火龙果HuABAR的克隆、生物信息学分析及亚细胞定位

在前期利用SSH筛选到抗旱相关基因HuABAR的Unigene序列的基础上,进行了HuABAR的全长cDNA克隆、生物信息学分析及亚细胞定位。结果表明:HuABAR基因cDNA全长为1 239bp,5′-UTR为264bp,3′-UTR为414bp,完整开放阅读框(ORF)共561bp,编码187个氨基酸;生物信息学分析显示,HuABAR基因编码蛋白具有典型的SRPBCC结构域,并与PYR1/PYLs(pyrabactin resistance 1/PYR1like)家族具有较高的相似性;HuABAR在干旱、高温(42℃)和低温(4℃)等逆境胁迫下显著上调表达,并在干旱胁迫5d、高温3d时表达量最高,低温处理5d内,表达量持续上升;通过PEG介导法瞬时转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析,发现该基因定位于细胞质,与已报道的其他PYR1/PYLs家族基因一致。因此,HuABAR基因可能在火龙果干旱胁迫应答中发挥重要作用。     

虹鳟冷休克蛋白Y-box基因的cDNA全长克隆与序列分析

采用逆转录PCR(RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术从虹鳟(Oncorhynchus mykiss)脑组织中克隆了Y-box基因cDNA全长序列(GenBank登录号:FJ492962)。该基因cDNA全长为1 452 bp,其中5'端非翻译区(5'UTR)长137 bp,3'端非翻译区(3'UTR)长409 bp,开放阅读框(ORF)长906 bp,编码301个氨基酸。蛋白质相对分子质量为33.1×103。PSORTⅡ亚细胞定位显示该蛋白位于细胞核,富含两类核定位信号,分别为pat4与pat7。虹鳟的Y-box蛋白序列与大西洋鲑、斑马鱼和大菱鲆的同源性分别为99%、80%和79%。同源建模显示虹鳟与人的Y-box蛋白具有十分相似的三级结构。系统发育树显示不同物种的Y-box蛋白分为3个亚群:亚群Ⅰ为鱼类;亚群Ⅱ为两栖类、鸟类及哺乳类;亚群Ⅲ为节肢动物类,这与物种间的进化历程基本一致。     

海岛棉转录因子基因GbTCP44的克隆及特征分析

为阐明TCP基因在棉花纤维发育中的功能,以海岛棉'新海21号'为材料,运用RT-PCR技术克隆得到海岛棉GbTCP44基因的cDNA序列,并借助生物信息学、亚细胞定位、实时荧光定量PCR技术分析预测其结构和功能.结果表明:1) GbTCP44基因的编码区序列全长为1 035 bp,共编码344个氨基酸,预测分子式为C1...     

虹鳟冷休克蛋白Y-box基因的cDNA全长克隆与序列分析

采用逆转录PCR(RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术从虹鳟(Oncorhynchus mykiss)脑组织中克隆了Y-box基因cDNA全长序列(GenBank登录号:FJ492962)。该基因cDNA全长为1 452 bp,其中5'端非翻译区(5'UTR)长137 bp,3'端非翻译区(3'UTR)长409 bp,开放阅读框(ORF)长906 bp,编码301个氨基酸。蛋白质相对分子质量为33.1×103。PSORTⅡ亚细胞定位显示该蛋白位于细胞核,富含两类核定位信号,分别为pat4与pat7。虹鳟的Y-box蛋白序列与大西洋鲑、斑马鱼和大菱鲆的同源性分别为99%、80%和79%。同源建模显示虹鳟与人的Y-box蛋白具有十分相似的三级结构。系统发育树显示不同物种的Y-box蛋白分为3个亚群:亚群Ⅰ为鱼类;亚群Ⅱ为两栖类、鸟类及哺乳类;亚群Ⅲ为节肢动物类,这与物种间的进化历程基本一致。     

玉米Zma006292基因克隆与序列分析

【目的】玉米是世界主要农作物之一,生物及非生物胁迫对玉米产量影响严重。植物复杂的逆境胁迫信号转导途径中,NAC转录因子通过调控诸多基因的表达发挥其抗逆功能。本研究从玉米自交系B73中分离得到ATAF亚家族NAC基因Zma006292,并对其进行序列分析。【方法】RT-PCR技术克隆基因全长cDNA,通过序列比对和构建系统进化树分析Zma006292氨基酸序列特征和进化关系。通过生物信息学预测氨基酸组成特征、保守结构域、亚细胞定位和蛋白三级结构。【结果】克隆得到Zma006292全长cDNA 609bp。     

甘蓝NAC转录因子BoNAC2的克隆及表达分析

为探索甘蓝(Brassica oleracea L.)在各种非生物逆境条件下NAC转录因子的表达,以"中甘11号"为材料,克隆获得甘蓝NAC转录因子BoNAC2基因的cDNA全长序列。序列分析表明,该cDNA片段全长为1 002bp,编码333个氨基酸,具有典型的NAC类蛋白的结构特征。进化树分析表明,该蛋白属于SENU5亚族,并与甘蓝型油菜(Brassica napus L.)BnNAC亲缘关系最近。亚细胞定位显示,BoNAC2蛋白分布于细胞核中。qRT-PCR分析表明,BoNAC2基因受PEG和NaCl诱导表达。     

牡丹PsDHN1基因克隆及转基因拟南芥的耐涝性分析

在前期研究的基础上,从牡丹叶片中获得了脱水素基因PsDHN1的中间序列,利用cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends, RACE)技术克隆获得了该基因的全长序列。通过生物信息学分析及转化拟南芥进行功能验证,探讨牡丹脱水素基因PsDHN1的特性及其响应涝害胁迫的功能。生物信息学分析结果表明:PsDHN1基因全长cDNA为864 bp,包括471 bp的开放阅读框,104 bp的5′非编码区和289 bp的3′非编码区。PsDHN1蛋白含有156个氨基酸,其分子质量为16.39 kDa,理论等电点为8.87,亲水性指数为-1.274,为亲水性蛋白,不稳定性指数为44.05,为不稳定性蛋白。PsDHN1蛋白包含3个α-螺旋和1个β-折叠,以及2个Y片段、1个S片段和2个K片段,属于典型的Y_2SK_2型脱水素。牡丹的PsDHN1蛋白与其他9个物种有一定的同源性,其中与苦瓜、麻风树和胡桃DHN1蛋白的相似度分别达到了58%、54%和53%。亚细胞定位结果表明,PsDHN1主要定位于细胞核和细胞膜上。耐涝性试验结果显示:从表型上看,转PsDHN1基因的拟南芥植株耐涝能力及恢复生长的情况均优于野生型植株;涝害相关的酶如蔗糖合成酶、丙酮酸脱羧酶、α-淀粉酶活性及可溶性蛋白含量均为转基因拟南芥总体高于野生型植株。该研究结果为牡丹耐涝基因的挖掘和进一步研究牡丹耐涝的分子机制提供了理论依据。     

甜荞FaeseuFUL基因的克隆和序列结构分析

利用基因同源克隆技术结合3' RACE和5' RACE基因克隆技术,从甜荞(Fagopyrum esculentum)花芽中克隆到1个与花序分生组织发育和果实发育等过程中起到重要作用的euFUL基因的同源基因FaeseuFUL(GenBank登录号为KM386626).序列分析表明,其cDNA全长1060bp,包括38bp的5'-UTR、1个编码231个氨基酸的696bp的完整开放阅读框以及326bp的3’-UTR.蛋白质分子序列比对和分子系统进化分析表明,FaeseuFUL基因是MIKC-type MADS-box基因,属于AP1/ SQUA亚家族的euFUL进化系,与拟南芥的AGL8/FUL的同源基因相似性达到81.4％,其编码区的C末端含有euFUL进化系的FUL基序和paleoAP1基序.     

中国野葡萄锌指蛋白基因的克隆及生物信息学分析

【目的】在受白粉病菌侵染的中国野葡萄叶片中克隆锌指蛋白基因全长,研究葡萄抗白粉病的分子机制。【方法】在前期采用mRNA差异显示技术获得的中国野葡萄华东葡萄株系白河35-1抗白粉病基因表达差异cDNA片段T11GG/B0324-292的基础上,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了该cDNA全长序列,并结合生物信息学方法对所获取的序列进行分析。【结果】该cDNA全长2663bp(GenBank登录号HM008621),具有完整的开放阅读框,基因全长2223bp,编码1个由740个氨基酸组成的锌指蛋白(Zinc finger protein),5′和3′非翻译区长度分别为395和44bp。多重比较分析表明,该基因推导的氨基酸序列与拟南芥、蒺藜苜蓿、水稻的C3H亚型CCCH型锌指蛋白的同源性分别为61%,70%和60%。【结论】利用RACE技术获得了锌指蛋白基因全长,为进一步研究锌指蛋白基因与葡萄抗白粉病的关系奠定了基础。     

鸭梨过氧化物酶基因全长克隆与序列分析

采用RT-PCR和RACE方法,从鸭梨(Pyrus bretschneideri Rehd)果实中获得过氧化物酶(Peroxidase)基因POD的cDNA全长,命名为PbPOD,并将该基因在GenBank上登录,登录号为JQ325052。基因序列分析表明,该基因的cDNA全长为1 487 bp,包含72 bp的5'非翻译区、404 bp的3'非翻译区和长度为1 011 bp且编码336个氨基酸的编码区(CDS)。氨基酸序列分析表明,该基因编码的蛋白具有POD家族保守存在的所有功能活性位点,且与甜瓜、拟南芥、烟草等植物POD相似性达92%以上。     

红麻Ms5基因的克隆及多转录本分析

为研究Ms5基因在红麻(Hibiscus canabius L.)花药中的转录特征,以L23A不育系为试材,基于已知的红麻Ms5基因5′端cDNA序列,采用3′RACE和RT-PCR技术对该基因全长cDNA序列进行克隆。序列比对分析结果表明,红麻花药组织中同时存在Ms5基因2种不同的转录本,其长度分别为972和1 105bp,依次命名为HcMs5-α和HcMs5-β。这2种转录本均包含了完整且一致的编码序列,其编码序列(CDS)全长为858bp,预测编码的蛋白质含有285个氨基酸残基,分子质量为32.4ku,理论等电点为7.62;两者5′端前972bp序列完全一致,但3′端的非编码区(UTR)长度有所不同,HcMs5-β在第972bp以后比HcMs5-α多出133bp的序列,具有选择性转录终止的特征。这种转录终止信号的可选择性可能与该基因转录后水平的调控有关。     

板栗蛋白磷酸酶PP2A催化亚基基因的克隆与同源性分析

利用RACE技术从板栗雄花序中扩增得到1 347 bp的板栗蛋白磷酸酶2A的催化亚基(protein phospha-tase PP2A catalytic subunit,PP2Ac)cDNA片段。序列分析表明该片段包含基因的5′非翻译区4 bp,3′非翻译区407 bp,开放阅读框为936 bp,编码311个氨基酸,预计分子量为35.6 KD,等电点为5.94。基因序列数据库(GenBanK)登录为FJ840479(基因)和ACO57639(蛋白)。与葡萄、拟南芥、水稻等其他物种PP2Ac氨基酸序列相似性约为92%。     

柑橘脉突病毒基因组全长cDNA克隆及其侵染性鉴定

【目的】构建柑橘脉突病毒（citrus vein enation virus,CVEV）侵染性克隆,为从分子水平解析其致病机理打下基础。【方法】利用SMARTer^? RACE(rapid amplification of cDNA ends)试剂盒对CVEV的5′序列进行RACE,并依据序列分析结果及CVEV分离株VE-1保守序列,设计CVEV基因组全长cDNA扩增引物。以CVEV毒源植株的总RNA为模板,通过EV25-F/EV5983-R引物扩增CVEV基因组全长cDNA。利用In-Fusion重组连接线性化pXT1和CVEV全长cDNA。通过菌液PCR及测序分析鉴定CVEV基因组全长cDNA克隆。通过农杆菌介导的真空浸润接种摩洛哥酸橙（Citrus aurantium）、邓肯葡萄柚（C. paradisi）、尤力克柠檬（C.limon）、枳柚（C. paradisi×Poncirus trifoliata)、Rusk枳橙（P. trifoliata×C. sinensis）、枣阳小叶枳(P. trifoliata),进一步通过RT-PCR检测、症状观察鉴定所构建CVEV全长cDNA克隆的侵染性。【结果】建立了CVEV的基因组全长RT-PCR扩增体系,获得基于双元载体pXT1的CVEV基因组全长cDNA克隆10个。随机选取的6个全长cDNA克隆CVEV1901—CVEV1906的序列一致性为99.35%。其中,CVEV1901基因组全长5 983 nt,由5个开放阅读框、5′端207 nt和3′端198 nt的两个非翻译区、以及ORF2和ORF3之间122 nt的基因间隔区组成。序列分析结果显示,CVEV1901与浙江分离株XZG及四川SM分离株的序列一致性分别为99.98%和99.11%;与西班牙VE-1分离株、美国加州VE701分离株和日本IBK分离株基因组序列一致性在96.89%—98.61%;与同属中豌豆耳突花叶病毒（pea enation mosaic virus）和紫花苜蓿耳突病毒（alfalfa enamovirus）的序列一致性约90%。通过农杆菌介导的真空浸润将CVEV1901接种至6个不同的柑橘品种,接种后120 d的RT-PCR检测结果表明摩洛哥酸橙、邓肯葡萄柚、尤力克柠檬、枳柚、Rusk枳橙和枣阳小叶枳阳性植株/接种植株（阳性率）分别为16/17（94.12%）、12/14（85.71%）、16/21（76.19%）、15/19（78.95%）、13/14（92.86%）和0/18（0）。其中,部分摩洛哥酸橙出现典型CVEV侵染症状,叶片侧脉和支脉产生耳状小突起,叶背有相应的凹陷;部分邓肯葡萄柚和尤力克柠檬出现叶片皱缩现象。【结论】建立了CVEV的基因组全长RT-PCR扩增体系,获得了CVEV基因组全长cDNA侵染性克隆,通过农杆菌介导的真空浸润接种可引起摩洛哥酸橙、邓肯葡萄柚和尤力克柠檬的CVEV侵染症状。     

红海榄液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆与分析

根据液泡膜Na+/H+反转运蛋白基因(fHXl)的保守序列设计引物,通过RT-PCR扩增得到红海榄Na+/H+反转运蛋白基因的cDNA片段,然后采用cDNA末端快速扩增法(RACE)得到RsHX1基因的全长cDNA序列,GenBank登录号为FJ627273,被命名为RsNHXl.该基因序列的长度为2 094 bp,包...     

杉木纤维素合成酶类似蛋白基因ClCslD1的克隆及其生物信息学分析

纤维素合成酶类似蛋白(CSL)作为一种重要的膜蛋白与纤维素合成酶具有相类似的蛋白结构,都含有D,D,D,QXXRW保守区.利用其他物种中的CesA基因的保守序列设计简并引物,采用反转录-聚合酶链式反应(RTPCR)结合cDNA末端快速扩增技术(RACE)成功地从杉木Cunninghamia lanceolata中扩增出一个含有完整阅读框架的cDNA序列,长度为4 150 bp,开放阅读框架为3 396 bp,编码1 132个氨基酸并含有保守的D,D,D,QXXRW天冬氨酸残基序列.应用美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库对获得的基因进行序列分析比对,发现它属于CslD基因家族,命名为ClCslD1基因.多重序列比对结果分析表明,该蛋白与来自颤杨Populus tremuloides,水稻Oryza sativa,拟南芥Arabidopsis thaliana等的同源基因相似性高达71％以上.利用生物软件对其进行生物学分析,为进一步研究其在植物纤化中的功能奠定基础.     

RACE方法获得番茄蓝光受体基因Phototropin-2全长及其过量表达载体的构建

采用RACE及降落PCR技术从番茄幼苗总RNA中克隆出PHOT-2基因的3’及5’末端片断,并根据测序结果,设计拉基因全长引物获得了PHOT-2基因全长。结果表明,该基因全长3 381 bp,含开放阅读框2 856 bp,编码952个氨基酸;与拟南芥PHOT-2氨基酸序列相比,同源性高达68%,主要功能区域同源性高达99%。将番茄PHOT-2基因定向插入pHB质粒中构建成过量表达载体,重组质粒转化农杆菌EHA105感受态细胞。     

龙眼子叶胚3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的cDNA克隆及序列分析

从龙眼子叶胚中分离得到一个大量表达的表达序列标签(EST),该EST编码序列与金鱼草3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的同源性为84%,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了龙眼GAPDH基因全长序列.序列分析表明,龙眼GAPDH基因的cDNA全长为1395 bp,包括一个长1008 bp、编码336个氨基酸的开放阅读框(ORF),5′端非编码区(UTR)长71 bp,3′-UTR长316 bp.龙眼GAPDH基因编码的氨基酸序列与水稻、葡萄、小果野蕉、拟南芥、银杏等GAPDH基因的氨基酸序列同源性均高达85%以上,该基因在GenBank中的登录号为FJ694011.     

酸柚根系CS和PEPC基因的克隆及序列分析

以酸柚(Citrus grandis)根系为材料,利用热硼酸法提取了根系总RNA,并逆转录成cDNA,利用PCR和RACE技术相继得到柠檬酸合酶基因(CS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)的保守区、3'端和5'端.酸柚根系CS基因全长1760bp,开放读码框有1413 bp,编码472个氨基酸,氨基酸序列相对分子质量为52.487 ku,等电点为6.9,亲水指数为-0.199;5'端非编码区为67 bp,3'端非编码区为277 bp;推导的氨基酸经序列比对,发现与其他物种具有很高的同源性(85.4%-99.6%).酸柚根系PEPC基因全长3307 bp,开放读码框有2604 bp,编码868个氨基酸,氨基酸序列相对分子质量为99.569ku,等电点为6.68,亲水指数为-0.398;5'端非编码区为431 bp,3'端非编码区为269 bp,推导的氨基酸经序列比对,发现与其他物种具有很高的同源性(85.8%-95.7%).初步确定克隆到的为酸柚根系CS和PEPC基因,登陆Genbank,登陆号分别为HQ537481和HQ537482.     

八角莲肉桂醇脱氢酶基因的克隆和表达分析

鬼臼毒素是八角莲的重要药效成分。利用同源克隆和RACE的方法,从八角莲的根中克隆了鬼臼毒素生物合成途径肉桂醇脱氢酶(Cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)基因,长1 098 bp,编码由365个残基组成的氨基酸序列。八角莲CAD蛋白不含有质体定位的信号序列,与毛白杨(Populus tomentosa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)等物种中CAD蛋白的一致性为67.25%;系统发育分析表明,它与拟南芥的At CAD7、At CAD8和AtCAD6蛋白亲缘关系较近,聚成一个簇。组织表达分析结果表明,八角莲CAD基因在根和茎中有表达,而叶片中表达不明显。本研究获得的CAD基因,为后续进行详细的功能解析,并进一步应用于鬼臼毒素的遗传调控,奠定了基础。