牛体外受精早期胚胎与小鼠胎仔成纤维细胞共培养的研究

探讨了人工合成培养液ＣＲ１ａａ和小鼠胎仔成纤维细胞对牛体外受精早期胚胎体外发育的影响。结果表明，牛体外受精卵在ＣＲ１ａａ液中的卵裂率达７６．２％，８细胞胚的比率达４４．８％。小鼠胎仔成纤维细胞能够显著促进牛体外受精的早期囊胚以上胚胎的发育。牛体外受精后第５、６天的早期胚胎分别与小鼠胎仔成纤维细胞共培养，在受精后第７天发育至囊胚以上的比率分别达１９．８％和２４．６％；受精后第８天，孵化的囊胚比例分别达５．２％和７．５％。实验表明，受精后第５、６天的牛体外受精早期胚胎与小鼠胎仔成纤维细胞共培养，可显著提高扩张囊胚和孵化囊胚数量。小鼠成纤维细胞对胚胎发育的支持作用取决于胚胎发育阶段     

卵母细胞核因子促进核移植四倍体胚胎早期发育研究

研究旨在探讨猪卵母细胞核因子在重编程过程中发挥的作用。将体细胞引入未去核的MⅡ期卵母细胞中,构建体细胞核与卵母细胞核共存的核移植四倍体胚胎。通过分析核移植四倍体胚胎的早期发育情况探讨卵母细胞核因子对核移植四倍体胚胎早期发育的影响。结果显示,核移植四倍体胚胎、孤雌二倍体胚胎及孤雌单倍体胚胎这3组胚胎的卵裂率极显著高于核移植二倍体胚胎（P<0.01）,且核移植四倍体囊胚率及总细胞数也极显著高于核移植二倍体囊胚（P<0.01）。与通过标准核移植程序构建的核移植二倍体胚胎相比,核移植四倍体胚胎具有更强的发育能力。本研究建立了一个体细胞核与完整卵母细胞核因子物质共存的四倍体胚胎模型,有助于研究供体核与卵母细胞核之间的联系,为研究核因子在重编程过程中发挥的作用提供了平台。     

电激活对完全体外化牛细胞核移植的影响

牛卵母细胞在体外成熟２３～２４ｈ时去核，去核卵用８０Ｖ／ｍｍ４０μｓ两次电脉冲激活（Ⅰ组）或不激活（Ⅱ组），然后将体外受精、发育的８～３２细胞期胚胎的单个卵裂球注入卵周隙，用８０Ｖ／ｍｍ４０μｓ两次电脉冲诱导卵裂球与去核卵母细胞融合。Ⅰ组操作后存活率和融合率（８８．４％和５５．０％）显著低于Ⅱ组（９５．９％和６５．１％，Ｐ＜０．０５）。融合卵体外培养２４ｈ和５～８ｄ后，Ⅰ组核移植胚胎的卵裂率和桑椹／囊胚发育率（６３．０％和１５．２％）与Ⅱ组（５０．５％和７．８％）无显著差异，但Ⅰ组结果均好于Ⅱ组。将来自两组的２５枚桑椹和囊胚移植到１６头同期受体，在已检查过的８头受体中２头受体妊娠，其中１头于妊娠后４个多月流产，１头于妊娠期满后产出一雄性牛犊。研究结果表明：去核卵母细胞的电激活尽管对重组卵的存活与融合不利，但可改善核移植胚的卵裂和发育。本研究在我国首次获得牛细胞核移植的成功，证明用ＩＶＭ卵母细胞和ＩＶＦ胚胎进行完全体外化的牛细胞核移植是可行的。     

家兔胚胎细胞核移植的研究现状

胚胎细胞核移植技术(核移植)是指将不同发育时期的胚胎细胞核以显微手术及细胞融合的方法移植到去核卵母细胞或受精卵中,并使重组胚胎发育至产仔的过程。通过此技术,不仅可以生产出大量的克隆动物,而且对于研究动物胚胎的发育机理也具有重要的作用。 早在1905年,Spemann就证明,蝾螈早期胚胎的卵裂球具有功能相同的核,并在1938年提出了核移植的设想;按这一设想,1952年Berggs和King首次获得了两栖类美洲豹蛙的核移植后代。到80年代,核移植技术在哺乳动物中也相继获得成功,目前已取得了绵羊、牛、小鼠、兔、猪、山羊的核移植后代。而且核移植技术也成功地用于研究细胞的核质关系,配子发光过程中核的相互作用等方面。     

牛体外受精胚胎卵裂阶段对其体外发育能力影响的研究

将经过体外成熟培养（ＩＶＭ）、体外受精（ＩＶＦ）后获得的牛早期胚胎，按其所处卵裂阶段的不同，划分为２细胞、３～４细胞和５细胞以上３个试验组，在体外条件下继续培养到发育囊胚和孵化囊胚阶段，以观察在胚胎早期，受精卵裂发育的快慢与其后胚胎所获得的继续发育能力的关系。结果显示，牛早期胚胎体外囊胚发育率的高低，与其在体外培养（ＩＶＣ）前卵裂发育的快慢成正比。在ＩＶＦ后４２～４６ｈ处于２细胞、３～４细胞和５细胞以上卵裂阶段的早期胚胎，其囊胚发育率分别为６．５％、２１．４％和４４．９％，差异非常显著（Ｐ＜０．００１）；而经过７～９ｄ的ＩＶＣ后仍滞留在ＩＶＣ前原卵裂阶段，丧失继续发育下去能力的胚胎比率则分别为５１．６％、３２．７％和２５．７％，与其ＩＶＣ前卵裂发育的快慢成反比。在ＩＶＦ后６６～７０ｈ仍处于２细胞和３～４细胞卵裂阶段的早期胚胎，其体外发育能力明显降低，囊胚发育率只有１．３％和８．２％；而滞留胚胎率则分别高达９０．９％和５９．４％。结果表明，牛体外受精早期胚胎卵裂发育的快慢，直接影响到其后体外发育的能力。     

鳜→鲤的细胞核移植

本文报道用细胞核移植的方法,获得了亲缘关系较远的不同目鱼类之间的核一质杂种鱼胚胎.即以鳜鱼的囊胚细胞核作供体,以鲤鱼的成熟未受精去核卵细胞质作为受体进行核移植试验,使囊胚细胞核发生分裂,从而启动卵细胞质也发生分裂,导致重新进行个体发育.在获得的112个正常发育的核移植卵中,发生卵裂的107个,占95.5%发育至囊胚期的61个,占54.5%,发育至原肠期的6个,占5.4%,发育至神经胚期和胚孔封闭期的各1个,分别占0.9%.鳜→鲤核质杂种胚胎类似鲤鱼同期胚胎,其早期发育速度与鲤鱼相似而比鳜鱼快.各杂种胚胎发育期的胚盘形状及大小均类似鲤鱼,大于鳜鱼同期胚盘,且胚盘细胞较多,但比鲤鱼胚盘细胞小,这是鳜→鲤核质杂种胚胎发育的一个显著特点.作者认为核-质杂种胚胎的性状发育,受核受体物种的母性影响控制.     

家兔胚胎细胞核移植与连续移植

将发育不同时期的兔胚和移核胚的卵裂球细胞核与去核的成熟卵母细胞共同组成移核胚,通过中间受体培养和移植实验检验胚胎的发育能力。结果表明,（１）兔囊胚之前各个时期的胚胎细胞核均可使移核胚发育到囊胚;（２）胚胎极化前后的卵裂球参与组成的移核胚发育到囊胚的比例无显著差异。但极化后 ６４细胞胚的卵裂球与去核卵母细胞的融合率低于极化前的 ８细胞胚胎卵裂球;（３）兔 １６细胞胚与去核的卵母细胞组成的移核胚可以发育到期,产仔率为 ３．１６％ ;（４）兔移核胚卵裂球用于连续核移植,其后 ２ 代均可发育成囊胚,其中第 １ 代移核胚与第 ２ 代移核胚发育率相似,但显著高于第 ３ 代移核胚;（５）兔移核胚和各代连续移核胚卵裂球与去核卵的融合率无显著差异。     

牛体外受精胚胎卵裂阶段对其体发育能力影响的研究

将经过体外成熟培养（ＩＶＭ），体外受精（ＩＶＦ）后获得的牛早期胚胎，按其所处卵裂阶段的不同，划分为２细胞、３～４细胞和５细胞以上３个试验组，在体外条件十继续培养到发育囊胚和孵化囊胚阶段，以观察在胚胎早期，受精卵裂发育的快慢与其后胚胎所获得的继续发育能力的关系。结果显示，牛早期胚胎体囊胚发育率的高低，与其在体外培养（ＩＶＣ）前卵裂发育的快慢成正比。在ＩＶＦ后４２～４６ｈ处于２细胞、３～４细胞和５细胞     

两种方法对牛体外受精及体外发育的影响

本研究包括２个试验。试验１，采用由多种大分子物质组成的生物试剂Ｐｅｒｃｏｌ做成离心梯度，离心处理精液获得较高活率的精子。将其用于卵母细胞的体外受精，在使用４５μＬ大小的受精滴及２×１０６个／ｍＬ的最终受精精子浓度时，加入２０个或４０个卵母细胞，二者均获得较高的分裂率（％）８９．０±５．０、８８．１±３．８及囊胚率（％）５１．０±７．０、４６．３±１６．７。试验２，为了更接近胚胎在母牛体内发育的实际状态（动态），采用一种新的方法即将摇床振动培养引入牛早期胚胎的体外发育阶段，以期提高胚胎发育质量。结果表明，在早期胚胎基数及环境因素完全一致的前提下，振动培养组的囊胚发育率（％）及囊胚卵化率（％）分别为６１．１±１２．２、８２．６±６．８，而常规的静置培养组为６７．４±６．３、８８．０±７．４，方差计算表明二者无显著差异（Ｐ＞０．０５）。     

牛体外受精胚胎一步脱防冻剂冷冻方法的研究

为了研究适合于牛体外受精胚胎的一步除防冻剂的冷冻方法，特进行两个试验。试验１分别用１．５Ｍ甘油＋０．２５Ｍ蔗糖、１．５Ｍ乙二醇和１．５Ｍ丙二醇作防冻剂冷冻体外受精后第７天，已发育至囊胚阶段的牛胚胎。使胚胎降温至－７℃后，植冰，然后以０．３℃／分的速率降温至－３０℃，立即将胚胎投入液氮中冷冻保存。在３７℃水中解冻胚胎后，使其直接在含１５％胎犊血清（ＦＣＳ）的磷酸缓冲液（ＰＢＳ）中脱去防冻剂。经体外培养７２ｈ后，３组胚胎的孵化率分别为７７．２７％（１０２／１３２）、７３．２４％（１０４／１４２）、４７．９０％（５７／１１９），第１、２组的孵化率极显著高于第３组（Ｐ＜０．０１），说明用１．５Ｍ丙二醇溶液冷冻的胚胎，在解冻后不宜直接在ＰＢＳ中脱防冻剂。试验２比较用不同浓度（１．０Ｍ０１．５Ｍ，２．０Ｍ）的乙二醇和不同投液氮温度（－２５℃，－３０℃，－３５℃）冷冻胚胎的效果。结果表明乙二醇浓度和投液氮温度对胚胎孵化率均无显著影响（Ｐ＞０．０５），各组胚胎的孵化率变动于７４．４４％－８５．４８％之间。     

曲古抑菌素A处理克隆胚对囊胚发育率的影响

[目的]探讨曲古抑菌素A（Trichostatin A,TSA）处理对囊胚发育率的影响。[方法]以牛胎儿成纤维细胞作为供体核,以牛卵母细胞作为受体胞质进行体细胞核移植,用80 nmol/L TSA处理供体细胞12 h,核移植后继续处理克隆胚胎0、6、12和24 h,应用激光共聚焦显微镜检测供体细胞组蛋白H4K12乙酰化水平,并通过核移植检测TSA不同时间处理的克隆胚胎囊胚发育率。[结果]TSA处理12 h的供体细胞组蛋白H4K12乙酰化水平显著增高（P〈0.05）;80 nmol/LTSA处理12 h的克隆胚的囊胚发育率（21.9%）高于未处理组（16.5%）,差异显著（P〈0.05）。[结论]供体细胞和克隆胚胎经TSA处理的12 h的克隆胚胎,显著提高了体外发育能力。     

体细胞克隆的小鼠胚胎在附植前后发育的研究

采用成年小鼠的卵丘细胞核、胎儿成纤维细胞作核供体细胞来进行核移植,研究小鼠卵母细胞的去核程序和影响重构胚附植前发育的激活条件;随后将重构胚与供体细胞系共培养后获得囊胚阶段的小鼠重构胚,并将其移植到受体鼠体内后获得了24%克隆胚胎。结果表明,小鼠卵母细胞质能够进行重编程来支持早期的胚胎发育。     

小鼠扩张囊胚低渗液处理试验

为研究解冻后的胚胎膨胀对其发育率的影响，本试验用２０～５０％的低渗ＰＢＳ溶液（即０．２０×、０．２５×、０．３０×及０．５０×），分别将小鼠扩张囊胚在低渗液中处理３０分钟后培养，结果新鲜胚在０．５０×和０．３０×中处理后的发育率分别为１００％和９１％，０．２０×处理组的发育率降低到５３％。解冻后的胚胎直接用低渗液处理，０．５０×组只有８５％继续发育，低于０．２５×组完全不能发育。而解冻后经培养恢复到扩张囊胚后再做低渗处理，０．３０×组仍有９６％继续发育。     

绵羊冷冻胚胎移植试验

绵羊冷冻胚胎有枚浆冻前Ａ级胚胎解冻后,胚胎等级有所下降,可用胚率为７７．９％,Ａ、Ｂ级胚移植妊娠率分别为３３．３％（１８／５４）和１６．７％（１／６）,差异不显著（Ｐ〉０．０５）;桑椹胚、早期囊胚、中期囊胚、扩张囊胚移植妊娠率分别为２０．８％（５／２５）、４２．９％（６／１４）、３５．７％（５／１４）５ ３７．５％（３／８）,囊胚期胚胎移植妊娠率较高,但差异不显著（Ｐ〉０．０５）     

牛超排技术的研究

用４组药物组合：（１）ＰＭＳＧ＋ＰＧＦ２ａ；（２）ＰＭＳＧ＋ＰＧＦ２ａ＋激光照射；（３）ＦＳＨ＋ＰＧＦ２ａ；（４）ＦＳＨ＋Ｃｔｏｐｒｏｓｔｅｎｏｌ，超排处理３２２头次供体牛。共采卵１６６３枚（头均５．８１±４．６８），可用胚胎９８０枚（头均３．４３±３．９４，占５８．９％）。（３）、（４）两组胚胎可用率及可用胚胎数高于（１）、（２）组（ｐ＜０．０５）；黄牛胚胎可用率高于奶牛（ｐ＜０．０１）；育成牛胚胎可用率高于经产牛（ｐ＜０．０１）；供体牛前两次超排效果更好（ｐ＜０．０５）。     

绒山羊超数排卵和胚胎冷冻技术的初步研究

为了建立适合于绒山羊的超数排卵方法和胚胎冷冻程序，为开发绒山羊胚胎移植技术奠定物质基础，使用两种ＦＳＨ制剂（宁波生物制剂厂生产的ＦＳＨ和中科院动物所生产的ＦＳＨ）对３７只供体羊进行了超排处理，每种制剂使用两种不同剂量。超排结果如下：每组供体平均排卵数分别为９．５０±４．４４（１３８ＩＵ），１２．４０±５．１８（１５０ＩＵ）和８．１４±３．９８（２．４ｍｇ），１１．２９±１．８７（２．７ｍｇ）。每组可用胚胎数分别为７．５０±４．２１（１３８ＩＵ），７．８０±１．３２（１５０ＩＵ），４．２９±３．５４（２．４ｍｇ），５．５９±４．５４（２．７ｍｇ）。宁波产ＦＳＨ对绒山羊的超排效果好于中科院产ＦＳＨ。共冷冻１０７枚胚胎，其中孵化囊胚３１枚、紧缩桑椹胚至扩张囊胚期胚胎７６枚。解冻６３枚胚胎进行了移植，包括１８枚孵化囊胚和４５枚有透明带的胚胎。解冻胚胎的存活率分别为３３．３％（孵化囊胚）和８４．４４％（其它胚胎）。移植妊娠率分别为５０．００％（孵化囊胚）和５９．２６％（其它胚胎）。这说明绒山羊胚胎移植技术是一项具有较大经济潜力的实用技术，通过对各个技术环节进一步改进，可以进行产业化开发。     

不同激素剂量对幼鼠超数排卵及超排卵质量的影响

应用国产激素制剂对３～８周龄昆明种小白鼠进行了超数排卵处理,重点观察了不同激素剂量对幼龄小鼠的超排效果及超排卵质量的影响。实验结果表明,以ＰＭＳＧ与ｈＣＧ各１０ＩＵ剂量超排３～８周龄小鼠,５周龄小鼠的超排效果（平均获卵８３．８±１０．２个）极显著（Ｐ＜０．０１）好于４～８周龄小鼠的超排效果（平均获卵３９．２～４９．８个）,而３周龄小鼠超排卵受精后体外培养的卵裂率（９７．１％）、桑椹胚率（８６．８％）和囊胚率（６５．１％）与４～８周龄超排卵的（分别为８５．５％～１００．０％、９４．９％～１００．０％和６３．２％～８７．７％）相近;以ＰＭＳＧ与ｈＣＧ各５ＩＵ剂量超排３～５周龄小鼠,３周龄小鼠的超排效果（平均获卵５９．０±６．５个）显著（Ｐ＜０．０５）好于４周龄小鼠的超排效果（平均获卵３１．４±４．９个）,并极显著（Ｐ＜０．０１）好于５周龄小鼠的超排效果（平均获卵２１．４±３．３个）;以ＰＭＳＧ与ｈＣＧ各１５ＩＵ剂量超排３～５周龄小鼠,３周龄小鼠的超排效果（平均获卵４８．６±７．３个）显著（Ｐ＜０．０５）好于５周龄小鼠的超排效果（平均获卵２５．２±５．８个）,也好于４周龄小鼠的超排效果（平均获卵４０．２±５．１个     

不同的FSH制剂对肉牛超排效果比较

本文 的ＦＳＨ制剂对４个品种的２５头肉种进行超排处理。比较了超数排卵效果,结果显示：第１组用中科产ＦＳＨ对１３头供体牛超排处理后平均黄体数为５．７７±２．５２枚：共采集胚胎５２枚,平均获４±２．５８枚胚胎,第２组用加拿大产ＦＳＨ对１２头供占奶排处理后平均黄体数为９．４１±４．４４枚。共采集胚胎１００枚,平均获得８．３３±５．６１枚胚胎。第２组实验结果明显好一第１组实验结果。     

草鱼→鲤的细胞核移植

用草鱼的头肾组织细胞核、草鱼的头肾细胞核与鲤鱼成熟去核卵之杂种胚胎细胞核、草鱼的囊胚细胞核,分别与鲤鱼的去核卵细胞质配合进行核移植操作.结果,体细胞核移植,在亚科间的组合——草鱼核 鲤质中获得原肠期胚胎,得率为1%;体细胞继代核移植,在草鱼核 鲤质中获得胚孔封闭期胚胎,得率为5%;胚胎细胞核移植,在草鱼核 鲤质中获得眼球色素出现期胚胎,得率为2%.草鱼→鲤核-质杂种胚胎的胎盘形状、大小与鲤鱼的相似,而大于草鱼;胚盘细胞数量也多于草鱼胚胎同期胚盘,而类似于鲤鱼同期胚盘.     

影响玻璃化冷冻兔胚胎效果的一些因素

试验对影响玻璃化冷冻兔胚胎效果的一些因素进行探讨，以找出理想的玻璃化冷冻方法。在测试的５种玻璃化溶液中，含３５％乙二醇（ＥＧ）和１．０ｍｏｌ／Ｌ蔗糖的溶液（ＶＳ１）对胚胎的毒性最小。用ＶＳ１冷冻桑椹胚和囊胚的理想程序是：在室温下使胚胎分别在２０％ＥＧ和３５％ＥＧ中平衡２、３分钟后，移入ＶＳ１中，０．５分钟内（囊胚也可在２分钟后）投入液氮中冷冻。桑椹胚的存活率为９１．７％（３３／３６），囊胚的存活率为９７．１％（３３／３４）～９７．３％（３６／３７）。８～１６细胞胚胎的理想冷冻程序为：在室温下使胚胎在２０％ＥＧ、３５％ＥＧ中平衡２、３分钟，移入４℃的３７％ＥＧ＋１．０ｍｏｌ／Ｌ蔗糖溶液中平衡２分或１０分钟后冷冻，胚胎存活率分别为１００％（３７／３７）、８６．１％（３１／３６）。