翅碱蓬脱水素基因克隆及表达载体构建

【目的】克隆翅碱蓬脱水素蛋白基因并构建其植物表达载体,为其耐盐性研究奠定基础。【方法】提取翅碱蓬总RNA,通过同源克隆和RACE方法分离获得翅碱蓬脱水素蛋白基因,并构建该基因的植物表达载体pBI121-DHN。【结果】克隆获得翅碱蓬脱水素蛋白基因的全长cDNA为847bp（GenBank序列编号：KC013239）,命名为SsDHN。序列分析结果表明,SsDHN全长cDNA中5＇-UTR为61bp,ORF为678bp,3＇-UTR为108bp且包含29bp的poly（A）尾巴,其起始密码子ATG位于62bp处,终止密码子TAA位于737bp处,编码225个氨基酸。氨基酸比对结果表明,该基因推导的氨基酸与已知其他植物DHN基因序列有35%～48%的相似性。聚类分析结果显示,翅碱蓬（SsDHN）与拟南芥和荠菜DHN亲缘关系较近,与咖啡、杜鹃花的亲缘关系较远。【结论】成功克隆了翅碱蓬脱水素基因,并构建了其表达载体,可用于翅碱蓬抗盐的遗传改良。     

小麦K2型脱水蛋白DHN14响应非生物胁迫的功能分析

【目的】研究脱水蛋白DHN14的功能及其在植物响应非生物胁迫中的潜在作用。【方法】从小麦品种"郑引1号"克隆获得脱水蛋白基因DHN14,对其进行生物信息学分析,利用实时定量PCR分析该基因在逆境胁迫下的表达水平,构建脱水蛋白DHN14基因的原核表达载体(重组菌pET28a-DHN14),经IPTG诱导表达后,在非生物胁迫下,研究该蛋白对大肠杆菌及乳酸脱氢酶(LDH)的保护作用。【结果】克隆获得脱水蛋白基因DHN14的CDS为339 bp,编码112个氨基酸,该蛋白含有2个保守的K片段,属于高亲水性无序蛋白,其分子质量为24 ku,等电点(pI)约为6.28;多序列比对分析表明,DHN14蛋白与WCOR726(Triticum aestivum)脱水蛋白的亲缘关系最近;实时定量RT-PCR结果表明,脱水蛋白基因DHN14受干旱、低温和ABA诱导表达;在20 mmol/L金属离子(Co~(2+)、Ni~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+))胁迫下,表达DHN14重组蛋白的大肠杆菌的活力明显高于对照,表明该蛋白在大肠杆菌中对金属离子胁迫具有保护作用;用1.0 mmol/L过氧化氢进行胁迫处理,重组菌DHN14存活率显著增高,说明脱水蛋白DHN14能够提高大肠杆菌对过氧化氢胁迫的耐受性;在低温和脱水胁迫下,DHN14脱水蛋白对乳酸脱氢酶的活性具有保护作用。【结论】小麦脱水蛋白DHN14能够响应非生物胁迫,提高对低温、干旱、金属离子、过氧化氢的耐受性。     

小麦脱水素基因WZY2的克隆及其序列分析

【目的】对小麦类脱水素基因进行克隆与分析,为深入研究植物脱水素的结构及其在耐旱中的可能功能提供理论依据。【方法】利用PEG胁迫处理小麦幼苗,采用RACE方法,从干旱诱导的郑引1号小麦中获得脱水素基因,采用生物信息学方法对该基因进行耐旱功能分析。【结果】获得了小麦脱水素基因新成员WZY2的全长序列,其长度为849 bp,含1个459 bp的开放阅读框,编码152个氨基酸。该氨基酸序列具有明显的脱水素类蛋白特征(K片段),由2个K片段、1个S片段和1个Y片段组成,属于YSK2型脱水素。该脱水素具有较高的亲水性,表明该蛋白在束缚自由水、稳定膜结构方面有一定作用。【结论】从水分胁迫的郑引1号小麦中克隆的脱水素基因WZY2属于YSK2型脱水素。     

苹果果实L-半乳糖脱氢酶cDNA的克隆及其RNAi载体的构建

【目的】从"皇家嘎拉"苹果幼果外果皮中克隆L-半乳糖脱氢酶(L-galactose dehydrogenase,GalDH)cDNA,进行生物信息学分析并构建其RNAi植物表达载体,为该基因功能鉴定奠定基础。【方法】应用同源序列克隆法克隆"皇家嘎拉"苹果GalDH基因,并进行生物信息学分析;利用噬菌体同源重组原理构建其RNAi植物表达载体pMDR-GalDH,并导入农杆菌EHA105。【结果】通过RT-PCR扩增得到1条约1.1 kb的条带,序列分析表明,该片段长为1 111 bp,包含一个975 bp的开放阅读框,可编码324个氨基酸残基,包含有醛酮还原酶的保守结构域和3个跨膜螺旋结构,其理论上的等电点pI为5.44,蛋白分子质量为34.99 ku;聚类分析显示,苹果GalDH核苷酸与已知其他植物GalDH核苷酸的相似性均在95%以上,判断其为苹果GalDH基因cDNA全长,命名为MdGal DH(GenBank登录号为:GQ131419)。另外,通过RT-PCR获得GalDH基因保守区段,成功构建了其RNAi植物表达载体pMDR-GalDH。【结论】从"皇家嘎拉"苹果中克隆了GalDHcDNA的编码区全长,并构建了该基因的RNAi植物表达载体。     

玉木耳漆酶基因Aclac的克隆及原核表达

【目的】对玉木耳漆酶基因Aclac进行克隆及原核表达分析,为深入研究漆酶基因在玉木耳子实体发育中的生物学功能提供理论依据。【方法】克隆Aclac基因的cDNA和DNA全长序列,对其进行生物信息学分析,并将目的基因连接至pET-28a质粒上以构建原核表达载体pET28a-Aclac,将其转化大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。【结果】克隆获得的Aclac基因cDNA序列长度为1734 bp,编码577个氨基酸残基;Aclac基因DNA序列长度为2521 bp,含14个内含子。AcLAC蛋白理论分子量为64.75 kD,理论等电点为5.70,不稳定指数为34.01,无跨膜区域,存在1个信号肽,在4个铜离子结合区高度保守,且含有Cupredoxin超家族蛋白保守功能域。AcLAC蛋白与真菌的漆酶蛋白聚为一支,其中,AcLAC蛋白与木耳属真菌的漆酶蛋白亲缘关系最近。AcLAC融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）表达宿主中成功表达,分子量为67 kD。【结论】克隆获得的Aclac基因属于Cupredoxin超家族基因,可在原核表达系统中异源表达,推测其与其他真菌漆酶基因在生物学功能上具有一致性,丰富了真菌漆酶资源。     

甘蔗B家族蔗糖磷酸合成酶基因SotSPSB的克隆及原核表达

【目的】克隆甘蔗B家族s0心PsB基因并进行原核表达,为进一步研究甘蔗SPS酶学特性及SPS活性调控机制奠定基础。【方法】在进化分析的基础上,通过同源克隆获得甘蔗SofSPSB基因部分序列,再结合RACE技术获得全长cDNA序列。扩增SofSPSB基因ORF并连到原核表达载体pETBlue－2上导入大肠杆菌BL21（DE3）中表达。【结果】通过比对B家族中进化关系很近的玉米（Zeamays）ZmSPS1和水稻（Oryzasativa）OsSPS1基因序列,并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗B家族SPS基因（SolSPSB）2330bp序列。结合5’－RACE和3’－RACE技术获得3481 bp SofSPSB基因全长cDNA序列,该序列包含一个3225bp的开放阅读框（0I江）;起始密码子（ATG）位于转录起始位点后56bp处,终止密码子（TGA）后有一段201bp的非编码序列,并带有真核生物典型的polyA尾巴;编码1074个氨基酸,SofSPSB与Zm—SPS1、OsSPS1的核苷酸序列同源性分别为94．7％和81．3％,氨基酸序列同源性分别为96．0％和83．9％;其理论分子量Mw=118．96kDa,等电点pI=6．30。经原核表达后纯化获得带6xHis标签的融合蛋白。【结论】克隆获得甘蔗B家族Sol-SPSB基因全长cDNA序列,成功构建了SoPSPSB基因原核表达载体,使其在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。     

苎麻BnbZIP1转录因子基因的克隆与表达特征分析

【目的】克隆苎麻转录因子基因BnbZIP1,分析其序列及表达特征,同时进行原核表达以及亚细胞定位分析。【方法】根据苎麻转录组测序中的Unigene48047片段序列,采用RT-PCR结合RACE技术克隆该基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用Real-time PCR分析该基因在不同组织和不同胁迫条件下表达特征;构建原核表达载体,进行原核表达;构建含EGFP的融合表达载体,观察其亚细胞定位情况。【结果】苎麻BnbZIP1的cDNA全长为2 071 bp,开放读码框为1 407 bp,编码468个氨基酸,推导该多肽的等电点和分子量为7.12和51.57 kD,与毛果杨（XP_002307972）的bZIP基因氨基酸序列的相似性最高,达到93%;IPTG诱导产生的重组蛋白相对分子量约为52 kD,与理论值一致;亚细胞定位分析表明其定位在细胞核中;荧光定量PCR分析表明,该基因在苎麻根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达,其中,在雄花中表达最高,在根中表达最低,且该基因受ABA、干旱和高盐诱导上调表达。【结论】获得了BnbZIP1的全长cDNA序列,其编码蛋白具有植物bZIP转录因子典型的结构域,且该基因响应ABA、干旱和高盐逆境胁迫,预示该基因可能在植物抗逆反应中发挥着重要的调控作用。     

蝴蝶兰MADS-Box基因克隆及植物表达载体的构建

【目的】克隆蝴蝶兰MADS-Box基因并构建其正义和反义植物表达载体,为其功能研究奠定基础。【方法】以蝴蝶兰杂交品种(Phalaenopsis hybrid cv.Jiuhbao Red Rose)为试验材料,采用RT-PCR和RACE技术从花葶中克隆MADS-Box基因,并构建正义和反义植物表达载体。【结果】克隆获得一个蝴蝶兰MADS-Box基因,命名为DtpsMADS1(GeneBank登录号JQ065097)。该基因cDNA全长960 bp,包含37 bp的5'非编码区、185 bp的3'非编码区和一个738 bp的编码区;该基因编码245个氨基酸。生物信息学分析结果表明,该基因编码的蛋白质为碱性亲水性蛋白,具有62.45%的α-螺旋,8.16%的延伸链和29.39%的不规则折叠。序列比对和系统进化分析结果表明,DtpsMADS1与蝴蝶兰ORAP13的亲缘关系最近,同源性达99.0%,与石斛和蕙兰的同源性分别为83.0%和82.0%,属于MADS家族A类亚家族。将DtpsMADS1基因连接到植物表达载体pBI121上,构建获得正、反义植物表达载体pBI121-DtpsMADS1-S和pBI121-DtpsMADS1-A。【结论】成功克隆的蝴蝶兰DtpsMADS1基因属于MADS家族A类亚家族,具有明显的保守性和特异性,可为蝴蝶兰DtpsMADS1基因功能的鉴定及蝴蝶兰的遗传改良奠定基础。     

板栗过氧化氢酶基因CmCAT的克隆与原核表达

【目的】旨在克隆板栗CmCAT基因全长cDNA序列,分析其编码蛋白相关信息并进行原核表达研究。【方法】采用RT-PCR技术从板栗品种"石丰"中克隆获得CmCAT基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定的氨基酸序列进行分析。构建原核表达载体pET28a-CmCAT,经PCR和酶切鉴定后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。【结果】板栗CmCAT基因开放阅读框(ORF)为1 479 bp,共编码492个氨基酸,推测蛋白分子质量为56.883 kDa,理论等电点pI为5.83,GenBank登录号为KY312851。其核苷酸序列与核桃(Juglans regia)CAT基因序列相似性最高,为85%。遗传进化分析表明,板栗CmCAT与核桃的亲缘关系最近。SDS-PAGE电泳分析表明,在30℃条件下,0.2 mmol/L IPTG诱导6 h表达量最佳,诱导的目的蛋白分子量约为60 kDa,其主要以包涵体的形式存在。【结论】成功克隆了板栗CmCAT基因,并对其编码蛋白的理化性质进行了预测分析,在大肠杆菌中获得了大量的表达,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。     

玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的克隆与过表达载体的构建

【研究目的】克隆玉米分支酶基因SBEⅡb并构建该基因的过表达载体pCASBEⅡb。【研究方法】从糯玉米（Waxycorn）新鲜胚乳中提取总RNA,利用RT-PCR方法克隆玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的全长cDNA。【结果】克隆得到了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的全长cDNA,用BLAST软件作同源序列比对的结果显示,该片段的核苷酸序列与GenBank上报道的序列具有99%的同源性,全长2719bp,编码799个氨基酸。【结论】将该基因连接到携带GUS报告基因的植物表达载体pCAMBIA1303中,并通过了GUS活性检测,说明已成功构建了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的过表达载体pCASBEⅡb。     

花生光敏色素AhphyA和AhphyB基因的克隆及原核表达研究

【目的】克隆了花生(Arachis hypogaea L.)的2个光敏色素基因,并对其进行生物信息学分析,构建这2个基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达蛋白,为进一步纯化蛋白制备抗体以及研究这2个基因在花生发育中的作用奠定基础。【方法】首先,根据花生转录组中编码光敏色素A基因与光敏色素B基因的部分序列,以花生叶片中提取的总RNA为模板,通过RT-PCR与RACE技术对这2个基因的全长ORF序列进行克隆;然后,使用MEGA软件分析花生光敏色素与其他物种中光敏色素的亲缘关系;构建AhphyA、AhphyB的原核表达载体,转化大肠杆菌BL21并诱导蛋白表达。【结果】2个基因全长ORF分别为3378bp和3 456bp,分别编码1 125和1 151个氨基酸的蛋白;其氨基酸序列与大豆的光敏色素A蛋白和光敏色素B蛋白的相似性分别为88%和90%;经SDS-PAGE检测,在大肠杆菌中2个基因均能受IPTG诱导表达产生蛋白。【结论】利用RT-PCR与RACE技术从花生中克隆得到了2个光敏色素基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了高效表达。     

大鲵胸腺素β-4全长基因的分离与表达研究

【目的】对大鲵胸腺素β-4基因进行生物信息学分析和原核表达载体构建,为大鲵胸腺素β-4蛋白生理活性的深入研究奠定基础。【方法】从大鲵皮肤cDNA文库中分离获得了大鲵胸腺素β-4基因全长序列,采用多种生物软件对其进行生物信息学分析,用定量PCR研究胸腺素β-4基因在不同组织的表达情况,并以pET32a为载体构建该基因原核表达载体。【结果】胸腺素β-4基因全长共699bp,其中开放阅读框135bp,5′-UTR 87bp,3′-UTR为474bp,该基因编码45个氨基酸,表达蛋白的理论分子质量为5 141.59u,等电点为5.34;结构分析发现,大鲵胸腺素β-4蛋白氨基酸序列的第7～43位处有"THY"特征模体,没有跨膜螺旋区、细胞膜外在跨膜结构域。氨基酸序列进化关系表明,大鲵与人、大鼠、牛、猩猩、鸡、倭蛙等动物亲缘关系较近,氨基酸同源性高于85%;与猪和爪蟾的亲缘关系次之,氨基酸同源性均为83%;而与虹鳟、大菱鲆、斑马鱼等鱼类的亲缘关系较远,氨基酸同源性低于80%。荧光定量PCR检测结果表明,胸腺素β-4基因在大鲵肺中的相对表达量最高。SDS-PAGE电泳结果表明,构建的大鲵胸腺素β-4原核表达重组菌株pET32a-Tβ4,在37℃条件下,用终浓度1.0mmol/mL IPTG诱导4h后,大鲵胸腺素β-4基因获得了较高的表达。【结论】分离获得了大鲵胸腺素β-4基因全长cDNA序列,该基因氨基酸序列与人等高等动物的同源性最高,能在大鲵肺中及大肠杆菌中获得高效表达。     

克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4基因并稳定转染胎儿成纤维细胞 #br#

 【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosin beta 4,Tβ4) 基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM 2 000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】 克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142 bp,其中包含135 bp的完整ORF,编码44个氨基酸残基,氨基酸序列与已报道的牛胸腺素β4(XM002706880.1)同源性为100%。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KT中,Tβ4基因正确连接在皮肤特异性启动子KAP6-1下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和Tβ4基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白。【结论】克隆得到内蒙古白绒山羊Tβ4基因并构建成功其真核表达载体,可稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过核移植方法获得转胸腺素β4基因绒山羊提供了条件。     

克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4基因并稳定转染胎儿成纤维细胞

【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosinbeta4,Tβ4)基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142bp,其中包含135bp的完整ORF,编码44个氨基酸残基,氨基酸序列与已报道的牛胸腺素β4(NM_001002885)同源性为100%。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KT中,Tβ4基因正确连接在皮肤特异性启动子KAP6-1下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和Tβ4基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白。【结论】克隆得到内蒙古白绒山羊Tβ4基因并构建成功其真核表达载体,可稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过核移植方法获得转胸腺素β4基因绒山羊提供了条件。     

花椰菜ERF114基因的克隆及Gateway技术构建表达载体

【目的】为进一步探究花椰菜ERF114基因功能,从花椰菜中克隆ERF114基因并构建植物表达载体。【方法】利用RTPCR技术从花椰菜中分离ERF114基因;通过生物信息学软件对ERF114蛋白特性进行预测和分析;采用Gateway技术构建ERF114基因的植物表达载体。【结果】克隆获得了花椰菜ERF114基因,其全长为681 bp,编码226个氨基酸,具有1个AP2结构域。生物信息学分析显示,该蛋白质为亲水性蛋白,有1个跨膜区域,二级结构以α-螺旋,β-折叠和无规则卷曲结构为主。进化树分析表明,花椰菜ERF114与油菜的亲缘关系最近。同时成功构建了植物表达载体。【结论】成功克隆了花椰菜ERF114基因,对其进行生物信息学分析,并构建其表达载体,为探究花椰菜ERF114基因功能及分子调控机制奠定了基础。     

草莓八氢番茄红素合成酶基因的克隆及其表达特性

 【目的】分离和克隆草莓果实八氢番茄红素合成酶基因psy,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆草莓类胡萝卜素合成途径中关键基因psy,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用半定量PCR法研究psy基因在不同组织中的表达。【结果】分离到psy基因,GenBank登录号为FJ784889。该cDNA全长1 458 bp,具有1个1 194 bp的完整开放阅读框(ORF),编码398个氨基酸。序列分析表明,psy编码的氨基酸序列与其它植物的PSY蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,草莓PSY与胡萝卜和玉米的PSY蛋白亲缘关系比较近。原核表达结果表明psy基因在大肠杆菌中获得高效表达。利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析发现,psy基因在草莓的花、叶片和果实中均有表达。表达量为花＞红果＞粉红果＞白果＞青果＞老叶＞新叶。【结论】从草莓中克隆到类胡萝卜素生物合成的关键酶基因psy,该基因可能参与调控类胡萝卜素的合成。     

龙眼咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（DLCCoAOMT）基因的克隆和表达分析

【目的】克隆龙眼咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(DLCCoAOMT)基因,分析其序列特征和在低温胁迫下不同组织中的表达情况并进行原核表达研究。【方法】采用RT-PCR 和RACE 技术从龙眼叶片中克隆DLCCoAOMT基因,用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,利用荧光定量PCR 研究DLCCoAOMT 基因在不同组织中的表达。【结果】克隆得到DLCCoAOMT 基因,GenBank 登录号为JN093023。该cDNA 全长993 bp,具有1 个744 bp 的完整开放阅读框（ORF）,编码247 个氨基酸。序列分析表明,DLCCoAOMT 编码的氨基酸序列与其它植物的 CCoAOMT 蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,龙眼 DLCCoAOMT 与桦木属的CCoAOMT 蛋白亲缘关系较近。利用荧光定量技术进行组织表达模式分析发现,DLCCoAOMT 基因在根、茎、叶中均有表达。总体上表达量在根和茎中较多,叶中较少,随着低温胁迫时间延长,DLCCoAOMT 基因在各组织的表达量也发生变化。原核表达结果表明,DLCCoAOMT 基因在大肠杆菌中获得表达。【结论】从龙眼中克隆到咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因,该基因可能参与调控低温胁迫。     

斜纹夜蛾普通气味结合蛋白ⅠcDNA的克隆及在原核细胞中的表达

 【目的】克隆、序列分析和原核表达编码斜纹夜蛾（Spodoptera litura）GOBPⅠ（SlGOBPⅠ）的cDNA。【方法】采用同源克隆结合RACE的方法克隆SlGOBPⅠ基因的cDNA序列,并在 pET-32a/BL21（DE3）系统中进行原核表达。【结果】从斜纹夜蛾触角中克隆了GOBPⅠ的cDNA序列（GenBank登录号为EU086372）,序列分析表明,SlGOBPⅠ开放阅读框序列为495 bp,编码164个氨基酸,分子量为19.3 kD,等电点为5.54。SlGOBPⅠ具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,即氨基酸序列中具有 6个半胱氨酸残基,呈酸性。SlGOBPⅠ氨基酸序列与鳞翅目昆虫的气味结合蛋白氨基酸序列具有较高的相似性,表明SlGOBPⅠ属于GOBP家族。将SlGOBPⅠ编码序列,克隆到表达载体pET-32 a上,构建原核表达载体pET-SlGOBPⅠ,在表达宿主菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导成功表达了相对分子质量为32.0 kD的可溶性融合蛋白,利用Ni2+-NTA亲和柱一步纯化了SlGOBPⅠ融合蛋白,以此融合蛋白免疫新西兰大白兔制备了SlGOBPⅠ的抗血清,ELISA滴度为1﹕5 000,Western印迹检测结果显示,SlGOBPⅠ抗血清与表达的融合蛋白质呈阳性反应,表明所表达的融合蛋白保持原有的免疫原性。【结论】克隆、分析和表达了编码斜纹夜蛾气味结合蛋白GOBPⅠcDNA 序列,为今后深入研究斜纹夜蛾GOBPⅠ基因的结构和功能奠定了基础。     

鸭肝脏基础型脂肪酸结合蛋白Lb-FABP基因的克隆、组织表达谱和序列特征分析

 【目的】克隆仙湖肉鸭肝脏基础型脂肪酸结合蛋白Lb-FABP基因的cDNA,并进行组织表达谱和蛋白结构分析,为肉鸭的分子育种提供基础资料。【方法】通过比较基因组学,采用RT-PCR和RACE技术,获得了Lb-FABP基因的cDNA序列全长序列;并采用半定量PCR分析了Lb-FABP基因在16个组织的表达;通过生物信息学方法预测了Lb-FABP基因的蛋白结构。【结果】仙湖肉鸭Lb-FABP基因的cDNA全长548bp,包括97bp长的5′非翻译区(5′UTR)和70 bp长的 3′非翻译区(3′UTR)以及381 bp开放阅读框(ORF,含终止密码子)。Lb-FABP基因组序列包括4个外显子和3个内含子,3个内含子分别长为991 bp、292 bp和713 bp。在所检测的16个组织中Lb-FABP基因mRNA均有表达,尤其在肝脏组织中的表达明显高于其它组织。Lb-FABP理化性质表明该蛋白为一偏碱性蛋白,无明显的信号肽和跨膜区域;蛋白二级结构主要由β折叠和少量的α螺旋、loop环构成,预测发现在第5—22氨基酸残基处存在一个细胞溶质脂肪酸结合蛋白活性功能区;其三维结构由反向平行的10条β链及2条短α链组成的有一开口的“蛋白桶”构成。Lb-FABP基因氨基酸序列与鸡的该基因氨基酸的相似性为97.0%,与其它非哺乳脊椎动物的同源性达80%以上,比对尚未发现哺乳动物存在该基因。【结论】成功克隆肉鸭Lb-FABP基因cDNA序列以及基因组序列,该基因在肝脏组织的表达高于其它组织,并获知在5—22氨基酸处存在其蛋白活性功能区。     

家蚕Bmugt3基因cDNA序列的克隆、表达与序列分析

【目的】克隆分析家蚕Bmugt 3基因cDNA序列,并对其在家蚕不同组织中的表达进行检测。【方法】以家蚕ak1和873为供试材料,采用生物信息学方法和RT-PCR技术,对家蚕Bmugt3基因cDNA序列进行克隆和组织表达谱研究,并通过XbaⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒,将Bmugt 3亚克隆至具有2个反向T7启动子,用于体外诱导合成双链RNA(dsRNA)的L4440载体。【结果】克隆得到了家蚕Bmugt 3基因1675bp的cDNA序列,编码462个氨基酸,编码蛋白的分子质量为52.3ku,等电点6.5;多序列比对显示,Bmugt 3基因缺失了C末端的跨膜结构域;聚类分析结果显示,其与家蚕phenol-UGT基因聚合在同一分支上。Bmugt 3基因主要在家蚕丝腺中表达。【结论】Bmugt 3基因是组织特异性表达基因,可能在家蚕类黄酮素的代谢中起作用。