转GHABF4转录因子棉花植株的耐盐性研究

AREB/ABFs转录因子家族基因主要参与干旱、高盐、低温等胁迫应答反应。为了获得具有较高耐盐水平的棉花新种质材料,通过农杆菌介导法将耐盐转录因子基因(GHABF4)导入陆地棉中棉35中,通过对转化植株的卡那霉素初步筛选及T1、T2、T3目的基因PCR的分子检测,获得T3转基因棉花纯合系。通过盐胁迫试验对5个T3转基因棉花株系和非转基因棉花对照进行耐盐性分析。结果表明,在200 mmol/L Na Cl胁迫下,与非转基因对照相比,5个转基因棉花株系株高提高2.5~4.4 cm,地上部分的鲜质量增加3.6%~11.8%;且抗氧化物酶SOD、POD、CAT活性以及叶绿素含量提高。在盐胁迫条件下,转GHABF4基因棉花表现出优良的生长和生理优势,转GHABF4基因能够提高棉花的抗盐能力。     

转ZmPEPC与ZmPPDK基因拟南芥对干旱胁迫的反应

为探究干旱胁迫对转玉米高光效基因ZmPEPC与ZmPPDK拟南芥的影响,本研究选用2个转PEPC基因株系(PC90,PC73),2个转PPDK基因株系(PK17,PK26),1个转PEPC+PPDK基因株系(PCK110)和对照株系(GLC)为试验材料。在幼苗期分别用150mmol/L和250mmol/L甘露醇(Mannitol)模拟干旱胁迫处理,测定幼苗根长,结果显示,在胁迫处理下,转PEPC、PPDK和PEPC+PPDK基因拟南芥幼苗的平均相对根长分别较对照增加了43.8%,48.4%和50.6%。在成株期进行干旱胁迫处理,测定莲座叶片的叶绿素荧光参数,叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛含量和成株死亡率,结果显示,在胁迫处理下,供试材料F0增加,Fv/Fm减小,对照F0增幅最大,为20.4%,Fv/Fm最小,为0.78;转PEPC、PPDK和PEPC+PPDK基因拟南芥株系平均相对叶绿素含量分别较对照增加12.6%,15.4%和23.1%;可溶性糖含量分别较对照增加3.0%,16.3%和24.4%;可溶性蛋白含量分别较对照增加0.6%,10.8%和15.4%;丙二醛含量较对照降低,分别为对照的93.5%,90.3%和84.10%;死亡率分别为12.3%,13.3%和6.7%,极显著低于对照(87.7%)(P<0.01)。上述结果表明,玉米高光效基因ZmPEPC和ZmPPDK可增强拟南芥抵抗干旱胁迫的能力,且这两个基因的共表达可能存在协同作用。     

转AhCMO基因棉花苗期对干旱胁迫的生理反应

以转AhCMO基因的2个棉花品系L1和L2及其转化受体泗棉3号(SM3)为材料,研究了转AhCMO基因棉花对干旱胁迫的生理反应。试验采用盆栽方式在日光温室中进行,以维持土壤含水量为最大持水量的45%作为干旱处理,以正常供水维持土壤含水量为最大持水量的75%作为对照。结果表明,正常供水条件下转基因品系L1和L2与SM3生长表现一致。但是干旱胁迫下,转基因品系L1和L2的干物质积累量、平均净光合速率以及叶片叶绿素的含量都显著高于SM3;而且L1和L2叶片中甜菜碱含量显著高于SM3,过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性也较SM3显著提高。说明2个转AhCMO基因品系的耐旱性得到明显提高,耐旱性的提高与甜菜碱积累量的增加、POD和SOD活性的增强有关。     

利用子房滴注法获得转高亲和性钾离子转运蛋白基因(AlHAK1)棉花植株

棉花植株再生困难、基因型依赖性强和转化周期长等因素一直制约着棉花遗传转化的发展。本研究利用1种不依赖组织培养的转化方法 ,即子房滴注转化方法将獐茅高亲和性钾离子转运蛋白基因(Al HAK1)导入棉花基因组中。结果表明在1006株转化幼苗中有44株为卡那抗性植株,其中35株经PCR检测为阳性(T0代),转化率为3.5%。Southern与Northern杂交结果进一步表明外源基因已整合至棉花基因组中并在转录水平上表达。在提供外源0.05 mmol·L-1 K+水平下,T1转基因棉花叶片中K+含量约为对照植株的2倍,在根中约为野生型植株的1.5倍;而在2.5 mmol·L-1 K+的正常水平下,转基因棉花与野生型植株K+含量差异不明显。在50~200 mmol·L-1 Na Cl胁迫条件下,转基因棉花的种子发芽率明显高于野生型植株,尤其是在150mmol·L-1Na Cl胁迫条件下,转基因植株种子的发芽率是野生型的2.8倍左右。本研究为子房滴注转化体系在生产实践中的广泛应用提供了理论依据,并为培育适应土壤钾素匮乏及盐渍化环境下生长的棉花新品种提供了新的种质资源。     

转MvNHX1和MvP5CS基因棉花耐盐抗旱性比较与育种价值分析

通过对花粉管通道法获得的T7转MvNHX1基因的10个棉花株系和转MvP5CS基因的3个棉花株系与对照非转基因棉花D5在温室内盐和干旱胁迫下的发芽率、生理生化指标以及田间花期干旱胁迫下农艺性状和纤维品质进行分析发现:温室内盐和干旱胁迫后,转基因棉花叶片叶绿素含量、脯氨酸含量均高于对照,而丙二醛含量低于对照;田间花期干旱胁迫下,2种转基因植株果枝数、有效果枝数、铃数、有效铃数、铃重、子棉、皮棉、衣分、子指和衣指均高于对照,说明转MvNHX1基因和转MvP5CS基因植株在干旱逆境下的产量高于非转基因;经花期干旱胁迫后,2种转基因棉花的纤维断裂伸长率、短纤维率、马克隆值和纺纱一致性指数优于非转基因棉花D5。综合分析表明:2种转基因棉花的耐盐抗旱性均有提高,其中转MvNHX1基因棉花的耐盐性优于转MvP5CS基因棉花植株,而转MvP5CS基因棉花植株的抗旱性优于转MvNHX1基因棉花植株。     

小麦胁迫相关基因TaLEAL3的克隆及分子特性分析

第3组LEA蛋白(late embryogenesis abundant protein)介导干旱、高温、高盐等非生物胁迫响应, 关于普通小麦LEA基因的研究鲜有报道。利用噬菌体原位杂交技术, 从小麦苗期干旱胁迫条件构建的cDNA文库中筛选出LEA蛋白基因TaLEAL3, 其全长750 bp, 编码区长501 bp, 编码166个氨基酸, 含有一个明显的核定位信号区。氨基酸同源性分析发现, TaLEAL3属于第3组LEA蛋白, 序列中含有由11个氨基酸组成的3个不完全重复的基序和α-螺旋的LEA结构。电子定位结果显示, TaLEAL3基因位于4BL、4DL和5AL染色体上, 主要在茎中表达, 而在根中几乎无表达。实时荧光定量PCR分析表明, 在干旱、低温和ABA诱导下, TaLEAL3基因表达量明显增加。在该基因上游1.7 kb序列处, 预测具有启动子的核心序列和增强子序列, 及与干旱和低温等多种逆境胁迫相关的调控序列。本研究为深入分析小麦LEA蛋白基因的功能, 初步解析LEA蛋白的作用机制提供了数据。     

转大豆GmPRP和SbPRP基因烟草对非生物胁迫耐受能力分析

为实现PRPs基因在植物抗逆基因工程中的应用,将大豆中的2个脯氨酸富集蛋白基因GmPRP和SbPRP构建到植物表达载体pRI101上,通过叶盘法转化烟草。共获得GmPRP阳性转基因烟草2株,SbPRP阳性转基因烟草4株。对转基因烟草植株进行高盐、干旱和低温胁迫处理。结果表明,高盐处理后,SbPRP转基因烟草的脯氨酸含量和可溶性糖含量分别显著和极显著高于野生型,丙二醛含量极显著低于野生型。干旱处理对GmPRP和SbPRP转基因烟草脯氨酸含量、可溶性糖含量和丙二醛含量的影响均不明显。低温处理后,GmPRP和SbPRP转基因烟草的脯氨酸含量均极显著高于野生型,丙二醛含量均低于野生型。由此推测SbPRP可以提高转基因烟草的耐盐性和耐寒性,GmPRP可以提高转基因烟草的耐寒性,为后续SbPRP和GmPRP的应用奠定基础。     

水稻ABA生物合成基因OsNCED3响应干旱胁迫

9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是植物内源脱落酸(ABA)生物合成的限速酶,由NCED基因家族编码,水稻中响应干旱胁迫并以此调节ABA水平的OsNCED基因尚见未报道。本研究发现在水稻已报道的5个OsNCED基因中,OsNCED3的表达受干旱胁迫诱导,复水处理后其表达快速下调,其表达模式与此过程中内源ABA含量变化趋势一致。OsNCED3的RNAi转基因植株表现为干旱敏感,且生物量下降;而过量表达OsNCED3基因增加了水稻的抗旱性。干旱胁迫下过量表达OsNCED3的转基因株系有较高的ABA水平,同时其抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性,以及逆境响应基因脱水素蛋白(Dehydrin)和胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)转录表达均高于野生型。下调表达OsNCED3的转基因株系则呈现相反的变化趋势。因此,OsNCED3是水稻干旱胁迫响应基因,调节了干旱环境下ABA水平和抗逆性。     

干旱胁迫对转IrrE基因甘蓝型油菜生理生化指标的影响

以转IrrE基因与非转基因甘蓝型油菜为材料,用10%(W/V)PEG6000(聚乙二醇)进行了干旱胁迫实验,比较研究了转IrrE基因与非转基因甘蓝型油菜幼苗的耐受性应答情况。结果表明:转基因油菜植株含水量下降趋势小于非转基因油菜植株;转基因油菜植株叶绿素含量和荧光参数F0的上升趋势均明显大于非转基因油菜植株;转基因油菜植株的Fv/Fm值和可溶性蛋白含量均大于非转基因油菜植株,但丙二醛(MDA)含量小于非转基因油菜植株。以上结果从侧面证实了:在干旱胁迫下,转IrrE基因油菜植株较非转基因植株有更强的耐受能力;IrrE基因作为一种转录调节因子,广泛参与了油菜幼苗对干旱胁迫的耐受性应答过程,增强了植株的耐旱能力。     

棉花CBF基因的克隆及其转基因烟草的抗寒性分析

从中棉12 (Gh12)、中棉36 (Gh36)和海岛棉7124 (Gb7124)品种中克隆并鉴定了棉花的CBF基因,该基因编码一个由184个氨基酸组成的蛋白CBF,该蛋白具有CBF转录因子典型的序列标签“PKRRAGRKKFQETRHP”和“FADSAW”。Southern杂交表明,CBF基因在3个棉花品种中均以基因家族的形式存在。围绕海岛棉7124的CBF基因(GbCBF1)开展的逆境表达谱分析表明,GbCBF1基因受低温、干旱、盐和ABA等多种逆境条件的诱导表达。将GbCBF1基因构建到由强启动子35S和弱启动子NOS这2种启动子控制的植物表达载体pCambia2301上并转化烟草NC89,经过筛选及PCR鉴定,共获得26株转基因烟草。对部分T₁代植株进行的PCR和RT-PCR检测表明,GbCBF1基因可以在烟草中正常转录并遗传。分析表明,在低温下,转基因烟草的电解质渗漏率普遍低于野生型烟草,而游离脯氨酸含量和可溶性糖含量均高于野生型烟草,说明转GbCBF1基因提高了烟草的耐寒性。     

转水稻OsSIK1基因玉米植株的获得及抗旱性分析

类受体激酶基因Os SIK1具有通过激活抗氧化系统,增强水稻对于干旱和盐胁迫抗性的作用。为了丰富可利用的作物抗旱基因,获得具有较高抗旱水平的玉米新种质,通过超声波辅助花粉介导法,将水稻类受体激酶基因Os SIK1导入玉米自交系郑58中,并对转化株进行卡那霉素筛选及T1、T2、T3的PCR及Southern Blotting杂交等分子检测,获得转化植株并在T3获得转基因纯合株系。对T3转基因玉米和非转基因玉米对照以16.1%的PEG模拟水分胁迫进行抗旱性分析。结果表明,与对照相比,在水分胁迫处理下,转基因玉米株系叶片相对含水量提高了7.4%~19.8%,叶绿素含量提高了11.3%~106.9%,SOD活性上升45.8%~93.4%,而转基因玉米叶片的相对电导率下降了35.4%~58.1%,MDA含量下降了25.7%~50.4%,说明转Os SIK1基因玉米植株抗旱性得到提高,其中,5个转化株系与对照在抗旱性方面有显著差异,且生长状况明显优于对照。综上所述,研究最终获得5个转Os SIK1基因玉米株系,并证明导入水稻Os SIK1基因可以提高玉米植株的抗旱性。     

马铃薯HD-Zip I家族ATHB12基因的克隆及功能鉴定

HD-Zip I是一类植物特异转录因子, 在植物应对外界逆境胁迫过程中有重要的调控作用。本研究从马铃薯栽培品种甘农薯2号中克隆了HD-Zip I转录因子ATHB12基因, 其开放阅读框为759 bp, 编码252个氨基酸残基。该基因位于马铃薯1号染色体, 其启动子区含有ABRE、LTRECOREATCOR15和WBOXATNPR1等多种响应非生物胁迫(ABA、低温、脱水及高盐)的顺式作用元件。ATHB12基因在马铃薯根、茎和叶中均有表达, 其根中表达量最高。qRT-PCR分析证实该基因的表达受聚乙二醇(PEG)、NaCl和ABA诱导, 受低温抑制。构建了由组成型表达启动子CaMV 35S驱动的ATHB12基因的过表达载体, 通过农杆菌介导法转化马铃薯获得了转基因植株。干旱处理后, 转基因植株叶片中丙二醛含量显著低于非转基因植株(P<0.05), 而脯氨酸含量显著高于非转基因植株(P<0.05); 转基因植株根鲜重和干重均高于非转基因植株; 说明马铃薯ATHB12基因可能参与了逆境胁迫的响应。     

棉花HSP70基因植物表达载体的构建及转化烟草的研究

为研究棉花HSP70 基因在转基因植物中抗旱效果,利用前期克隆的GhHSP70 基因,以pCAMBIA1304 质粒为植物表达载体,构建了GhHSP70 基因的植物表达载体CAMBIA1304-HSP70;采用冻融法转入根癌农杆菌EHA105 菌株,通过叶盘法对模式植物烟草进行遗传转化研究。结果表明,在潮霉素(50 mg/L)选择压力下获得的烟草转化不定芽和完整植株,经过PCR方法以及GUS基因组织化学法检测鉴定转基因烟草,其中有5 株为阳性植株。初步证实了GhHSP70 基因已导入烟草基因组中。为进一步研究该基因的功能提供实验基础,同时为后续转化棉花改善其抗旱能力奠定基础。     

amiRNA技术沉默C-3氧化酶编码基因StCPD对马铃薯抗旱性的影响

CPD (constitutive photomorphogenesis and dwarf)基因编码C-3氧化酶, 为油菜素内酯(brassinosteroid, BR)生物合成途径中的限速酶, 在植物响应逆境胁迫过程中具重要调控作用。本研究利用人工microRNA (artificial microRNA, amiRNA)技术, 构建马铃薯CPD基因(StCPD)的干扰表达载体pCPB121-amiRcpd, 通过根癌农杆菌介导法将其转入马铃薯栽培品种“紫花白”, 获得转基因植株(Ci1~Ci5), 其中Ci1和Ci3的StCPD基因干扰程度分别为78%和90%。基因组织表达特异性分析表明, StCPD在马铃薯试管苗叶片中表达量最高, 是茎和根中表达量的3.05倍和1.65倍。转基因植株株高、茎粗、根长、鲜重及薯的大小和鲜重等指标均较非转基因(NT)植株显著下降, 表明StCPD基因干扰表达后, 植株的长势明显受到抑制。模拟干旱胁迫处理下, 转基因植株叶片中丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量显著高于NT植株, 而脯氨酸含量显著低于NT植株。转基因和NT马铃薯中, StCPD基因的表达量、MDA和脯氨酸含量均显著高于对照; 且随着胁迫处理时间延长, 基因表达量呈持续增强趋势, MDA和脯氨酸含量随之增加。结果表明, StCPD基因干扰表达能明显降低马铃薯对干旱胁迫的抵抗能力, 为进一步研究BR对马铃薯生长发育和对干旱胁迫的响应奠定了基础。     

花生AhPLDα基因植物过表达载体构建及对拟南芥的遗传转化

为了明确花生AhPLDα基因在响应干旱胁迫信号传导中的功能和作用机制,以ABA处理的冀花4号花生叶片c DNA为模板,用RT-PCR方法扩增AhPLDα1和AhPLDα2的全长CDS片段,采用酶切-连接的方法分别将这2个基因定向克隆到植物表达载体p Bar-F3上,冻融法将重组子转入根癌农杆菌GV3101,利用改良Floral-dip法将过表达质粒转入拟南芥。菌落PCR和酶切结果表明,Ca MV35S启动子驱动的过表达载体重组质粒p Bar-AhPLDα构建正确。通过RT-PCR和qRT-PCR验证,表明AhPLDα1和AhPLDα2基因整合到拟南芥基因组中并能过量表达,获得了阳性转基因纯合株系。干旱胁迫试验表明,转基因植株的耐旱性较野生型明显增强。可见,AhPLDα基因参与了干旱胁迫应答过程,是转基因途径提高作物耐旱性的潜在候选基因。     

转双价基因棉花对根际土壤酶活性和养分含量的影响

在田间试验条件下,以3种转双价基因棉和常规棉石远321为研究对象,比较分析转双价基因棉和常规棉石远321根际土壤酶活性及养分的变化。结果表明,转双价Cry1Ac+CpTI基因棉sGK321与石远321根际土壤速效磷和铵态氮含量无显著差异,而硝态氮含量则显著高于石远321;转双价Cry1Ac+Cry2Ab基因棉(双Bt抗虫棉)速效磷和铵态氮含量均显著低于石远321,而硝态氮含量与石远321无显著差异;转双价Cry1Ac+Epsps基因棉(抗虫抗除草剂棉)速效磷和硝态氮含量均显著高于石远321,而铵态氮含量显著低于石远321。sGK321棉与石远321根际土壤脲酶、碱性磷酸酶和过氧化氢酶活性均无显著差异;双Bt抗虫棉土壤脲酶活性显著低于石远321,碱性磷酸酶和过氧化氢酶活性与石远321均无显著差异;抗虫抗除草剂棉与石远321土壤脲酶活性无显著差异,碱性磷酸酶活性显著高于石远321,而过氧化氢酶活性显著低于石远321。表明sGK321棉与石远321根际土壤养分(硝态氮除外)含量和酶活性无显著差异,而双Bt抗虫棉和抗虫抗除草剂棉所呈现的差异是因不同品种所致。     

GUS基因和NPTⅡ基因表达的相关性及其在转基因棉花检测研究中的应用

利用农杆菌介导转化法,将含有35S启动子驱动NPTII基因和GUS基因以及棉纤维特异表达启动子E6驱动目的基因FB的植物表达载体转入到常规棉花R15中.重点分析了GUS基因和NPTII基因在愈伤诱导阶段、T0代及T1代转基因棉花中的表达情况.综合两个基因的表达来进行转基因棉花的阳性鉴定,可以为转基因棉花后代的纯合选育提供双重保障.7个转基因株系选育到T3代共获得株行51个,卡那霉素检测多数株行阳性率在90%以上,其中21个株行阳性率达100%.     

甜菜M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶提高植物抗逆性功能分析

为研究甜菜M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因(BvM14-CCoAOMT)的功能,本研究采用叶盘法将M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因转化烟草,获得T1代转基因植株,而后以野生型及转空载体植株为对照,分别在对照、100 mmol/L NaCl、200 mmol/L NaCl、100 mmol/L甘露醇及200 mmol/L甘露醇的培养条件下进行植株生理指标的抗逆性分析。研究发现在100 mmol/L NaCl、200 mmol/L NaCl盐胁迫条件下,转基因植株的鲜重、木质素含量以及叶绿素含量均显著高于对照植株。此外,研究结果表明转基因植株在100 mmol/L甘露醇胁迫条件下根长和叶绿素含量显著高于对照植株,如转基因植株的根长和叶绿素含量分别为0.68 cm和 0.31 mg,而野生型植株的根长和叶绿素含量分别为0.51 cm 和0.18 mg。研究结果表明转M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因烟草植株对盐和干旱胁迫具有较强抗性,这为进一步深入研究M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因功能奠定重要基础。