海岛棉转录因子基因GbTCP27的克隆及表达特性分析

为探究转录因子GbTCP27在棉花纤维发育中的作用,使用RT-PCR技术从海岛棉‘新海21号’中克隆GbTCP27,并对其进行生物信息学和表达特性分析。结果表明,该基因有1个1 017 bp的开放阅读框,编码338个氨基酸,预测分子量约为35.37 ku,等电点为9.08,分子式为C_(1549)H_(2511)N_(439)O_(483)S_(11),序列中含有一个高度保守的TCP结构域;氨基酸序列对比表明,海岛棉GbTCP27基因在进化过程中是相当保守的,蛋白序列与其他植物中的TCP蛋白序列有较高的一致性;亚细胞定位结果显示,GbTCP27属于核定位基因,推测GbTCP27可能在复制和转录的过程中发挥作用;进化树分析表明,海岛棉GbTCP27基因与亚洲棉GaTCP9基因分布在同一分支上;实时荧光定量PCR表明,GbTCP27基因在开花当天的花瓣和开花当天的胚珠中表达量最高;综上所述,GbTCP27转录因子可能参与棉花纤维起始期胚珠表皮细胞的发育。     

海岛棉转录因子基因GbTCP44的克隆及特征分析

为阐明TCP基因在棉花纤维发育中的功能,以海岛棉‘新海21号’为材料,运用RT-PCR技术克隆得到海岛棉GbTCP44基因的cDNA序列,并借助生物信息学、亚细胞定位、实时荧光定量PCR技术分析预测其结构和功能。结果表明:1)GbTCP44基因的编码区序列全长为1 035bp,共编码344个氨基酸,预测分子式为C_(1618)H_(2538)N_(484)O_(525)S_(13),分子量约为37.59ku,等电点为8.83,其序列(N端)有一个高度保守的TCP功能结构域,属于TCP转录因子家族Class I成员;2)GbTCP44基因在细胞核中表达,属于核表达蛋白,该蛋白的结构域与其他植物TCP蛋白具有高度的保守性,并与雷蒙德氏棉的亲缘关系最近;3)GbTCP44基因在花器官中的表达量显著高于营养器官的表达量;该基因在棉纤维发育20d时的表达量均为最高;当棉纤维发育至25和30d时,该基因在长纤维品种中的表达量低于在短纤维品种中的表达量,且存在显著差异(P0.05),表明GbTCP44基因可能参与棉花纤维伸长期的纤维细胞伸长的发育。     

海岛棉纤维均一化酵母双杂交文库的构建与GbTCP5互作蛋白的筛选

为探究转录因子在海岛棉纤维中的生物学功能,以海岛棉8个时期的纤维为研究对象,利用SMART技术合成ds-cDNA,经DSN进行均一化处理,构建以pGADT7为载体的海岛棉纤维均一化酵母cDNA文库,利用酵母双杂交系统筛选与海岛棉GbTCP5互作的蛋白。根据克隆得到的GbTCP5基因的CDS区设计含有NcoⅠ、EcoRI酶切位点的引物,构建诱饵载体pGBKT7- GbTCP5。经自激活和毒性检测后共转化酵母菌株Y2HGold,筛选与GbTCP5互作的蛋白。实时荧光定量PCR显示,GbTCP5基因在纤维发育起始期和伸长期的表达量较高,且在花瓣和花萼中的表达量高于其他组织。文库的质量检测显示,构建的均一化cDNA文库库容为9.15×10⁷ cfu·mL^-1,重组率为100%,插入片段大小在500~2 000 bp之间。诱饵载体pGBKT7-GbTCP5通过酵母双杂交系统多次筛选、回转验证,最终确定了4个互作的蛋白,分别是GbTCP20、GbTCP42、GbTCP45和GbAHP1蛋白。海岛棉纤维均一化cDNA文库的构建和筛选,为进一步研究海岛棉TCP转录因子及其互作蛋白在纤维发育时期中的作用机制奠定了基础。