表达系统,是利用柞蚕蛹为宿主进行外源基因表达.我国柞蚕资源丰富,柞蚕的蛹体大,以蛹滞育越冬,能够满足工厂化生产的需求.柞蚕核型多角体病毒有3个不同亚株,本实验研究了ApNPV A株系[简称ApNPV(A)]对不同发育阶段和不同品种的柞蚕蛹的感染性,为利用柞蚕蛹表达外源基因的产业化开发奠定基础.     

柞蚕核多角体病毒基因工程载体的研究——Ⅰ柞蚕核多角体病毒DNA限制性内切酶图谱

1983年,美国Smith及Summers首次用苜蓿丫纹夜蛾(Autographa ealifornice)核多角。体病毒(Nucleic polyhedrosis Virus NPV)作载体,通过昆虫细胞培养,表达人的β-干扰素取得成功。1985年日本Maeda(前田)等用家蚕核多角体病毒(BmNPV)作载体,在家蚕幼虫体内表达人的α-干扰素、近年来利用昆虫杆状病毒载体成功地生产近20种外源基因产物,包括白细胞间素-2及3,类胰岛素生长因子,乙型肝炎疫苗及艾滋病病毒gP_(41)蛋白疫苗等。最近,我国储瑞银等用BmNPV载体表达了肝炎病毒的表面抗原。